A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجميع واستخدام منصة شبه آلية قائمة على الموائع الدقيقة لزراعة وتحفيز مجموعات صغيرة من الخلايا واستعادة محللات الخلايا للتحليلات الجزيئية. يتم تحقيق ذلك من خلال إنشاء مزارع الخلايا المجهرية أولا في الشعيرات الدموية الدقيقة المطلية بالفيبرونيكتين والتي يشار إليها باسم غرف نضح الخلايا. تتمثل الخطوة الثانية في توصيل غرف التروية بوحدة الموائع الدقيقة الرقمية أو DMF ، والتي توفر وسيلة مرنة يتم من خلالها توجيه الكواشف من وإلى مزارع الخلايا الدقيقة.

بعد ذلك ، توفر وحدة DMF الحافز الذي يهم غرف التروية ويتم احتضان الخلايا بالمنبه لفترة محددة مسبقا من التعرض. أخيرا ، يتم تحلل الخلايا بالوسائل الكيميائية ويتم استرداد المحللات على وحدة DMF للتحليل الجزيئي. ثم يتم تحليل المحللات المستردة باستخدام R-T-P-C-R الكمي من أجل توصيف استجابة النسخ لمجموعة الخلايا للمحفز.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق زراعة الخلايا التقليدية ، من الممكن باستخدام هذه التقنية إجراء دراسات تحفيز الخلايا باستخدام كميات صغيرة من الخلايا ، وكذلك استخدام كميات صغيرة من الكواشف. أظهر بحثنا أن التعامل الدقيق للمنصة مع الخلايا والكاشف على نطاق صغير يقلل من التجربة إلى التباين. المنصة متعددة الاستخدامات أيضا.

يمكن لوحدة التدفق الصغير الرقمية توجيه الخلايا والكواشف من وإلى غرف التروية بمرونة كبيرة بحيث يمكن تخصيص التجارب وإعادة تكوينها بسرعة وسهولة. للبدء ، قم بإعداد محلول معقم من 50 ميكروغرام لكل مليلتر من الفبرونيكتين واستخدم مضخة حقنة متعددة المنافذ لسحب 30 ميكرولترا من المحلول في كل شعيرات دموية صغيرة لتسريع طلاء الأسطح الداخلية الشعرية الدقيقة. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين ، ثم اسحب محلول الفبرونيكتين وتخلص منه واترك الشعيرات الدموية الدقيقة تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات.

بعد ذلك ، قم بتوصيل الشعيرات الدموية الدقيقة المطلية بالألياف nin أو غرف التروية بأنابيب البولي كربونات والأنابيب بمضخة الحقنة باستخدام تركيبات الرأس. يستخدم الإعداد الموضح هنا مضخة حقنة لمنفذ المساعدة تدعم ست غرف للنضح. باستخدام شريط لاصق ، قم بتأمين جسم كل غرفة نضح على كتلة حرارية واضبط درجة حرارة كتل الحرارة على 37 درجة مئوية.

ثم اغمر الأطراف المفتوحة لغرف التروية في خزان يحتوي على خلايا ، معلقة في نمو جديد ، متوسطة مشتتة بالتساوي بتركيز 1 مليون خلية لكل مليلتر. اطلب من مضخة الحقنة سحب 10 ميكرولترات من تعليق الخلية إلى كل غرفة نضح. ثم قم بإزالة الأطراف المفتوحة لغرف التروية من تعليق الخلية واطلب من مضخة الحقنة سحب كمية كافية من الهواء لنقل سدادات السائل إلى الأقسام المثبتة في الكتلة الحرارية.

اسمح للخلايا بالالتصاق بالأسطح الداخلية المطلية بالفبرونيكتين لغرف التروية عن طريق احتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى ساعتين. في غضون ذلك ، انقل الأطراف المفتوحة لغرف التروية إلى خزان جديد يحتوي على وسط نمو جديد. بعد فترة الالتصاق ، اطلب من مضخة الحقنة إرسال المقابس السائلة إلى النفايات ثم سحب 10 ميكرولتر من الوسط الطازج إلى كل غرفة وفرة ، متبوعا بهواء كاف لوضع الوسط الطازج فوق الخلايا الملتصقة.

