سقالات الإبلاغ الذاتي للخلية ثقافة 3 الأبعاد

الهدف العام من التجربة التالية هو إنتاج أجهزة استشعار نانوية مستجيبة للأس الهيدروجيني وسقالات ذاتية الإبلاغ يمكن مراقبتها في الوقت الفعلي وفي الموقع من أجل المساعدة في فهم الظروف التي تؤثر على نمو الخلايا. يتم تحقيق ذلك من خلال إعداد أجهزة استشعار نانوية مستجيبة للتحليل المتوافق حيويا ، والتي يمكنها مراقبة الأس الهيدروجيني من خلال مخرجات الفلورة. كخطوة ثانية ، يتم دمج أجهزة الاستشعار النانوية المستجيبة للأس الهيدروجيني في سقالات بوليمرية كهربائية مغزولة تشكل بيئة ثلاثية الأبعاد يمكن من خلالها زراعة الخلايا ومراقبتها.

بعد ذلك ، تجلس خلايا الثدييات على السقالات الكهربائية المغزولة ويتم أيضا تسليم أجهزة الاستشعار النانوية إلى بيئتها داخل الخلايا من أجل مراقبة درجة الحموضة داخل الخلايا. أثناء التجريب ، يتم الحصول على نتائج تظهر قدرة أجهزة الاستشعار النانوية داخل الخلايا والسقالات ذاتية الإبلاغ على مراقبة الأس الهيدروجيني داخل البيئات الهندسية للأنسجة بناء على نسب التألق المكتسبة بواسطة الفحص المجهري متحد البؤر. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية ، مثل استخدام مجسات الأس الهيدروجيني الإلكترونية ، هي أنه يمكن إجراء القياسات في الموقع وفي الوقت الفعلي دون الحاجة إلى إزعاج النمو الخلوي.

للبدء ، قم بإعداد الفلوروفورات عن طريق إذابة 1.5 ملليغرام من fam SE إلى مليلتر واحد من ثنائي ميثيل فورماميد المعروف باسم DMF في قاع مستدير. تقوم القارورة أيضا بإذابة 1.5 ملليغرام من Tamara SE في ملليلتر واحد من DMF في قارورة ثانية. ثم أضف 1.5 مل من ثلاثة أمينو بروبيل ثلاثي إيثيل إلى كل قارورة وحركه باستمرار في الظلام تحت جو نيتروجين جاف عند 21 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد ذلك ، أضف 250 ميكرولترا من كل من محللي الصبغة إلى خليط يحتوي على ستة ملليلتر من الإيثانول وأربعة ملليلتر من هيدروكسيد الأمونيوم الموجود في قارورة قاعية مستديرة. قلب هذا الخليط الجديد على حرارة 21 درجة مئوية بعد ساعة واحدة. أضف ببطء 0.5 مل من سيليكات رباعي إيثيل أورثوس إلى الخليط ، واستمر في التقليب لمدة ساعتين أخريين.

خلال هذا الوقت ، توقع أن يتحول الخليط إلى غائم ، ثم اجمع المستشعرات النانوية عن طريق التبخر الدوار وقم بتخزينها في قارورة زجاجية عند أربع درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل. بعد ذلك ، أضف مستشعرات الأس الهيدروجيني المجففة بخمسة ملليغرام لكل مليلتر في مخازن الفوسفات الخاصة بسورنسون ، والتي تتراوح من الرقم الهيدروجيني 5.5 إلى الرقم الهيدروجيني 7.5 بزيادات الأس الهيدروجيني 0.5. قم بتعليق المستشعرات النانوية عن طريق دوامة العينات لمدة ثلاث دقائق ثم صوتنة لمدة خمس دقائق أو حتى يصبح المحلول غائما.

جمع بيانات المعايرة عن طريق قياس العينات بطول موجي إثارة يبلغ 488 نانومتر ل FAM و 568 نانومتر. بالنسبة لتمارا ، اجمع الانبعاثات عند 500 إلى 530 نانومتر ل FAM و 558 إلى 580 نانومتر لتمارا ، واحسب نسبة الحد الأقصى للانبعاث الناتج عند كل قيمة الأس الهيدروجيني. ثم قم بإعداد العينة لتصوير SEM عن طريق وضع عينة من أجهزة الاستشعار النانوية على مجهر إلكتروني مطلي بالكربون ، وكعب ورش طلاء الجسيمات بالذهب لمدة خمس دقائق تحت غلاف جوي للأرجون.

بمجرد الطلاء ، ضع العينات في المجهر الإلكتروني واضبط مسافة العمل والجهد والتكبير لتقليل شحن الإلكترون وإنتاج أفضل الصور في غطاء الدخان. اصنع محلول PLGA بنسبة 20٪ في ثنائي كلورو ميثان بفورمات 1٪ من العجان. قم بتحميل المحلول في حقنة سعة 10 مليلتر بإبرة تعبئة حادة عيار 18 وقم بتثبيتها بإحكام على مضخة حقنة.

