A منصة الآلي تنوعا للتجارب تحفيز الخلية الصغيرة الحجم

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجميع واستخدام منصة قائمة على الموائع الدقيقة شبه المؤتمتة لاستزراع وتحفيز مجموعات صغيرة من الخلايا واستعادة نواتج تحلل الخلايا لإجراء تحليلات جزيئية. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال إنشاء مستنبتات خلوية بمقياس ميكروي في شعيرات دقيقة مغلفة بالفيبرونكتين تُسمى غرف تروية الخلايا. وتتمثل الخطوة الثانية في توصيل غرف التروية بوحدة موائع دقيقة رقمية (DMF)، والتي توفر وسيلة مرنة يتم من خلالها توجيه الكواشف من وإلى المستنبتات الخلوية ذات المقياس الميكروي.

بعد ذلك، تقوم وحدة DMF بإيصال المثير المطلوب إلى غرف التروية، وتُحضن الخلايا مع المثير لفترة تعرض محددة مسبقًا. وأخيرًا، يتم تحلل الخلايا بوسائل كيميائية وتُسترجع النواتج المتحللة على وحدة DMF لإجراء التحليل الجزيئي. ثم يتم تحليل النواتج المتحللة المسترجعة باستخدام quantitative R-T-P-C-R من أجل توصيف الاستجابة النسخية للمجتمع الخلوي تجاه المثير.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بطرق زراعة الخلايا التقليدية في إمكانية إجراء دراسات تحفيز الخلايا باستخدام كميات صغيرة من الخلايا، وكذلك كميات صغيرة من الكواشف. وقد أظهرت أبحاثنا أن التعامل الدقيق للمنصة مع الخلايا والكواشف على المقياس الميكروي يقلل من التباين بين التجارب. كما تتميز هذه المنصة بمرونة عالية في الاستخدام.

يمكن لوحدة التدفق الدقيق الرقمي توجيه الخلايا والكواشف من وإلى غرف التروية بمرونة عالية، بحيث يمكن تخصيص التجارب وإعادة تكوينها بسرعة وسهولة. للبدء، قم بتحضير محلول معقم من fibronectin بتركيز 50 µg/mL، واستخدم مضخة حقن متعددة المنافذ لسحب 30 µL من المحلول إلى كل شعيرة دقيقة لتسريع عملية طلاء الأسطح الداخلية للشعيرة الدقيقة. تُحضن في درجة حرارة 37 °C لمدة ساعتين، ثم يتم سحب محلول fibronectin والتخلص منه، وتُترك الشعيرات الدقيقة لتجف في درجة حرارة الغرفة لمدة ست ساعات.

بعد ذلك، قم بتوصيل الشعيرات الدقيقة المغلفة بـ fiber nin أو غرف التروية بأنابيب البوليكربونات، ثم قم بتوصيل الأنابيب بمضخة المحقنة باستخدام وصلات capite. يستخدم الإعداد الموضح هنا مضخة محقنة aid port تدعم ست غرف تروية. وباستخدام شريط لاصق، قم بتثبيت جسم كل غرفة تروية بكتلة تسخين، واضبط درجة حرارة كتل التسخين على 37 °C.

بعد ذلك، اغمر النهايات المفتوحة لغرف التروية في خزان يحتوي على خلايا معلقة في وسط نمو جديد موزعة بالتساوي بتركيز 1 مليون خلية لكل مليلتر. وجه مضخة الحقنة لسحب 10 µL من معلق الخلايا إلى كل غرفة تروية. ثم أخرج النهايات المفتوحة لغرف التروية من معلق الخلايا ووجه مضخة الحقنة لسحب كمية كافية من الهواء لتحريك السدادات السائلة إلى الأقسام المثبتة في الكتلة الحرارية.

اترك الخلايا تلتصق بالأسطح الداخلية لغرف التروية المغطاة بالفبرونكتين عن طريق تحضينها عند 37 °C لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. وفي هذه الأثناء، انقل النهايات المفتوحة لغرف التروية إلى خزان جديد يحتوي على وسط نمو طازج. وبعد فترة الالتصاق، قم بضبط مضخة الحقنة للتخلص من السدادات السائلة، ثم اسحب 10 µL من الوسط الطازج إلى كل غرفة تروية، يتبع ذلك كمية كافية من الهواء لوضع الوسط الطازج فوق الخلايا الملتصقة.

