التحول البكتيري: التثقيب الكهربائي
التحول البكتيري هو عملية تحدث بشكل طبيعي ، حيث تبتلع البكتيريا الحمض النووي الغريب ثم تضخيمه أو تستنسخه. في المختبر ، يمكن تحفيز هذه العملية بشكل مصطنع ، باستخدام نبضات المجال الكهربائي عالية الجهد لإنشاء مسام في غشاء الخلية البكتيرية ، والتي يمكن أن يمر من خلالها الحمض النووي البلازميد. يشير التثقيب الكهربائي إلى هذه الطريقة وسيوضح الفيديو التالي مبادئها وإجراءاتها خطوة بخطوة وتطبيقاتها.
قبل أن نتحدث عن التثقيب الكهربائي للبكتيريا ، من المهم فهم نوع الحمض النووي المستخدم في هذه التجارب: البلازميد. البلازميد عبارة عن قطعة صغيرة دائرية خارج الكروموسومات من الحمض النووي تعمل كناقل ، وناقل لتسلسل الحمض النووي المحدد الخاص بك.
سواء كان هذا التسلسل جينا لبروتين مضان في قنديل البحر أو إنزيم من النباتات ، يتم إدخاله في البلازميد عبر منطقة تسمى موقع الاستنساخ المتعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة يتم شقها بواسطة نوكليازات التقييد أو إنزيمات التقييد. يمكن استخدام نفس إنزيمات التقييد لقطع تسلسل اهتمامك بحيث تكون الأطراف مكملة للأطراف المقطوعة حديثا من البلازميد.
تحتويالبلازميدات أيضا على أصل النسخ المتماثل ، المختصر ORI ، والذي يشير إلى النقطة التي سيتم عندها تكراره. عندما يتعلق الأمر بالتحول ، فإن جين مقاومة المضادات الحيوية له أهمية حيوية. كما يوحي اسمه ، يسمح هذا الجين للبكتيريا بإنتاج إنزيم يحيد المضاد الحيوي ، مما يسمح لها بالبقاء على قيد الحياة في الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية.
يستخدم التثقيب الكهربائي جهازا متخصصا يسمى المثقور الكهربائي. عادة ما يتم وضع الخلايا في كوفيت التثقيب الكهربائي ، والذي يحتوي على أقطاب كهربائية على كل جانب تقوم بالاتصال الكهربائي بالماكينة بمجرد إدخالها.
يتم تحميل الخلايا البكتيرية الممزوجة بالحمض النووي في كوفيت التثقيب الكهربائي ويتم تطبيق مجال كهربائي بترتيب 1000 إلى 10,000 فولت لكل سنتيمتر لبضعة أجزاء من الثانية. يؤدي هذا إلى وصول الجهد عبر الغشاء إلى 0.5-1 فولت ، والذي يعتقد أنه يؤدي إلى إعادة ترتيب الطبقة الثنائية الفوسبوليبية التي تتكون من غشاء الخلية بحيث تتشكل المسام. في هذه الحالة ، يمر الحمض النووي البلازميدي عبر الغشاء وعندما يكتمل النبض ، ستصلح الطبقة الثنائية نفسها.
بعد تناول البلازميد ، يمكن أن تنمو البكتيريا بعد ذلك على ألواح أجار تحتوي على مضادات حيوية.
والآن بعد أن تعرفنا على البلازميدات وآلية التثقيب الكهربائي. دعونا نلقي نظرة على كيفية إجراء الإجراء.
يشار إلى الخلايا التي يمكن أن تمتص الحمض النووي بسهولة باسم الخلايا المختصة. النوع الأكثر شيوعا من البكتيريا المختصة التي يتم تحويلها في أبحاث البيولوجيا الجزيئية هو الإشريكية القولونية ، وهي البكتيريا بدائية النواة التي تصنع موطنها في الأمعاء السفلية. يشار إلى الإشريكية القولونية المعدة للتثقيب الكهربائي باسم الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية.
عند التعامل مع البكتيريا ، تأكد من نظافة منطقة العمل قدر الإمكان.
يتطلبالتعامل مع البكتيريا أيضا أن يمارس المرء تقنية معقمة. عادة ما يتضمن ذلك استخدام موقد بنسن لتعقيم الأدوات وإنشاء تيار حراري - مما يبقي الملوثات المحمولة جوا بعيدا عن مساحة العمل.
مباشرة قبل التثقيب الكهربائي ، قم بتسخين الوسائط مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة ، وإحضار ألواح أجار التي تحتوي على مضادات حيوية إلى 37 درجة مئوية ، وتبريد كوفيت التثقيب الكهربائي على الجليد.
بعد ذلك ، قم بإذابة الجليد المغسولة بالخلايا ذات الكفاءة الكهربائية على الجليد.
أضف 1-5 ميكرولتر من البلازميد البارد 1ng / μL الخالي من الملح إلى الخلايا البكتيرية ، واخلطه برفق ، وأضف الخليط إلى الكوفيت البارد. تأكد من عدم وجود فقاعات.