سيتم استخدام هذا الحل لجعل سقالات التحكم PLGA تبعد طرف الإبرة 20 سم عن لوحة تجميع الألومنيوم 20 × 15 سم ، وإرفاق القطب الكهربائي لمصدر طاقة عالي الجهد بطرف المحقنة وطحن السلك بلوحة تجميع الألومنيوم. بعد ذلك ، قم بتشغيل مصدر الطاقة واضبط الجهد على 12 كيلو فولت. ثم قم بتشغيل مضخة الحقنة وقم بتوصيل المحلول باستخدام معدل تدفق ثابت يبلغ 3.5 مل في الساعة لمدة ساعتين.

سينتج عن ذلك عمق سقالة يبلغ حوالي 60 ميكرون. بمجرد الانتهاء ، قم بإيقاف تشغيل الجهاز واترك السقالة في غطاء الدخان لمدة 24 ساعة للسماح لبقايا المذيبات بالتبخر. لتحضير السقالات المدمجة مع أجهزة الاستشعار النانوية المستجيبة للأس الهيدروجيني ، قم بإعداد محلول PLGA كما كان من قبل ، ولكن هذه المرة أضف أيضا خمسة ملليغرامات لكل مليلتر من أجهزة الاستشعار النانوية.

ثم قم بتدوير الرقم الهيدروجيني الكهربائي باستخدام نفس الإعدادات كما كان من قبل. بعد ذلك ، قم بمعايرة استجابة الأس الهيدروجيني للسقالة عن طريق وضع عينات صغيرة من السقالة المجففة مع أجهزة استشعار نانوية مدمجة في ألواح استزراع 35 ملم وغمرها في ملليلترين من مخازن فوسفات سورنسن بين الأس الهيدروجيني 5.5 و 7.5 بزيادات قدرها 0.5 على مجهر متحد البؤر. استخدم ليزر الأرجون 488 نانومتر لإثارة FAM وليزر كريبتون 568 نانومتر لإثارة تمارا داخل أجهزة الاستشعار النانوية.

راقب الانبعاث عند 500 إلى 530 نانومتر ل FAM و 558 إلى 580 نانومتر لتمارا ، ثم احسب نسبة الحد الأقصى للانبعاث الناتج عند كل قيمة الأس الهيدروجيني. أولا ، قم بتعقيم أسطح السقالات بمصدر ضوء الأشعة فوق البنفسجية على مسافة ثمانية سنتيمترات لمدة 15 دقيقة على كل جانب. ثم انقل السقالات معقمة إلى صفيحة ثقافة 12 بئر وضع حلقة فولاذية بقطر داخلي يبلغ سنتيمترا واحدا وقطرها الخارجي سنتيمترين فوق السقالة.

بعد ذلك ، أضف PBS مع شريط قلم بنسبة 5٪ إلى داخل وخارج الحلقة الفولاذية واحتضان العينات طوال الليل. في اليوم التالي. قم بإزالة PBS باستخدام 5٪ من القلم واغسل السقالات باستخدام PBS.

ثم أضف 500 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى داخل وخارج الحلقة الفولاذية وقم بتسخين اللوحة مسبقا في حاضنة. بعد ذلك ، قم بحصاد الخلايا ذات الأهمية وقم بإعداد معلق خلية واحد في 10 إلى الخلايا الست لكل مليلتر. عندما تكون الخلايا جاهزة ، قم بإزالة الوسائط من البئر وأضف ملليلترا واحدا من الوسائط الجديدة إلى الجزء الخارجي من الحلقة الفولاذية.

ثم أضف 300 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى داخل الحلقة الفولاذية وهز اللوحة برفق لتوزيع الخلايا بالتساوي. ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 ، واحتضن الخلايا طالما كان ذلك مطلوبا. قم بتحديث الوسائط كل يومين إلى ثلاثة أيام بذر الخلايا على السقالات كما هو موضح في القسم السابق ، والسماح لها بالنمو دون انقطاع لمدة 72 ساعة.

ثم اشطف الخلايا باستخدام PBS وأضف 500 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل إلى الجزء الخارجي من الحلقة و 300 ميكرولتر داخل الحلقة. احتضان الطبق لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية أثناء الحضانة. قم بإعداد المحلول أ عن طريق إضافة خمسة ملليغرامات من أجهزة الاستشعار النانوية مع 50 ميكرولتر من الزنا الأمثل ولفترة وجيزة.