استمر في تحضين الخلايا عند 37 درجة مئوية، مع تغيير الوسط كل ساعتين حتى يتم موازنة المزارع وتوسيعها بشكل كافٍ. النمط. اللوحة السفلية لوحدة DMF التي تحتوي على 46 قطباً كهربائياً من أكسيد القصدير المندليوم. باستخدام تقنيات الطباعة الضوئية القياسية، قم بطلاء اللوحة السفلية لوحدة DMF بطبقة بسمك 5 ميكرون من Lene C عبر ترسيب البخار الكيميائي، ثم قم بالطلاء الدوراني بطبقة بسمك 50 نانومتر من Teflon af.

بعد ذلك، قم بطلاء ركيزة زجاجية من أكسيد indium tin oxide غير منقوشة بطريقة الطلاء الدوراني بطبقة تبلغ 50 nanometers من Teflon AF لاستخدامها كلوح علوي. استخدم إطارات ضغط معدنية لتثبيت الألواح في قالب بوليمري يحتوي على تجاويف تحافظ على مسافة فاصلة تبلغ 400 micron بين الألواح. تحدد هذه المسافة، مقترنة بحجم قطب التشغيل الذي يبلغ 2.5 millimeters squared، حجم القطرة بـ 2.5 microliters لكل قطب.

بعد ذلك، أدخل الشعيرات المجهرية للنقل المغلفة بالتفلون في الفراغ الموجود بين ألواح مصفوفة الموائع الدقيقة (DMF). يتم وضع كل شعيرة بحيث تمتد من حافة قطب التشغيل المقابل لها إلى الطرف المقابل لكل عملية نقل. قم بتثبيت وصلة ربط في رأس كل شعيرة مجهرية.

بعد ذلك، قم بتوصيل الموصلات الكهربائية لتزويد أقطاب أكسيد الإنديوم 10 بالجهد الكهربائي. وتتم تسلسلات تنشيط الأقطاب بشكل آلي من خلال واجهة إلكترونية يتم التحكم فيها بواسطة الكمبيوتر والتي تقوم بتشغيل نصوص برمجية محددة مسبقاً. ثم املأ الخزانات الموجودة على متن وحدات DMF بالكواشف المناسبة لتحفيز الخلايا وغسلها وتحللها.

في بعض الحالات، يفضل تحميل المحفز نفسه في خطوة لاحقة قبل استخدامه مباشرة من الخزانات المدمجة المحملة، ثم توزيع قطيرات دقيقة على وحدة DMF. يتم اختبار تفعيل القطيرات الدقيقة، بما في ذلك نقلها بين وحدة DMF والشعيرات الدقيقة للنقل. أولاً، قم بتحضير المحفز في وسط طازج يحتوي على 0.1%onic F1 27 بتركيز نهائي قدره 100 micrograms per milliliter.

بعد ذلك، قم بتحميل 80 إلى 100 µL من المحفز في الخزان المخصص له على اللوحة. ثم، قم بإزالة النهايات المفتوحة لغرف التروية من خزان الوسط وأدخلها في وصلات capite المثبتة في نهايات الشعيرات الدقيقة للنقل، ثم وجه مضخة السرنجة لإرسال السدادات السائلة الموجودة داخل غرف التروية إلى حاوية النفايات. بعد ذلك، وجه وحدة DMF لتوليد قطرات من المحفز بحجم 10 µL وتوصيلها إلى غرف التروية عبر الشعيرات الدقيقة للنقل.

قم بتحضين الخلايا مع المحفز عند 37 درجة مئوية لمدة تتراوح من ساعة إلى أربع ساعات إذا لزم الأمر. استبدل المحفز بآخر جديد في فترات زمنية منتظمة بعد فترة التحفيز. وجه مضخة الحقن لإرسال المحفز إلى حاوية النفايات، ووجه وحدة DMF لإيصال قطرة بحجم 10 µL من محلول غسيل منظم إلى كل غرفة تروية.

قم بحضن الخلايا مع محلول الغسل لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، استبدل محلول الغسل بـ 10 µL من محلول التحلل واحضنها لمدة خمس دقائق إضافية. بعد ذلك، وجّه مضخة الحقنة لإرسال كل ناتج تحلل خلوي إلى وحدة DMF.