اضبط الجهد وشدة المجال للمثقب الكهربائي على الإعدادات الصحيحة لخلاياك. هنا ترى جهاز كهربائي يتم ضبطه على 1700 فولت وينتج عنه قوة مجال تبلغ 17 كيلو فولت / سم.
امسحي الجزء الخارجي من الكوفيت حتى يجفوا وضعيه في المثقب الكهربائي. نبض الخلايا حتى تسمع صوتا صفيرا.
يتسبب النبض غير الناجح في حدوث تفريغ كهربائي ، والذي يمكن ملاحظته كشرارة مرئية وفرقعة مسموعة. يمكن أن يكون هذا التفريغ ، الذي يشار إليه باسم الانحناء ، نتيجة لوجود الكثير من الملح في الخلايا المختصة أو الحمض النووي.
يمكن التنبؤ بنجاح التحول الخاص بك من خلال ملاحظة ثابت الوقت ، وهي المدة التي يستغرقها الجهد للتحلل بعد تطبيق النبضة. عندما يكون الملح موجودا ويكون محلول التثقيب الكهربائي موصلا للغاية ، يحدث التحلل بسرعة ، مما يتسبب في التفريغ ، وبالتالي قتل العديد من خلاياك. بالنسبة للبكتيريا ، تتراوح ثوابت الوقت الجيد من 5-10 مللي ثانية.
مباشرة بعد الخفق ، قم بإزالة الكوفيت وأضف 1 مل من الوسائط مباشرة إلى الخلايا. يتم وضع هذه الخلية التي تحتوي على وسائط في أنبوب وتحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، مع الاهتزاز ، حتى تتعافى الخلايا.
ثم ، باستخدام تقنية التعقيم ، أضف 20-200 ميكرولتر من الخلية إلى صفيحة أجار تحتوي على مضاد حيوي. اقلب الصفائح بحيث يكون الأجار في الأعلى وبالتالي لا يسقط التكثيف في خلاياك ويحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
يجب أن تشكل البكتيريا التي تحولت مع البلازميد مستعمرات. عد المستعمرات واحسب كفاءة التحويل ، وهي عدد المحولات الناجحة مقسوما على الكمية الإجمالية للحمض النووي المطلي.
يجب تحضير الأجار والوسائط ، التي توفر التغذية للبكتيريا ، مسبقا وتعقيمها عن طريق التعقيم. اترك الوسائط السائلة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام واترك الأجار يبرد إلى 50-55 درجة مئوية - درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وسكب الأطباق. ثم اترك الأطباق تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتتجمد.
نظرا لأن البكتيريا المستخدمة في التحويل يتم تخزينها في الفريزر ، فيجب أولا إذابتها على الجليد ، ونشرها على طبق أجار بدون مضادات حيوية ثم زراعتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
باستخدام تقنية التعقيم ، حدد مستعمرة بكتيرية من صفيحة أجار وقم بزراعتها في ثقافة أكبر بسعة 500 مل طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز.
أثناء نمو الخلايا ، قم بإعداد حوالي لتر من الماء منزوع الأيونات وتشكل 10٪ من الجلسرين والماء ، من الحجم إلى الحجم. قم بتعقيم المحاليل واتركها تبرد عند 4 درجات مئوية.
تستخدم قياسات الامتصاص لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في منتصف مرحلة النمو أم لا ، مما يعني أنها ستأخذ الحمض النووي بسهولة. بمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة ، ضعها على الجليد واحتفظ بها هناك طوال العملية.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا عن طريق فصلها في أنبوبين كبيرين للطرد المركزي وتدور عند 4 درجات مئوية ، واسكب المادة الطافية وأعد تعليقها في ماء بارد منزوع الأيونات 100 مل. كرر هذه الخطوة مرة أخرى على الأقل. الغرض من هذه الخطوة هو إزالة الملح ، مما سيؤثر بشدة على تقنية التثقيب الكهربائي.
قم بإجراء غسلتين إضافيتين في 50 مل من الجلسرين بنسبة 10٪ في الماء وأخيرا أعد تعليق البكتيريا في نفس المحلول.
أضف 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب Eppendorf متعددة. هذه الخلايا جاهزة الآن للاستخدام في التثقيب الكهربائي ويجب الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية. أو يمكن تجميدها وتخزينها بسرعة -80 درجة مئوية.
كما أنت على وشك أن ترى ، فإن التثقيب الكهربائي له العديد من التطبيقات.
بديل للتثقيب الكهربائي هو تحويل الصدمة الحرارية ، والذي يعتمد على تعرض البكتيريا لكل من كلوريد الكالسيوم والحرارة من أجل إدخال الحمض النووي في خلاياك.
