سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج مستشعرات نانوية مستجيبة للـ pH وسقالات ذاتية الإبلاغ يمكن مراقبتها في الوقت الفعلي وفي الموقع (in situ) من أجل المساعدة في فهم الظروف التي تؤثر على النمو الخلوي. ويتم تحقيق ذلك أولاً من خلال تحضير مستشعرات نانوية متوافقة حيوياً ومستجيبة للمادة المراد تحليلها، والتي يمكنها مراقبة الـ pH من خلال مخرجات الفلورة. وكخطوة ثانية، يتم دمج المستشعرات النانوية المستجيبة للـ pH في سقالات بوليمرية مغزولة كهربائياً لتشكيل بيئة ثلاثية الأبعاد (3D) يمكن من خلالها استنبات الخلايا ومراقبتها.

بعد ذلك، يتم تثبيت الخلايا الثديية على السقالات المغزلية كهربائياً، كما يتم إيصال المستشعرات النانوية إلى بيئتها داخل الخلوية لمراقبة pH داخل الخلايا. وخلال التجربة، تم الحصول على نتائج تظهر قدرة المستشعرات النانوية داخل الخلوية والسقالات ذاتية الإبلاغ على مراقبة pH ضمن بيئات هندسة الأنسجة، وذلك بناءً على نسب الفلورية التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر البؤري. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استخدام مجسات pH الإلكترونية، في إمكانية إجراء القياسات في الموقع وفي الوقت الفعلي دون الحاجة إلى تعطيل النمو الخلوي.

للبدء، قم بتحضير الفلوروفورات عن طريق إذابة 1.5 milligrams من fam SE في واحد milliliter من dimethylformamide المعروف بـ DMF في دورق مستدير القاعدة. قم أيضاً بإذابة 1.5 milligrams من Tamara SE في واحد milliliter من DMF في دورق ثانٍ. ثم أضف 1.5 milliliters من three amino propyl triethyl إلى كل دورق وقم بالتقليب المستمر في الظلام تحت جو من النيتروجين الجاف عند 21 °C لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك، أضف 250 µL من كلا محلولي الصبغة إلى خليط يحتوي على 6 mL من الإيثانول و 4 mL من هيدروكسيد الأمونيوم في دورق مستدير القاعدة. قلّب هذا الخليط الجديد عند درجة حرارة 21 °C لمدة ساعة واحدة. أضف ببطء 0.5 mL من رباعي إيثيل أورثو سيليكات إلى الخليط، واستمر في تقليبه لمدة ساعتين إضافيتين.

خلال هذا الوقت، يُتوقع أن يتحول المزيج إلى شكل عكر، ثم يتم تجميع المستشعرات النانوية بواسطة التبخير الدوار وتخزينها في قارورة زجاجية عند درجة حرارة 4 °C لاستخدامها مستقبلاً. بعد ذلك، تُضاف المستشعرات النانوية للأس الهيدروجيني المجففة بتركيز 5 mg/mL في محاليل سورينسون المنظمة من الفوسفات، بتدرج يبدأ من pH 5.5 إلى pH 7.5 بزيادات قدرها pH 0.5. يتم إعادة تعليق المستشعرات النانوية عن طريق رج العينات بجهاز vortex لمدة 3 دقائق، ثم تعريضها للموجات فوق الصوتية لمدة 5 دقائق أو حتى يصبح المحلول عكراً.

اجمع بيانات المعايرة عن طريق قياس العينات عند طول موجي للإثارة يبلغ 488 nanometers لـ FAM و 568 nanometers لـ Tamara. وبالنسبة لـ Tamara، اجمع الانبعاثات من 500 إلى 530 nanometers لـ FAM ومن 558 إلى 580 nanometers لـ Tamara، واحسب نسبة القيم القصوى للانبعاث الناتجة عند كل قيمة pH. ثم جهز العينة للتصوير بالمجهر الإلكتروني الماسح SEM عن طريق وضع عينة من المستشعرات النانوية على حامل مجهر إلكتروني مغطى بالكربون، وطلاء الجسيمات بالذهب عن طريق الرش لمدة خمس دقائق تحت جو من argon.

بمجرد الانتهاء من الطلاء، ضع العينات في المجهر الإلكتروني وقم بضبط مسافة العمل، والجهد، والتكبير لتقليل الشحن الإلكتروني وإنتاج أفضل الصور داخل خزانة استخلاص الأدخنة. قم بتحضير محلول PLGA بنسبة 20% في ثنائي كلورو ميثان مع 1% perineum formate. قم بتعبئة المحلول في حقنة سعة 10 milliliter باستخدام إبرة تعبئة غير مدببة مقاس 18 gauge وثبتها بإحكام على مضخة حقن.

