التلاعب الجيني في

الهدف العام من هذا الإجراء هو استبدال الجينات بكفاءة وموثوقية باستخدام سلالات delta 2 80 من النوع الأول والنوع الثاني لـ Toxoplasma gondii. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق بناء جزيء DNA يستهدف الجين، حيث يتم دمج علامة الاختيار HX GPRT في الاتجاه الأمامي بين جوانب DNA مستهدفة للجين في الطرفين '5 و '3. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في نقل جزيء DNA المستهدف إلى سلالة toxoplasma DYI من النوع الأول أو النوع الثاني.

تتمثل الخطوة الثالثة في الانتقاء الصبور لأحداث إعادة التركيب المتجانس عبر العبور المزدوج وعزل المستعمرات الفردية. أما الخطوة النهائية فهي التحقق من حدوث استهداف الجينات في المستعمرات الطافرة المعزولة. وفي نهاية المطاف، يمكن لنتائج هذا الإجراء أن توضح وظيفة جينات الطفيليات من خلال تحليل تعطيل الجينات المستهدفة، واستبدال الجينات، وجينات الوسم عبر مجموعة متنوعة من التطبيقات اللاحقة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية التي تستخدم سلالات من النوع البري لهذا الطفيلي في أن خلفيات الطفيلي من النوع الأول والنوع الثاني delta two 80 تتيح الآن اختياراً موثوقاً للغاية لأحداث إعادة التركيب المتماثل ذات العبور المزدوج المستهدفة لإنتاج سلالات محددة وراثياً بدقة. ستعمل هذه التقنية على تسريع اكتشاف أهداف جديدة للعلاج الدوائي ببلازما مضادات السموم وتطوير سلالات لقاحات موهنة آمنة وفعالة، خاصة عند اقترانها بالموارد الجينومية المدروسة جيداً والمتاحة عبر الإنترنت على @toxodb.org. وبشكل عام، قد يواجه الأشخاص الجدد في هذه الطريقة صعوبة في هندسة جزيئات DNA المستهدفة أو التلاعبات الجينية باستخدام Toxoplasma Gandhi.

ومع ذلك، فإن ممارسة المرضى وتصميم جزيئات استهداف موثوقة سيضمنان النجاح. ابدأ البروتوكول بتضخيم الجوانب الجينومية المستهدفة من الطرف الخامس والطرف الثالث للجين المراد دراسته من الحمض النووي الجينومي باستخدام تقنية PCR. ثم قم بتضخيم العلامة الانتقائية HX GPRT مع جوانب DHFR من الطرف الخامس والطرف الثالث من كاسيت الجين المصغر HX GPRT CD NA باستخدام تقنية PCR.

استخدم إعادة التركيب في الخميرة أو طريقة مماثلة لدمج جزيئات 3D NA بتوجيهها الصحيح من الطرف 5' إلى الطرف 3' مع البلازميد PRS 416، وبذلك يتم توليد البلازميد p delta GOI الذي سيستهدف الحذف في الجين المراد دراسته. بعد ذلك، قم بتحضير عينة بحجم 100 µL تحتوي على 15 إلى 30 µg من بلازميد الاستهداف المخطّي (linearized) لعملية عفن (transfection) في T gia بعد مرور 68 إلى 72 ساعة من تلقيح دورق بحجم 25 cm يحتوي على خلايا HFF متلاحمة. تحقق من وجود الطفيليات التي تحللت حديثاً من خلال التأكد بصرياً من تحلل 90 إلى 95% من خلايا HFF؛ حيث تُعد الطفيليات الحية ضرورية لاستهداف الجينات.

قم بتحريك الطفيليات الحية لإذابتها في المحلول عن طريق رج القارورة المغلقة بقوة دون السماح بتناثر السائل على السطح الداخلي للغطاء أو عنق القارورة. قم بحصاد الطفيليات من القارورة وتجهيزها لعملية التحول (transfection) كما هو موضح في البروتوكول النصي. قم بإدخال بلازميد الاستهداف في سلالة toxoplasma من نوع delta CO 80 باستخدام التثقيب الكهربائي (Electroporation).