بشكل عام ، تكون الصدمة الحرارية ألطف على البكتيريا من التثقيب الكهربائي ولا تتطلب ملحا منخفضا. يمكن استخدام تفاعلات الربط ، تلك التي تتضمن إدخال الجين المستهدف في البلازميد ، مباشرة في تحويل الصدمة الحرارية. يعد تحويل الصدمة الحرارية أرخص من التثقيب الكهربائي ولا يعتمد على معدات أو كوفيت باهظة الثمن. من ناحية أخرى ، تؤدي الصدمة الحرارية إلى انخفاض كفاءة التحويل من التثقيب الكهربائي وتستغرق وقتا أطول. كما أنه يقتصر على البروتوبلاست البكتيري والخميرة والنبات بينما يمكن تطبيق التثقيب الكهربائي على خلايا الثدييات.
هنا ترى الخلايا الليفية الجنينية للفأر يتم تحميلها في كوفيت التثقيب الكهربائي. بمجرد اكتمال التثقيب الكهربائي ، يمكن تحديد كفاءات التحويل من خلال مراقبة مدى إنتاج الخلايا لبروتين مضان أخضر مشفر بواسطة البلازميد. التعدي هو المصطلح الذي يطلق على تحول خلايا الثدييات ، والذي يتطلب عادة قوة مجال أقل من الخلايا البكتيرية وثوابت زمنية أعلى.
يمكن أيضا إجراء التثقيب الكهربائي في كاملة مثل جنين الدجاج النامي الذي رأيته هنا. يتم حقن الحمض النووي البلازميد في دماغ الفرخ ثم يتم استخدام مسبار التثقيب الكهربائي لتطبيق مجال كهربائي على أنسجة المخ. بعد يوم أو يومين ، يتم تصنيع البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء - المشفرة بواسطة البلازميد - بواسطة الخلايا العصبية ، ويمكن للعلماء ملاحظة التغيرات الهيكلية في دماغ الكتاكيت النامي.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE للتحول البكتيري عن طريق التثقيب الكهربائي. قدم هذا الفيديو البلازميد باعتباره أكثر أنواع الحمض النووي تحويلا ، وناقش الآلية الفيزيائية الحيوية التي يعتقد أنها تكمن وراء التثقيب الكهربائي ، وأظهر إجراء معمما لإجراء التثقيب الكهربائي ، ووصف كيف يمكن استخدام التثقيب الكهربائي في نظام الثدييات. شكرا للمشاهدة!
يشير مصطلح "التحول" إلى الابتلاع الخلوي للحمض النووي الأجنبي. في الطبيعة ، يمكن أن يحدث التحول في أنواع معينة من البكتيريا. ومع ذلك ، في البيولوجيا ال…
التحول البكتيري هو عملية تحدث بشكل طبيعي ، حيث تبتلع البكتيريا الحمض النووي الغريب ثم تضخيمه أو تستنسخه. في المختبر ، يمكن تحفيز هذه العملية بشكل مصطنع ، باستخدام نبضات المجال الكهربائي عالية الجهد لإنشاء مسام في غشاء الخلية البكتيرية ، والتي يمكن أن يمر من خلالها الحمض النووي البلازميد. يشير التثقيب الكهربائي إلى هذه الطريقة وسيوضح الفيديو التالي مبادئها وإجراءاتها خطوة بخطوة وتطبيقاتها.
قبل أن نتحدث عن التثقيب الكهربائي للبكتيريا ، من المهم فهم نوع الحمض النووي المستخدم في هذه التجارب: البلازميد. البلازميد عبارة عن قطعة صغيرة دائرية خارج الكروموسومات من الحمض النووي تعمل كناقل ، وناقل لتسلسل الحمض النووي المحدد الخاص بك.
سواء كان هذا التسلسل جينا لبروتين مضان في قنديل البحر أو إنزيم من النباتات ، يتم إدخاله في البلازميد عبر منطقة تسمى موقع الاستنساخ المتعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة يتم شقها بواسطة نوكليازات التقييد أو إنزيمات التقييد. يمكن استخدام نفس إنزيمات التقييد لقطع تسلسل اهتمامك بحيث تكون الأطراف مكملة للأطراف المقطوعة حديثا من البلازميد.
تحتويالبلازميدات أيضا على أصل النسخ المتماثل ، المختصر ORI ، والذي يشير إلى النقطة التي سيتم عندها تكراره. عندما يتعلق الأمر بالتحول ، فإن جين مقاومة المضادات الحيوية له أهمية حيوية. كما يوحي اسمه ، يسمح هذا الجين للبكتيريا بإنتاج إنزيم يحيد المضاد الحيوي ، مما يسمح لها بالبقاء على قيد الحياة في الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية.
يستخدم التثقيب الكهربائي جهازا متخصصا يسمى المثقور الكهربائي. عادة ما يتم وضع الخلايا في كوفيت التثقيب الكهربائي ، والذي يحتوي على أقطاب كهربائية على كل جانب تقوم بالاتصال الكهربائي بالماكينة بمجرد إدخالها.