قم بإزالة اللوحة العلوية من وحدة DMF مع الحرص على عدم إمالة اللوحة جانبيًا، لأن ذلك قد يؤدي إلى حدوث تلوث خلطي بين القطيرات. وأخيرًا، اجمع المستخلصات من وحدة DMF المفتوحة باستخدام الماصة لإجراء تحليلات خارج المنصة، مثل التعبير الجيني، والتنميط عبر quantitative R-T-P-C-R، وذلك لتجهيز المنصة للتجربة التالية. أولاً، اغمر الشعيرات المجهرية للنقل، ووصلات CAPITE، وألواح وحدة DMF في محلول مبيض بتركيز 10% لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم تُشطف ألواح وحدة DMF باستخدام الإيزوبروبانول يليه الماء منزوع الأيونات وتُجفف باستخدام غاز النيتروجين، ومن ثم تُخبز عند درجة حرارة 160 °C لمدة 10 دقائق.

أدت طرق الاستزراع الموضحة في هذا البروتوكول إلى التصاق ما يقارب 500 من الماكروفاج المينري في كل حجرة تروية. وبعد تحضين الخلايا مع وسط نمو عند درجة حرارة 37 °C لمدة 16 ساعة، تضاعف حجم الجمهرة ليصل إلى حوالي 1000 خلية لكل حجرة تروية. تظهر هنا نتائج تحليل R-T-P-C-R الكمي لأربعة جينات معروفة بلعبها أدواراً هامة في الاستجابات المناعية الفطرية للبكتيريا.

تمت زراعة الخلايا البلعمية إما في مستنبتات تقليدية أو مستنبتات دقيقة النطاق، ثم حُفزت باستخدام جسيمات حيوية من بكتيريا e coli لمدة ساعة واحدة أو أربع ساعات. تشير الأعمدة الزرقاء إلى متوسط زيادة التعبير الجيني (fold increase) عند تحفيز الخلايا المستنبتة تقليدياً، بينما تشير الأعمدة الحمراء إلى التعبير المستحث في الخلايا التي نمت وحُفزت. وفي المستنبتات دقيقة النطاق، تشير أشرطة الخطأ إلى الانحرافات المعيارية بين المكررات البيولوجية من ثلاث تجارب مستقلة.

كانت نتائج تحليل التعبير الجيني متشابهة للغاية، على الرغم من أن المزارع التقليدية استخدمت أطباقاً ذات 96 بئراً تحتوي على ما يقرب من 50, 000 خلية لكل بئر، بينما استخدمت المزارع الدقيقة شعيرات دقيقة تحتوي على ما يقرب من 1000 خلية لكل تجربة في غرفة التروية؛ وكان التباين بين التجارب مماثلاً على الأقل، وغالباً ما كان أقل في المزارع الدقيقة كما يتضح من أشرطة الخطأ الأقصر عند العمل على المقياس الدقيق. كما انخفض استهلاك الخلايا بمقدار خمسة أضعاف، وانخفض استهلاك الكواشف من ثلاثة إلى 50 ضعفاً، وذلك مقارنة بالتجارب التقليدية.

يمكن استخدام هذه الطريقة لاستزراع أي نوع من الخلايا الملتصقة تقريبًا، وفي بعض الحالات باستخدام مكون مختلف من المادة الخلالية خارج الخلية أو وسط نمو مختلف. قد تكون أنواع الخلايا غير الملتصقة صعبة، ولكن أثبتت استراتيجيات ربط الخلايا نجاحها في سياقات مماثلة. يدعم النهج الموضح هنا الاستزراع على المقياس الميكروي لمدة تصل إلى 24 hour.

تتضمن المنصة كافة الوظائف اللازمة لإجراء عملية زراعة طويلة المدى أيضاً، ولكن يجب تطوير بروتوكول لتمرير الخلايا. ويمكن دمج وحدات إضافية في مكعب الموائع الدقيقة الرقمية من خلال الوصلات الشعرية الدقيقة. وبهذه الطريقة، يعمل نظام الموائع الدقيقة الرقمية (DMF) كمركز مركزي لتوصيل الوحدات الطرفية لتنفيذ سير عمل معقد.

لقد ركزنا بشكل أساسي على توصيف الاستجابات النسخية للعائل تجاه العوامل المعدية، ولكن تم تصميم المنصة لتكون متعددة الاستخدامات للغاية، لذا ينبغي أن تدعم مجموعة واسعة من التطبيقات البحثية.