استمر في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، وتبادل الوسط كل ساعتين حتى يتم توازن الثقافات وتتوسيعها بشكل كاف. رسم. اللوحة السفلية لوحدة DMF مع 46 قطبا كهربائيا من أكسيد القصدير الإنديوم. باستخدام تقنيات التصوير الضوئي القياسية ، قم بتغطية اللوحة السفلية لوحدة DMF بخمسة ميكرون من Lene C عبر ترسيب البخار الكيميائي ، ثم قم بتدوير الطبقة ب 50 نانومتر من Teflon af.

طبقة الدوران التالية والركيزة الزجاجية المصنوعة من أكسيد القصدير الإنديوم غير المنقوشة مع 50 نانومتر من التفلون AF لاستخدامها كلوحة علوية. استخدم إطارات ضغط معدنية لتثبيت الألواح في قالب بوليمر مع تجاويف تحافظ على تباعد 400 ميكرون بين الألواح. يحدد هذا التباعد جنبا إلى جنب مع حجم قطب التشغيل البالغ 2.5 ملم مربع حجم القطرة على أنه 2.5 ميكرولتر لكل قطب.

ثم أدخل الشعيرات الدموية الدقيقة المطلية بالتفلون في الفراغ بين ألواح DMF. وضع كل منها بحيث يمتد إلى حافة قطب التشغيل المماثل إلى الطرف المقابل لكل عملية نقل. الشعيرات الدموية الدقيقة تلصق تركيب رأس.

بعد ذلك ، قم بتعطيم الموصلات الكهربائية لتزويد أقطاب أكسيد الإنديوم 10 بجهد. يتم أتمتة تسلسل تنشيط القطب الكهربائي من خلال استخدام واجهة إلكترونية يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر تقوم بتشغيل برامج نصية محددة مسبقا. ثم املأ وحدات DMF الموجودة على متن الخزانات بالكواشف المناسبة لتحفيز الخلايا وغسلها وتحللها.

في بعض الحالات ، من الأفضل تحميل الحافز نفسه في خطوة لاحقة قبل استخدامه مباشرة من الخزانات المحملة على متن الطائرة ، وتوزيع القطرات الصغيرة على وحدة DMF. اختبار وتشغيل القطرات الدقيقة ، بما في ذلك نقلها بين وحدة DMF والشعيرات الدموية الدقيقة للنقل. بليس. أولا ، قم بإعداد الحافز في وسط جديد مع 0.1٪ Onic F1 27 بتركيز نهائي قدره 100 ميكروغرام لكل مليلتر.

ثم قم بتحميل 80 إلى 100 ميكرولتر من الحافز في الخزان المخصص على متن الطائرة. بعد ذلك ، قم بإزالة الأطراف المفتوحة لغرف التروية من الخزان المتوسط وأدخلها في تركيبات الرأس الملصقة على نهايات الشعيرات الدموية الدقيقة للنقل ثم اطلب من مضخة الحقنة إرسال المقابس السائلة داخل غرف التروية إلى حاوية النفايات. بعد ذلك ، قم بتوجيه وحدة DMF لتوليد 10 قطرات ميكرولتر من التحفيز وتوصيلها إلى غرف التروية عبر الشعيرات الدموية الدقيقة للنقل.

احتضان الخلايا بالحافز عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة إلى أربع ساعات إذا لزم الأمر. تبادل التحفيز الجديد على فترات منتظمة بعد فترة التحفيز. اطلب من مضخة الحقنة إرسال الحافز إلى حاوية النفايات وتوجيه وحدة DMF لتوصيل قطرة 10 ميكرولتر من عازلة الغسيل إلى كل غرفة نضح.

احتضان الخلايا مع مخزن الغسيل المؤقت لمدة خمس دقائق. ثم استبدل مخزن الغسيل ب 10 ميكرولتر من محلول التحلل واحتضانه لمدة خمس دقائق إضافية. بعد ذلك ، اطلب من مضخة الحقنة إرسال كل محللة خلية إلى وحدة DMF.