يتم تحميل الخلايا البكتيرية الممزوجة بالحمض النووي في كوفيت التثقيب الكهربائي ويتم تطبيق مجال كهربائي بترتيب 1000 إلى 10,000 فولت لكل سنتيمتر لبضعة أجزاء من الثانية. يؤدي هذا إلى وصول الجهد عبر الغشاء إلى 0.5-1 فولت ، والذي يعتقد أنه يؤدي إلى إعادة ترتيب الطبقة الثنائية الفوسبوليبية التي تتكون من غشاء الخلية بحيث تتشكل المسام. في هذه الحالة ، يمر الحمض النووي البلازميدي عبر الغشاء وعندما يكتمل النبض ، ستصلح الطبقة الثنائية نفسها.
بعد تناول البلازميد ، يمكن أن تنمو البكتيريا بعد ذلك على ألواح أجار تحتوي على مضادات حيوية.
والآن بعد أن تعرفنا على البلازميدات وآلية التثقيب الكهربائي. دعونا نلقي نظرة على كيفية إجراء الإجراء.
يشار إلى الخلايا التي يمكن أن تمتص الحمض النووي بسهولة باسم الخلايا المختصة. النوع الأكثر شيوعا من البكتيريا المختصة التي يتم تحويلها في أبحاث البيولوجيا الجزيئية هو الإشريكية القولونية ، وهي البكتيريا بدائية النواة التي تصنع موطنها في الأمعاء السفلية. يشار إلى الإشريكية القولونية المعدة للتثقيب الكهربائي باسم الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية.
عند التعامل مع البكتيريا ، تأكد من نظافة منطقة العمل قدر الإمكان.
يتطلبالتعامل مع البكتيريا أيضا أن يمارس المرء تقنية معقمة. عادة ما يتضمن ذلك استخدام موقد بنسن لتعقيم الأدوات وإنشاء تيار حراري - مما يبقي الملوثات المحمولة جوا بعيدا عن مساحة العمل.
مباشرة قبل التثقيب الكهربائي ، قم بتسخين الوسائط مسبقا إلى درجة حرارة الغرفة ، وإحضار ألواح أجار التي تحتوي على مضادات حيوية إلى 37 درجة مئوية ، وتبريد كوفيت التثقيب الكهربائي على الجليد.
بعد ذلك ، قم بإذابة الجليد المغسولة بالخلايا ذات الكفاءة الكهربائية على الجليد.
أضف 1-5 ميكرولتر من البلازميد البارد 1ng / μL الخالي من الملح إلى الخلايا البكتيرية ، واخلطه برفق ، وأضف الخليط إلى الكوفيت البارد. تأكد من عدم وجود فقاعات.
اضبط الجهد وشدة المجال للمثقب الكهربائي على الإعدادات الصحيحة لخلاياك. هنا ترى جهاز كهربائي يتم ضبطه على 1700 فولت وينتج عنه قوة مجال تبلغ 17 كيلو فولت / سم.
امسحي الجزء الخارجي من الكوفيت حتى يجفوا وضعيه في المثقب الكهربائي. نبض الخلايا حتى تسمع صوتا صفيرا.
يتسبب النبض غير الناجح في حدوث تفريغ كهربائي ، والذي يمكن ملاحظته كشرارة مرئية وفرقعة مسموعة. يمكن أن يكون هذا التفريغ ، الذي يشار إليه باسم الانحناء ، نتيجة لوجود الكثير من الملح في الخلايا المختصة أو الحمض النووي.
يمكن التنبؤ بنجاح التحول الخاص بك من خلال ملاحظة ثابت الوقت ، وهي المدة التي يستغرقها الجهد للتحلل بعد تطبيق النبضة. عندما يكون الملح موجودا ويكون محلول التثقيب الكهربائي موصلا للغاية ، يحدث التحلل بسرعة ، مما يتسبب في التفريغ ، وبالتالي قتل العديد من خلاياك. بالنسبة للبكتيريا ، تتراوح ثوابت الوقت الجيد من 5-10 مللي ثانية.
مباشرة بعد الخفق ، قم بإزالة الكوفيت وأضف 1 مل من الوسائط مباشرة إلى الخلايا. يتم وضع هذه الخلية التي تحتوي على وسائط في أنبوب وتحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ، مع الاهتزاز ، حتى تتعافى الخلايا.
ثم ، باستخدام تقنية التعقيم ، أضف 20-200 ميكرولتر من الخلية إلى صفيحة أجار تحتوي على مضاد حيوي. اقلب الصفائح بحيث يكون الأجار في الأعلى وبالتالي لا يسقط التكثيف في خلاياك ويحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
يجب أن تشكل البكتيريا التي تحولت مع البلازميد مستعمرات. عد المستعمرات واحسب كفاءة التحويل ، وهي عدد المحولات الناجحة مقسوما على الكمية الإجمالية للحمض النووي المطلي.
يجب تحضير الأجار والوسائط ، التي توفر التغذية للبكتيريا ، مسبقا وتعقيمها عن طريق التعقيم. اترك الوسائط السائلة لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام واترك الأجار يبرد إلى 50-55 درجة مئوية - درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وسكب الأطباق. ثم اترك الأطباق تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتتجمد.