انقل الخليط الذي خضع للتثقيب الكهربائي إلى قارورة سعة 150 سنتيمتر تحتوي على خلايا HFF متلاصقة و30 ملليلتر من وسط العدوى (infection Medium). قم بتحضين المزرعة المصابة طوال الليل عند 37 درجة مئوية، أي بعد حوالي 20 ساعة من عملية عفن التحول (transfection). استبدل الوسط بوسط انتخاب MPA plus X.

اترك الطفيليات الآن لتحضن عند 37 درجة Celsius لمدة ثمانية أيام تقريبًا دون إزعاج. وبمجرد ظهور اللويحات (plaques)، رجّ القارورة لفصل الطفيليات خارج الخلوية عن الطبقة الأحادية لتوليد محلول طفيلي. انقل حوالي نصف ملليلتر من المحلول الطفيلي إلى قارورة جديدة سعتها 25 سنتيمتر تحتوي على خلايا HFF متلاصقة وفيها خمسة ملليلتر من وسط الاختيار MPA plus X.

قم بتسمية هذه المزرعة باسم PAs one A بعد ثلاثة أيام تقريباً. كرر عملية نقل نصف ملليلتر من محلول الطفيلي من القارورة الأصلية إلى قارورة أخرى من خلايا HFF باستخدام نفس وسط الانتخاب. قم بتسمية هذه المزرعة باسم PAs one B على مدار الأيام الخمسة التالية.

راقب الممر الأول A والممر الأول B لتحديد عدد الوحدات المكونة للبقع (pfu). اختر إما الممر الأول A أو الممر الأول B لإجراء الاستنساخ الفرعي بناءً على وجود عدد كافٍ من مناطق العدوى التي تزيد عن 25 منطقة. وكلما تسببت الطفيليات في تحلل خلايا HFF، يتم نقل المزرعة إلى دورق جديد سعة 25 سنتيمتر يحتوي على خلايا HFF متلاحمة مع استخدام وسط انتقائي. بعد ثلاثة أسابيع من عملية عفن التحول (transfection)، يتم استنساخ الطفيليات الملقحة حديثاً فرعياً عن طريق تخفيف الطفيليات إلى التركيز المناسب في وسط MPA plus X، وتوزيع محلول الطفيليات بالتساوي في صينية ذات 96 بئراً تحتوي على خلايا HFF متلاحمة.

قم بتجهيز طبق واحد بتركيز طفيلي واحد لكل بئر، وجهز طبقاً ثانياً بتركيز طفيليين لكل بئر. يتم تحضين كلا الطبقين عند 37 درجة Celsius بعد تاريخ عملية transfection الأصلية. لا تقم بإجراء عملية subclone للطفيليات قبل اليوم 20 بالنسبة للطفيليات من النوع الأول، أو اليوم 25 بالنسبة للطفيليات من النوع الثاني.

استمر في تمرير دورات المزرعة في دورق سعة 25 سنتيمتر بشكل أسبوعي كما هو موضح في النص المتاح عبر الإنترنت حتى يتم التحقق من سلالة التعطيل (knockout strain). بعد مرور أسبوع تقريبًا، قم بتقييم أطباق 96 بئرًا تحت تكبير يتراوح بين 40 إلى 60x. اختر فقط الآبار التي تحتوي على وحدة تشكيل لوحة (PFU) واحدة، والتي يتم تحديدها كمنطقة عدوى واحدة، باستخدام ماصة مضبوطة على 50 microliters.

امزج محتويات هذه الآبار عن طريق توجيه تدفق السائل فوق وحدات تكوين اللويحات (PFU) لتشتيت الطفيليات حول البئر. وبعد مرور أربعة إلى خمسة أيام من مزج الآبار المختارة، اختر اثني عشر مستنسخاً تحتوي على خلايا متحللة. انقل 12 مستنسخاً من صينية 96 بئراً إلى 12 بئراً في صينية 24 بئراً، ويتم ذلك عن طريق كشط قاع البئر بطرف الماصة وسحب 6 µL.