قم بإزالة اللوحة العلوية لوحدة DMF مع الحرص على عدم إمالة اللوحة جانبا لأن ذلك قد يؤدي إلى تلوث متبادل بين القطرات. أخيرا ، اجمع المحللات من وحدة DMF المفتوحة باستخدام رجل ماصة لتحليل خارج المنصة ، مثل التعبير الجيني ، والتنميط عبر R-T-P-C-R الكمي لإعداد المنصة للتجربة التالية. أولا ، اغمر الشعيرات الدموية الدقيقة للنقل ، وتركيبات CAPITE ، وألواح وحدة DMF في مبيض بنسبة 10٪ لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، ويتم شطف ألواح وحدة DMF بالأيزوبروبانول متبوعا بالماء منزوع الأيونات وتجفيفها باستخدام غاز النيتروجين ، ثم الخبز على حرارة 160 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

أدت طرق البذر الموضحة في هذا البروتوكول إلى الالتزام بحوالي 500 ميرين من البلاعم لكل غرفة نضح. بعد احتضان الخلايا بوسط نمو عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ، تضاعف حجم السكان إلى ما يقرب من 1000 خلية لكل غرفة تروية. تظهر هنا نتائج التحليل الكمي R-T-P-C-R لأربعة جينات معروفة بأنها تلعب أدوارا مهمة في الاستجابات المناعية الفطرية للبكتيريا.

نمت البلاعم إما في المزارع التقليدية أو المجهرية وتم تحفيزها بجزيئات الإشريكية القولونية الحيوية لمدة ساعة أو أربع ساعات. تشير الأشرطة الزرقاء إلى متوسط زيادة الطية في التعبير الجيني عند تحفيز الخلايا المزروعة تقليديا ، بينما تشير الأشرطة الحمراء إلى التعبير المستحث في الخلايا المزروعة والمحفزة. في الثقافات الدقيقة ، تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية بين التكرارات البيولوجية من ثلاث تجارب مستقلة.

كانت نتائج التنميط الجيني متشابهة جدا ، على الرغم من أن الثقافات التقليدية استخدمت 96 لوحة بئر بها ما يقرب من 50،000 خلية لكل بئر ، في حين أن الثقافات الدقيقة استخدمت الشعيرات الدموية الدقيقة مع ما يقرب من 1000 خلية لكل تجربة غرفة التروية لتجربة التباين كانت قابلة للمقارنة على الأقل وغالبا ما يتم تقليلها في الثقافات الدقيقة كما يتضح من أشرطة الخطأ الأقصر التي تعمل على المقياس الدقيق. تقليل استهلاك الخلايا بمقدار خمسة أضعاف وتقليل استهلاك الكواشف بمقدار ثلاثة إلى 50 ضعفا. بالنسبة للتجارب التقليدية.

يمكن استخدام هذه الطريقة للاستزراع ، تقريبا أي نوع من خلايا الالتصاق ، في بعض الحالات باستخدام مكون مصفوفة مختلف خارج الخلية أو نمو. يمكن أن تكون أنواع الخلايا المتوسطة غير الملتصقة صعبة ، لكن استراتيجيات ربط الخلايا أظهرت نجاحها في سياقات مماثلة. يدعم النهج الموصوف هنا الاستزراع المجهري لمدة تصل إلى 24 ساعة.

تتضمن المنصة جميع الوظائف للقيام بثقافة طويلة الأجل أيضا ، ولكن يجب تطوير بروتوكول مرور الخلية. يمكن دمج وحدات إضافية في شبل الموائع الدقيقة الرقمية من خلال التوصيلات الشعرية الدقيقة. بهذه الطريقة ، يعمل DMF كمحور مركزي لتوصيل الوحدات الطرفية لتنفيذ مهام سير العمل المعقدة.

لقد ركزنا بشكل أساسي على توصيف استجابات النسخ المضيف للعوامل المعدية ، ولكن النظام الأساسي مصمم ليكون متعدد الاستخدامات للغاية ، وبالتالي يجب أن يدعم مجموعة متنوعة من تطبيقات البحث.