نظرا لأن البكتيريا المستخدمة في التحويل يتم تخزينها في الفريزر ، فيجب أولا إذابتها على الجليد ، ونشرها على طبق أجار بدون مضادات حيوية ثم زراعتها طوال الليل عند 37 درجة مئوية.
باستخدام تقنية التعقيم ، حدد مستعمرة بكتيرية من صفيحة أجار وقم بزراعتها في ثقافة أكبر بسعة 500 مل طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز.
أثناء نمو الخلايا ، قم بإعداد حوالي لتر من الماء منزوع الأيونات وتشكل 10٪ من الجلسرين والماء ، من الحجم إلى الحجم. قم بتعقيم المحاليل واتركها تبرد عند 4 درجات مئوية.
تستخدم قياسات الامتصاص لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في منتصف مرحلة النمو أم لا ، مما يعني أنها ستأخذ الحمض النووي بسهولة. بمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة ، ضعها على الجليد واحتفظ بها هناك طوال العملية.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا عن طريق فصلها في أنبوبين كبيرين للطرد المركزي وتدور عند 4 درجات مئوية ، واسكب المادة الطافية وأعد تعليقها في ماء بارد منزوع الأيونات 100 مل. كرر هذه الخطوة مرة أخرى على الأقل. الغرض من هذه الخطوة هو إزالة الملح ، مما سيؤثر بشدة على تقنية التثقيب الكهربائي.
قم بإجراء غسلتين إضافيتين في 50 مل من الجلسرين بنسبة 10٪ في الماء وأخيرا أعد تعليق البكتيريا في نفس المحلول.
أضف 50 ميكرولتر من الخلايا إلى أنابيب Eppendorf متعددة. هذه الخلايا جاهزة الآن للاستخدام في التثقيب الكهربائي ويجب الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية. أو يمكن تجميدها وتخزينها بسرعة -80 درجة مئوية.
كما أنت على وشك أن ترى ، فإن التثقيب الكهربائي له العديد من التطبيقات.
بديل للتثقيب الكهربائي هو تحويل الصدمة الحرارية ، والذي يعتمد على تعرض البكتيريا لكل من كلوريد الكالسيوم والحرارة من أجل إدخال الحمض النووي في خلاياك.
بشكل عام ، تكون الصدمة الحرارية ألطف على البكتيريا من التثقيب الكهربائي ولا تتطلب ملحا منخفضا. يمكن استخدام تفاعلات الربط ، تلك التي تتضمن إدخال الجين المستهدف في البلازميد ، مباشرة في تحويل الصدمة الحرارية. يعد تحويل الصدمة الحرارية أرخص من التثقيب الكهربائي ولا يعتمد على معدات أو كوفيت باهظة الثمن. من ناحية أخرى ، تؤدي الصدمة الحرارية إلى انخفاض كفاءة التحويل من التثقيب الكهربائي وتستغرق وقتا أطول. كما أنه يقتصر على البروتوبلاست البكتيري والخميرة والنبات بينما يمكن تطبيق التثقيب الكهربائي على خلايا الثدييات.
هنا ترى الخلايا الليفية الجنينية للفأر يتم تحميلها في كوفيت التثقيب الكهربائي. بمجرد اكتمال التثقيب الكهربائي ، يمكن تحديد كفاءات التحويل من خلال مراقبة مدى إنتاج الخلايا لبروتين مضان أخضر مشفر بواسطة البلازميد. التعدي هو المصطلح الذي يطلق على تحول خلايا الثدييات ، والذي يتطلب عادة قوة مجال أقل من الخلايا البكتيرية وثوابت زمنية أعلى.
يمكن أيضا إجراء التثقيب الكهربائي في كاملة مثل جنين الدجاج النامي الذي رأيته هنا. يتم حقن الحمض النووي البلازميد في دماغ الفرخ ثم يتم استخدام مسبار التثقيب الكهربائي لتطبيق مجال كهربائي على أنسجة المخ. بعد يوم أو يومين ، يتم تصنيع البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء - المشفرة بواسطة البلازميد - بواسطة الخلايا العصبية ، ويمكن للعلماء ملاحظة التغيرات الهيكلية في دماغ الكتاكيت النامي.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE للتحول البكتيري عن طريق التثقيب الكهربائي. قدم هذا الفيديو البلازميد باعتباره أكثر أنواع الحمض النووي تحويلا ، وناقش الآلية الفيزيائية الحيوية التي يعتقد أنها تكمن وراء التثقيب الكهربائي ، وأظهر إجراء معمما لإجراء التثقيب الكهربائي ، ووصف كيف يمكن استخدام التثقيب الكهربائي في نظام الثدييات. شكرا للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
التحول البكتيري هو عملية تحدث بشكل طبيعي ، حيث تبتلع البكتيريا الحمض النووي الغريب ثم تضخيمه أو تستنسخه. في المختبر ، يمكن تحفيز هذه العملية بشكل مصطنع ، باستخدام نبضات المجال الكهربائي عالية الجهد لإنشاء مسام في غشاء الخلية البكتيرية ، والتي يمكن أن يمر من خلالها الحمض النووي البلازميد. يشير التثقيب الكهربائي إلى هذه الطريقة وسيوضح الفيديو التالي مبادئها وإجراءاتها خطوة بخطوة وتطبيقاتها.