ثم خلط المحلول B عن طريق إضافة خمسة ميكرولترات من استئصال الدهون 2000 إلى 45 ميكرولتر من Optum ، واترك الخليط يحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، أضف المحلول A إلى مزيج المحلول B ثم احتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لتشكيل المحلول C ، وهو مركب الجسيمات الشحمية ذات المستشعر النانوي. قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وأضف 100 ميكرولتر من المحلول المركب إلى داخل الحلقة الفولاذية.

ثم ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة واحتضان الخلايا بمجمعات كاشف استئصال الدهون لمدة ثلاث ساعات بعد الحضانة. قم بشفط الوسائط وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS الدافئ قبل غمر سقالة الخلية في مخازن ذات درجات الحموضة المختلفة لمراقبة استجابة أجهزة الاستشعار النانوية. الآن داخل الخلايا ، قم بتصوير الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر الفلوري لتتبع موقع المستشعرات النانوية داخل خلايا الثدييات.

أولا ، قم بإعداد وتسليم العائلة التي تحتوي على أجهزة استشعار نانوية فقط للخلايا الموجودة على سقالات PLGA. ثم أضف ميكرولترين من 50 نانو مولار ليو متتبع أحمر إلى 300 ميكرولتر من الوسائط واحتضانها لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية بعد فترة الحضانة. قم بإزالة الوسائط وغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS.

ثم أضف إما ميكرولترين من PBS أو غيرها من الوسائط الخالية من الفينول الأحمر لتغطية الخلايا أثناء التصوير متحد البؤر. بعد ذلك ، أضف خمسة ميكرومولار من البقعة النووية ، وخمسة إلى PBS واحتضن الخلايا لمدة ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية. بعد ثلاث دقائق ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وضعها على المرحلة متحدة البؤر لتصوير الصورة ، والمستشعرات النانوية العضيات الحمضية والنواة باستخدام أطوال موجية مختلفة للإثارة والانبعاث كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب أثناء استخدام المسح المتسلسل لتجنب جمع الأطوال الموجية للإثارة ، تم تمييز توزيع حجم أجهزة الاستشعار النانوية المستجيبة لدرجة الحموضة المحضرة باستخدام SEM حيث تم قياس مجموعة أجهزة الاستشعار النانوية المصورة ووجد أنها لها أبعاد نانومتر في حدود 240 إلى 470 نانومتر.

تظهر على اليسار صورة لألياف PLGA المغزولة من الألكترود ، وعلى اليمين توجد ألياف PLGA مغزولة من الألكترود مع أجهزة استشعار نانوية. توفر الصور المجهرية SEM للألياف دليلا على ارتباط أجهزة الاستشعار النانوية على سطح الألياف. ومع ذلك ، يمكن دمجها أيضا في ألياف السقالة.

بمجرد تدوير الإلكتروبات ، تحتفظ المستشعرات النانوية بقدرتها على البقاء نشطة بصريا وكيميائيا وتظهر هنا مرتبطة بألياف السقالة. على اليسار توجد صبغة فام موضحة باللون الأخضر ، وعلى اليمين صبغة تمارا تظهر باللون الأحمر. تنتج نسبة شدة الفلورسنت منحنى معايرة كما هو موضح هنا.

تقييم المستشعرات النانوية بمفردها وعند دمجها في سقالات PLGA المغزولة في الألكتروبية ، تعكس بعضها البعض ، مما يدل على أن أجهزة الاستشعار النانوية تحتفظ بنشاطها البصري بعد دمجها في السقالات. تستجيب المستشعرات النانوية المدمجة أيضا بشكل عكسي لقيم الأس الهيدروجيني المتغيرة حيث تم تبديل المخزن المؤقت بين درجة الحموضة 5.5 و 7.5. استجابت نسبة طمرة العائلية كما هو متوقع في كل مرة يتم عرضها.

فيما يلي صور متحدة البؤر للخلايا الليفية التي تحتوي على مستشعرات نانوية يتم تسليمها داخل الخلايا عبر كاشف التعداد. يشير التحديد المترابط لأصباغ فام وتمارا إلى أن الأصباغ ظلت محاصرة في مصفوفة المستشعر النانوي. يمكن تأكيد التوصيل داخل الخلايا لأجهزة الاستشعار النانوية عن طريق قياس نسبة تمارا للخلايا الموضوعة في مخازن مختلفة.

كما ترون هنا ، تزداد النسبة عند قياس أجهزة الاستشعار النانوية القائمة على السقالة ، ولكنها تظل ثابتة عند قياس المستشعرات داخل الخلايا. بعد تطوير هذه التقنية ، يمكن للباحثين في مجال هندسة الأنسجة التحقيق في الموقع وفي الوقت الفعلي. يتغير الرقم الهيدروجيني البيئي داخل الخلايا داخل التركيبات الخلوية ثلاثية الأبعاد دون إزعاج التجربة الجارية.