انقل المحلول إلى بئر في صينية ذات 24 بئراً تحتوي على خلايا HFF متوافقة في 1 mL من وسط MPA بالإضافة إلى X selection. قم بتحضين الصينية ذات الـ 24 بئراً عند 37 °C وراقب حدوث تحلل لخلايا HFF. قم بنقل الطفيليات من البئر المتحللة في الصينية ذات الـ 24 بئراً وفق جدول زمني أسبوعي.

استخدم تقنية الخدش والرسم لنقل 2 µL من محلول الطفيليات إلى طبق جديد يحتوي على MPA واختيار X. بعد عملية النقل، قم بحصاد الطفيليات من لوحة الـ 24 بئراً الأصلية وانقلها إلى أنابيب صغيرة لجمع الـ DNA.

في الختام، استخدم تقنية PCR للكشف عن حذف الجين المستهدف للتحقق من دمج الجناحين المستهدفين في النهايتين الخامسة والثالثة. وكذلك للتحقق من وجود علامة HX GPRT الانتقائية. هذا البروتوكول مخصص لإزالة علامة HX GPRT من سلالة delta Q 80 المعدلة، وهو موضح في النص المتاح عبر الإنترنت.

تستهدف P delta GOYC إزالة HX GPRT من الطفيلي عن طريق الانتخاب السلبي باستخدام ستة أوساط TX. ثم يُستخدم PCR للتأكيد على فقدان HX GPRT، حيث تظهر حزمة بحجم 1.2 Kilobase pair في الحالات التي لم يتم فيها إزالة HX GPRT من الموضع. وتوجد حزمة بحجم 3.4 kilobase pair.

يتم وصف الجزء الأخير من هذا البروتوكول، وهو وسم البروتينات من الطرف الكربوكسيلي (C terminal)، بالتفصيل في النص المتاح عبر الإنترنت؛ فبعد اتباع البروتوكول الموضح لإجراء حذف جيني مستهدف، استُخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتحقق من حذف الجين R 18 من النوع الأول، وهو موقع يصعب استهدافه بشكل عام. ويظهر تفاعل PCR 1 غياب ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بجين R 18.

يُظهر تفاعل PCR الثاني وجود الجانب الجيني المستهدف R 18 في الطرف '3، بينما يُظهر تفاعلا PCR الثالث والرابع وجود العلامة القابلة للاختيار مدمجة بشكل صحيح بين الجانبين الجينيين المستهدفين في الطرفين '5 و '3، وهو ما يحدد حذف R 18. ومن أجل إعادة استخدام العلامة القابلة للاختيار لإجراء عمليات حذف لاحقة في السلالة، يجب أولاً إزالة HX GPRT الأصلي من الموقع الجيني، وذلك بعد اتباع البروتوكول الموضح.

تمت إزالة HX GPRT من موقعي GRA two المحذوفين في السلالة delta two 80 delta GRA two HX. واستُخدم G-P-R-T-P-C-R لتأكيد فقدان HX GPRT والذي ظهر من خلال حزمة بحجم 1.2 KILOBASE. وعندما لم تتم إزالة H-X-G-P-R-T، ظهرت حزمة بحجم 3.4 kilobase بعد خطوة استهداف الجينات الأولية. ويمكن تطبيق طرق إضافية لاستهداف الجينات لإنشاء عمليات تعطيل جيني متعددة في نفس السلالة من النوع الأول أو النوع الثاني، أو لوسم أو استكمال سلالة طافرة للإجابة على أسئلة إضافية مثل: أين يتمركز هذا البروتين داخل الخلية؟

أو ما هو النطاق أو النشاط الرئيسي لهذا البروتين أو المسار الذي يفسر وظيفته البيولوجية؟ تمهد هذه التقنية الطريق للباحثين في هذا المجال لتكثيف استكشاف وظيفة جينات الطفيليات في معقد AP النموذجي وطفيلي toxoplasma. Gandhi eye.

لا تنسَ أن العمل مع toxoplasma يمكن أن يكون خطيراً، لذا يجب الالتزام بالاحتياطات مثل اتباع جميع إرشادات المستوى الثاني من السلامة البيولوجية (BSL 2) طوال فترة الإجراء.