قبل أن نتحدث عن التثقيب الكهربائي للبكتيريا ، من المهم فهم نوع الحمض النووي المستخدم في هذه التجارب: البلازميد. البلازميد عبارة عن قطعة صغيرة دائرية خارج الكروموسومات من الحمض النووي تعمل كناقل ، وناقل لتسلسل الحمض النووي المحدد الخاص بك.
سواء كان هذا التسلسل جينا لبروتين مضان في قنديل البحر أو إنزيم من النباتات ، يتم إدخاله في البلازميد عبر منطقة تسمى موقع الاستنساخ المتعدد أو MCS. تحتوي هذه المنطقة على تسلسلات محددة يتم شقها بواسطة نوكليازات التقييد أو إنزيمات التقييد. يمكن استخدام نفس إنزيمات التقييد لقطع تسلسل اهتمامك بحيث تكون الأطراف مكملة للأطراف المقطوعة حديثا من البلازميد.
تحتوي البلازميدات أيضا على أصل النسخ المتماثل ، المختصر ORI ، والذي يشير إلى النقطة التي سيتم عندها تكراره. عندما يتعلق الأمر بالتحول ، فإن جين مقاومة المضادات الحيوية له أهمية حيوية. كما يوحي اسمه ، يسمح هذا الجين للبكتيريا بإنتاج إنزيم يحيد المضاد الحيوي ، مما يسمح لها بالبقاء على قيد الحياة في الوسائط المحتوية على المضادات الحيوية.
يستخدم التثقيب الكهربائي جهازا متخصصا يسمى المثقور الكهربائي. عادة ما يتم وضع الخلايا في كوفيت التثقيب الكهربائي ، والذي يحتوي على أقطاب كهربائية على كل جانب تقوم بالاتصال الكهربائي بالماكينة بمجرد إدخالها.
يتم تحميل الخلايا البكتيرية الممزوجة بالحمض النووي في كوفيت التثقيب الكهربائي ويتم تطبيق مجال كهربائي بترتيب 1000 إلى 10,000 فولت لكل سنتيمتر لبضعة أجزاء من الثانية. يؤدي هذا إلى وصول الجهد عبر الغشاء إلى 0.5-1 فولت ، والذي يعتقد أنه يؤدي إلى إعادة ترتيب الطبقة الثنائية الفوسبوليبية التي تتكون من غشاء الخلية بحيث تتشكل المسام. في هذه الحالة ، يمر الحمض النووي البلازميدي عبر الغشاء وعندما يكتمل النبض ، ستصلح الطبقة الثنائية نفسها.
بعد تناول البلازميد ، يمكن أن تنمو البكتيريا بعد ذلك على ألواح أجار تحتوي على مضادات حيوية.
الآن بعد أن تعلمنا عن البلازميدات وآلية التثقيب الكهربائي. دعونا نلقي نظرة على كيفية إجراء الإجراء.
يشار إلى الخلايا التي يمكن أن تمتص الحمض النووي بسهولة باسم الخلايا المختصة. النوع الأكثر شيوعا من البكتيريا المختصة التي يتم تحويلها في أبحاث البيولوجيا الجزيئية هو الإشريكية القولونية ، وهي البكتيريا بدائية النواة التي تصنع موطنها في الأمعاء السفلية. يشار إلى الإشريكية القولونية المعدة للتثقيب الكهربائي باسم الخلايا ذات الكفاءة الكهربائية.
عند التعامل مع البكتيريا ، تأكد من نظافة منطقة العمل قدر الإمكان.
يتطلب التعامل مع البكتيريا أيضا أن يمارس المرء تقنية معقمة. عادة ما يتضمن هذا استخدام موقد بنسن لتعقيم الأدوات وإنشاء تيار حراري؟ مما يحافظ على الملوثات المحمولة جوا بعيدا عن مساحة العمل.
مباشرة قبل التثقيب الكهربائي ، قبل تسخين الوسائط إلى درجة حرارة الغرفة ، أحضر لوحات أجار التي تحتوي على مضاد حيوي إلى 37؟ C ، وتبرد كوفيت التثقيب الكهربائي على الجليد.
بعد ذلك ، قم بإذابة الجليد المغسولة بالخلايا ذات الكفاءة الكهربائية على الجليد.
أضف 1-5uL من 1ng /؟ ل بلازميد بارد خالي من الملح للخلايا البكتيرية ، يخلط برفق ويضاف الخليط إلى الكوفيت البارد. تأكد من عدم وجود فقاعات.
اضبط الجهد وشدة المجال للمثقب الكهربائي على الإعدادات الصحيحة لخلاياك. هنا ترى جهاز كهربائي يتم ضبطه على 1700 فولت وينتج عنه قوة مجال 17 كيلو فولت / سم.