سيتم استخدام هذا المحلول لصنع سبيكات PLGA ضابطة؛ حيث يتم وضع طرف الإبرة على مسافة 20 centimeters بعيداً عن لوحة تجميع من الألومنيوم مقاس 20 by 15 centimeter، مع توصيل قطب مصدر جهد عالٍ بطرف الحقنة وتأريض السلك بلوحة التجميع الألومنيومية. بعد ذلك، يتم تشغيل مصدر الطاقة وضبط الجهد على 12 kilovolts. ثم يتم تشغيل مضخة الحقنة وضخ المحلول بمعدل تدفق ثابت قدره 3.5 milliliters per hour لمدة ساعتين.

سينتج عن ذلك عمق للسقالة يبلغ 60 ميكرون تقريبًا. بمجرد الانتهاء، أوقف تشغيل الجهاز واترك السقالة في خزانة استخلاص الغازات لمدة 24 ساعة للسماح للمذيب المتبقي بالتبخر. لتحضير سقالات مدمجة بمجسات نانوية مستجيبة للـ pH، قم بتحضير محلول PLGA كما سبق، ولكن أضف هذه المرة خمسة مليغرام لكل مليليتر من المجسات النانوية.

ثم قم بغزل الألياف كهربائياً للمادة المستجيبة للـ pH باستخدام نفس الإعدادات السابقة. بعد ذلك، قم بمعايرة استجابة السقالة للـ pH عن طريق وضع عينات صغيرة من السقالة المجففة التي تحتوي على المستشعرات النانوية المدمجة في أطباق زراعة بقطر 35 مليمتر، وغمرها في 2 مل من محاليل Sorensen الفوسفاتية المنظمة بقيم pH تتراوح بين 5.5 و 7.5 بزيادات قدرها 0.5 باستخدام مجهر بؤري (confocal microscope). استخدم ليزر أرغون بطول موجي 488 نانومتر لإثارة FAM، وليزر كريبتون بطول موجي 568 نانومتر لإثارة Tamara داخل المستشعرات النانوية.

راقب الانبعاث عند 500 إلى 530 نانومتر لـ FAM ومن 558 إلى 580 نانومتر لـ Tamara، ثم احسب نسبة القيم القصوى للانبعاث الناتجة عند كل قيمة pH. أولاً، قم بتعقيم أسطح السقالات باستخدام مصدر ضوء UV على مسافة ثمانية سنتيمترات لمدة 15 دقيقة لكل جانب. بعد ذلك، انقل السقالات بطريقة معقمة إلى طبق زراعة مكون من 12 بئراً، وضع حلقة فولاذية بقطر داخلي يبلغ سنتيمتر واحد وقطر خارجي يبلغ سنتيمترين فوق السقالة.

بعد ذلك، أضف PBS مع 5% pen strip إلى داخل وخارج الحلقة الفولاذية واحضن العينات طوال الليل. وفي اليوم التالي، قم بإزالة PBS مع 5% pen strep واغسل السقالات باستخدام PBS.

ثم أضف 500 µL من وسط زراعة الخلايا إلى داخل وخارج الحلقة الفولاذية، وقم بتدفئة الطبق مسبقاً في الحاضنة. بعد ذلك، قم بحصد الخلايا المطلوبة وتحضير معلق خلوي بتركيز 1 × 10⁶ خلية/mL. وعندما تصبح الخلايا جاهزة، قم بإزالة الوسط من البئر وأضف 1 mL من الوسط الطازج إلى خارج الحلقة الفولاذية.

بعد ذلك، أضف 300 µL من معلق الخلايا إلى داخل الحلقة الفولاذية وهز الطبق برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي. ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 °C مع 5%CO2، واترك الخلايا لتحتضن للمدة المطلوبة. مع تجديد الوسط الغذائي كل يومين إلى ثلاثة أيام، قم ببذر الخلايا على السقالات كما هو موضح في القسم السابق، واتركها تنمو دون انقطاع لمدة 72 ساعة.

بعد ذلك، اشطف الخلايا بمحلول PBS وأضف 500 µL من الوسط الخالي من المصل خارج الحلقة و300 µL داخل الحلقة. يتم تحضين الطبق لمدة ساعة واحدة عند 37 °C أثناء عملية التحضين. قم بتحضير المحلول A عن طريق إضافة 5 mg من المستشعرات النانوية إلى 50 µL من الـ optimum مع الرج لفترة وجيزة.

بعد ذلك، يتم تحضير المحلول B عن طريق إضافة 5 µL من lipectomy 2000 إلى 45 µL من Optum، ويُترك المزيج ليحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، يُضاف المحلول A إلى مزيج المحلول B، ثم يُحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتكوين المحلول C، وهو عبارة عن معقد ليبوزوم المستشعر النانوي. تُخرج اللوحة من الحاضنة ويُضاف 100 µL من محلول المعقد إلى داخل الحلقة الفولاذية.