امسح الجزء الخارجي من الكوفيت حتى يجف وضعه في المثقب الكهربائي. نبض الخلايا حتى تسمع صوتا صفيرا.
يتسبب النبض غير الناجح في حدوث تفريغ كهربائي ، والذي يمكن ملاحظته كشرارة مرئية وفرقعة مسموعة. يمكن أن يكون هذا التفريغ ، الذي يشار إليه باسم الانحناء ، نتيجة لوجود الكثير من الملح في الخلايا المختصة أو الحمض النووي.
يمكن التنبؤ بنجاح التحول الخاص بك من خلال ملاحظة ثابت الوقت ، وهي المدة التي يستغرقها الجهد للتحلل بعد تطبيق النبضة. عندما يكون الملح موجودا ويكون محلول التثقيب الكهربائي موصلا للغاية ، يحدث التحلل بسرعة ، مما يتسبب في التفريغ ، وبالتالي قتل العديد من خلاياك. بالنسبة للبكتيريا ، تتراوح ثوابت الوقت الجيد من 5-10 مللي ثانية.
مباشرة بعد الخفق ، قم بإزالة الكوفيت وأضف 1 مل من الوسائط مباشرة إلى الخلايا. يتم وضع هذه الخلية التي تحتوي على وسائط في أنبوب وتحضنها عند 37؟ C لمدة 1 ساعة ، مع الاهتزاز ، حتى تتعافى الخلايا.
ثم ، باستخدام تقنية التعقيم ، أضف 20-200 ميكرولتر من الخلية إلى صفيحة أجار تحتوي على مضاد حيوي. اقلب الصفائح بحيث يكون الأجار في الأعلى وبالتالي لا يسقط التكثيف في خلاياك ويحتضن بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
يجب أن تشكل البكتيريا المتحولة مع البلازميد مستعمرات. عد المستعمرات واحسب كفاءة التحويل ، وهي عدد المحولات الناجحة مقسوما على الكمية الإجمالية للحمض النووي المطلي.
يجب تحضير الأجار والوسائط ، التي توفر التغذية للبكتيريا ، مسبقا وتعقيمها عن طريق التعقيم. اترك الوسائط السائلة تبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام واترك الأجار يبرد إلى 50-55؟ C ? درجة الحرارة التي يمكن عندها إضافة المضاد الحيوي وسكب الأطباق. ثم اترك الأطباق تبرد إلى درجة حرارة الغرفة لتتجمد.
نظرا لأن البكتيريا المستخدمة في التحويل يتم تخزينها في الفريزر ، فيجب أولا إذابتها على الجليد ، ونشرها على طبق أجار بدون مضادات حيوية ثم زراعتها بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية.
باستخدام تقنية التعقيم ، اختر مستعمرة بكتيرية من صفيحة أجار وقم بزراعتها في ثقافة أكبر بسعة 500 مل بين عشية وضحاها في سن 37؟ ج في حاضنة اهتزاز.
أثناء نمو الخلايا ، قم بإعداد حوالي لتر من الماء منزوع الأيونات وتشكل 10٪ من الجلسرين والماء ، من الحجم إلى الحجم. قم بتعقيم المحاليل واتركها تبرد عند 4 درجة مئوية
تستخدم قياسات الامتصاص لتحديد ما إذا كانت البكتيريا في منتصف مرحلة نموها أم لا ، مما يعني أنها ستأخذ الحمض النووي بسهولة. بمجرد وصول الخلايا إلى هذه المرحلة ، ضعها على الجليد واحتفظ بها هناك طوال العملية.
بعد ذلك ، اغسل الخلايا عن طريق فصلها في أنبوبين كبيرين للطرد المركزي وتدور عند 4؟ ج ، صب المطفف وإعادة تعليقه في ماء بارد منزوع الأيونات 100 مل. كرر هذه الخطوة مرة أخرى على الأقل. الغرض من هذه الخطوة هو إزالة الملح ، مما سيؤثر بشدة على تقنية التثقيب الكهربائي.
قم بإجراء غسلتين إضافيتين في 50 مل من الجلسرين بنسبة 10٪ في الماء وأخيرا أعد تعليق البكتيريا في نفس المحلول.
أضف 50؟ L من الخلايا في أنابيب Eppendorf متعددة. هذه الخلايا جاهزة الآن للاستخدام في التثقيب الكهربائي ويجب الاحتفاظ بها عند 4 درجات مئوية. أو يمكن تجميدها وتخزينها في -80 درجة مئوية
كما أنت على وشك أن ترى ، فإن التثقيب الكهربائي له العديد من التطبيقات.
بديل للتثقيب الكهربائي هو تحويل الصدمة الحرارية ، والذي يعتمد على تعرض البكتيريا لكل من كلوريد الكالسيوم والحرارة من أجل إدخال الحمض النووي في خلاياك.
بشكل عام ، تكون الصدمة الحرارية ألطف على البكتيريا من التثقيب الكهربائي ولا تتطلب ملحا منخفضا. يمكن استخدام تفاعلات الربط ، تلك التي تتضمن إدخال الجين المستهدف في البلازميد ، مباشرة في تحويل الصدمة الحرارية. يعد تحويل الصدمة الحرارية أرخص من التثقيب الكهربائي ولا يعتمد على معدات أو كوفيت باهظة الثمن. من ناحية أخرى ، تؤدي الصدمة الحرارية إلى انخفاض كفاءة التحويل من التثقيب الكهربائي وتستغرق وقتا أطول. كما أنه يقتصر على البروتوبلاست البكتيري والخميرة والنبات بينما يمكن تطبيق التثقيب الكهربائي على خلايا الثدييات.
هنا ترى الخلايا الليفية الجنينية للفأر يتم تحميلها في كوفيت التثقيب الكهربائي. بمجرد اكتمال التثقيب الكهربائي ، يمكن تحديد كفاءات التحويل من خلال مراقبة مدى إنتاج الخلايا لبروتين مضان أخضر مشفر بواسطة البلازميد. التعدي هو المصطلح الذي يطلق على تحول خلايا الثدييات ، والذي يتطلب عادة قوة مجال أقل من الخلايا البكتيرية وثوابت زمنية أعلى.
يمكن أيضا إجراء التثقيب الكهربائي في كاملة مثل جنين الدجاج النامي الذي رأيته هنا. يتم حقن الحمض النووي البلازميد في دماغ الفرخ ثم يتم استخدام مسبار التثقيب الكهربائي لتطبيق مجال كهربائي على أنسجة المخ. بعد يوم أو يومين ، يتم تصنيع البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء - المشفرة بواسطة البلازميد - بواسطة الخلايا العصبية ، ويمكن للعلماء ملاحظة التغيرات الهيكلية في دماغ الكتاكيت النامي.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE للتحول البكتيري عن طريق التثقيب الكهربائي. قدم هذا الفيديو البلازميد باعتباره أكثر أنواع الحمض النووي تحويلا ، وناقش الآلية الفيزيائية الحيوية التي يعتقد أنها تكمن وراء التثقيب الكهربائي ، وأظهر إجراء معمما لإجراء التثقيب الكهربائي ، ووصف كيف يمكن استخدام التثقيب الكهربائي في نظام الثدييات. شكرا للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is a plasmid and why is it used in bacterial transformation?
A plasmid is a small, circular, extrachromosomal piece of DNA that acts as a vector to carry your specific DNA sequence into bacterial cells. It contains a multiple cloning site where restriction enzymes insert your target gene, an origin of replication for DNA copying, and an antibiotic resistance gene that allows transformed bacteria to survive on antibiotic-containing media.
Q2: How does electroporation create pores in bacterial cell membranes?
Electroporation applies a high-voltage electric field of 1,000 to 10,000 volts per centimeter for milliseconds, causing the voltage across the membrane to reach 0.5-1 volts. This rearranges the phospholipid bilayer, creating temporary pores through which plasmid DNA passes. Once pulsing stops, the bilayer repairs itself, trapping the DNA inside the cell.
Q3: What are electrocompetent cells and how are they prepared?
Electrocompetent cells are bacteria prepared to readily take up DNA during electroporation. E. coli cells are grown to mid-log phase, then washed multiple times in deionized water and 10% glycerol solution to remove salt. Salt removal is critical because high salt content causes arcing, an electrical discharge that kills cells and indicates transformation failure.
Q4: Why is the time constant important in predicting electroporation success?
The time constant measures how quickly voltage decays after the electric pulse is applied. Good time constants for bacteria range from 5-10 milliseconds. Rapid decay indicates high salt concentration, causing arcing and cell death. Monitoring the time constant helps predict whether your transformation will succeed before observing colony growth.
Q5: How does electroporation compare to heat shock transformation?
Heat shock transformation uses calcium chloride and heat exposure instead of electrical pulses, making it gentler on bacteria and cheaper than electroporation. However, heat shock produces lower transformation efficiencies, takes longer, and works only on bacteria, yeast, and plant protoplasts. Electroporation achieves higher efficiency and applies to mammalian cells through a process called transfection.
Q6: What steps follow electroporation to identify successfully transformed bacteria?
After pulsing, add recovery media to cells and incubate at 37°C for one hour with shaking. Plate cells on antibiotic-containing agar and incubate overnight at 37°C. Only bacteria that successfully took up the plasmid survive the antibiotic. Count resulting colonies and calculate transformation efficiency by dividing successful transformants by total DNA plated.
Q7: What are the applications of electroporation beyond bacterial transformation?
Electroporation applies to mammalian cells through transfection, using lower field strengths and higher time constants than bacterial cells. Scientists also use electroporation in whole organisms like developing chicken embryos by injecting plasmid DNA into brain tissue and applying an electric field. This allows observation of fluorescent protein expression and structural changes in developing neural tissue.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:47
The Plasmid
2:17
Electroporation Basic Principles
3:26
Electroporating Bacteria
7:07
Preparing Electrocompetent Cells
9:36
Applications
11:43
Summary