بعد ذلك، أعد الطبق إلى الحاضنة وقم بتحضين الخلايا مع معقدات كاشف lipectomy لمدة ثلاث ساعات عقب التحضين. اسحب الوسط واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS دافئ قبل غمر السقالة التي تستقر عليها الخلايا في محاليل منظمة ذات قيم pH مختلفة لمراقبة استجابة المستشعرات النانوية. والآن، قم بتصوير الخلايا باستخدام المجهر البؤري الفلوري لتتبع موقع المستشعرات النانوية داخل الخلايا الثديية.

أولاً، يتم تحضير وتسليم المستشعرات النانوية المحتوية على fam فقط إلى الخلايا المستقرة على سقالات PLGA. ثم يُضاف 2 µL من Lyotracker red بتركيز 50 nM إلى 300 µL من الوسط الغذائي، وتُحضن الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 °C بعد فترة التحضين. يتم بعد ذلك إزالة الوسط الغذائي وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.

بعد ذلك، أضف إما 2 µL من PBS أو أي وسط زراعي آخر خالٍ من الفينول الأحمر لتغطية الخلايا أثناء التصوير المجهري البؤري. تالياً، أضف 5 µM من صبغة النواة drac five إلى PBS واحضنها مع الخلايا لمدة 3 دقائق عند 37 °C. وبعد مرور 3 دقائق، أخرج الطبق من الحاضنة وضعه على منصة المجهر البؤري للتصوير؛ قم بتصوير العضيات الحمضية والنواة في المستشعرات النانوية باستخدام أطوال موجية مختلفة للإثارة والانبعاث كما هو موضح في البروتوكول النصي المرفق، مع استخدام المسح المتسلسل لتجنب تجميع أطوال موجات الإثارة. تم توصيف توزيع الحجم للمستشعرات النانوية المستجيبة للـ pH والمحضرة باستخدام SEM، حيث تم قياس مجموعة المستشعرات النانوية المصورة ووجد أن أبعادها النانوية تتراوح بين 240 و 470 nm.

تظهر على اليسار صورة لألياف PLGA المغزولة كهربائياً، وعلى اليمين ألياف PLGA مغزولة كهربائياً مع مستشعرات نانوية. توفر الصور المجهرية الإلكترونية الماسحة (SEM) للألياف دليلاً على ارتباط المستشعرات النانوية بسطح الألياف. ومع ذلك، قد تكون هذه المستشعرات مدمجة أيضاً داخل ألياف السقالة.

بمجرد غزلها كهربائياً، تحتفظ المستشعرات النانوية بقدرتها على البقاء نشطة بصرياً وكيميائياً، وتظهر هنا مرتبطة بألياف السقالة. يظهر صبغ fam على اليسار باللون الأخضر، ويظهر صبغ Tamara على اليمين باللون الأحمر. وتنتج نسبة كثافة الفلورة منحنى معايرة كما هو موضح هنا.

أظهرت المستشعرات النانوية عند تقييمها بمفردها وعند دمجها في سدائل PLGA المغزولة كهربائيًا نتائج متطابقة، مما يثبت احتفاظ المستشعرات النانوية بنشاطها البصري بعد دمجها في السدائل. كما استجابت المستشعرات النانوية المدمجة بشكل عكسي وجيد لتغير قيم pH عند التبديل بين محلول منظم بدرجة pH تبلغ 5.5 و7.5. وقد استجاب معدل fam Tamra بشكل متوقع في كل مرة تم عرضها.

تظهر هنا صور مجهرية بؤرية (confocal) للخلايا الليفية التي تم إيصال المستشعرات النانوية إليها داخل الخلايا عبر كاشف ترانسفكشن. ويشير التموضع المشترك المنقط لصبغتي fam و Tamara إلى أن الصبغتين ظلتا محاصرتين داخل مصفوفة المستشعر النانوي. ويمكن تأكيد الإيصال داخل الخلايا للمستشعرات النانوية عن طريق قياس نسبة fam Tamara للخلايا الموضوعة في محاليل منظمة مختلفة.

كما تلاحظون هنا، تزداد النسبة عند قياس المستشعرات النانوية القائمة على السقالة، ولكنها تظل ثابتة عند قياس المستشعرات داخل الخلايا. بعد تطوير هذه التقنية، يمكن للباحثين في مجال هندسة الأنسجة استقصاء تغيرات pH داخل الخلايا في البيئة الدقيقة ضمن البنى الخلوية ثلاثية الأبعاد في الموقع وفي الوقت الفعلي، دون إزعاج التجربة الجارية.