طريقة المقايسة الامتصاصية المناعية للإنزيم المرتبط (ELISA)

تعد طريقة ELISA، أو المقايسة الامتصاصية المناعية المرتبطة بالإنزيم، طريقة شائعة الاستخدام لتحديد وجود أو غياب بروتين مستهدف معين.

من خلال سلسلة من خطوات الغسيل والربط، يقوم جسم مضاد مقترن، أو مرتبط، بإنزيم بالتعرف على البروتين المستهدف في قاع طبق يحتوي على 96 بئراً. وعند إضافة الركيزة إلى العينة، يحدث تفاعل إنزيمي يؤدي إلى تغير في اللون، مما يسمح بتحديد البروتين المستهدف وقياس كميته.

قبل أن نناقش كيفية إجراء تحليل ELISA، دعونا نتعرف على المعدات والكواشف التي ستحتاجون إليها.

تتم تفاعلات ELISA عادةً في طبق ذو قاع مسطح يحتوي على 96 بئراً. وتساعد القيعان المسطحة للآبار في تسهيل التوزيع المتساوي للعينة التجريبية، بالإضافة إلى الأجسام المضادة للاحتجاز والكشف.

يكشف تحليل ELISA عن وجود بروتينات مستهدفة محددة في المحاليل المائية التجريبية. وتعد عينات البول، وأوساط زراعة الخلايا، والمصل من العينات التجريبية الشائعة.

في تحليل ELISA، يكون الجسم المضاد الذي يرتبط مباشرة بالبروتين المستهدف هو الجسم المضاد الأولي. ويتميز هذا الجسم المضاد بتقارب عالٍ، أي قدرة عالية على الارتباط الوثيق بمحدد مستضدي (epitope) - وهو منطقة محددة - من البروتين المستهدف. وعادةً ما يكون الجسم المضاد الأولي غير مُعلم، أو غير مُقترن.

وكما ذكرنا، ترتبط الأجسام المضادة في الغالب ببروتيناتها المستهدفة من خلال الارتباط عالي التقارب بمحدد مستضدي محدد. ومع ذلك، قد تحتوي العينة التجريبية على أجزاء من الخلايا تعبر عن مواقع ارتباط غير نوعية، وهي مواقع يمكنها الارتباط بالمنطقة الثابتة، أو المنطقة غير النوعية للمحدد المستضدي، في الأجسام المضادة الكاشفة.

لذلك، يعد إضافة محلول منظم للحجب (blocking buffer) أمراً أساسياً في تحليل ELISA لتغطية أي مواقع ارتباط غير نوعية في عيناتكم التجريبية. وإلا فقد تحدث تفاعلات إنزيمية في الآبار التي لا تحتوي على البروتين المستهدف، مما يعطي نتائج إيجابية كاذبة!

أما الجسم المضاد الثانوي في تحليل ELISA فهو الجسم المضاد المستخدم للتعرف على الجسم المضاد الأولي. وعادةً ما يكون هذا الجسم المضاد مقترناً بإنزيم. وأحياناً يكون للجسم المضاد الثانوي تسمية غريبة؛ فعلى سبيل المثال، إذا كان الجسم المضاد الثانوي قد تم إنتاجه، أو استحثاثه، في حمار للتعرف على جسم مضاد أولي تم إنتاجه في ماعز، فإن الجسم المضاد الثانوي يسمى جسماً مضاداً من الحمار مضاداً للماعز (donkey anti-goat antibody). وعندما يتعلق الأمر بتسمية الأجسام المضادة الثانوية، يشير الاسم الأول إلى الكائن الذي أنتج الجسم المضاد الثانوي، ويمثل الاسم الثاني الكائن الذي أنتج الجسم المضاد الأولي.

ستكون هناك حاجة أيضاً إلى مادة ركيزة (substrate)، والتي ترتبط بالموقع النشط للإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي. ويؤدي التفاعل الكيميائي الذي يحدث خلال هذه العملية إلى تغيير لون الركيزة التي كانت عديمة اللون. ويسمح هذا الاختبار المسمى بالمقايسة اللونية (colorimetric assay) بتحديد وقياس كمية البروتين المستهدف الموجود.

سيستمر التفاعل الإنزيمي طالما كانت الركيزة متاحة. لذلك، بعد فترة تحضين قصيرة، يتم إضافة محلول إيقاف (stop solution) إلى الآبار، والذي يسبب تغييراً لونياً آخر للإشارة إلى أن التفاعل قد توقف بالفعل.

سيتم استخدام قارئ الأطباق الدقيقة (microplate reader) لقياس تركيز البروتين المطلوب في كل بئر عن طريق قراءة الامتصاصية، أي كمية المنتج الملون في كل بئر. وتتناسب الامتصاصية طردياً مع كمية البروتين المستهدف الموجود.

الآن وبعد أن جهزت جميع معداتك، فلنقم بإجراء مقايسة ELISA!

لإجراء مقايسة ELISA قياسية، أو مباشرة، قم أولاً بتغطية آبار اللوحة ذات الـ 96 بئراً بالبروتين المستهدف المراد دراسته والمخفف في محلول التغطية (coating buffer). قم بتوزيع عينات الضبط الموجبة والسالبة في هذا الوقت أيضاً.

بعد تحضين اللوحة المغطاة لفترة كافية لإعطاء البروتين وقتاً للامتزاز، أو الالتصاق، تماماً بقاع اللوحة، تخلص من محلول التغطية الزائد بنفضة سريعة من معصم اليد.

بعد ذلك، قم بحجب أي ارتباط غير محدد محتمل أو إشارة خلفية عن طريق تحضين كل بئر في محلول الحجب (blocking buffer).

الآن تخلص من محلول الحجب واغسل الآبار بتحضين قصير في درجة حرارة الغرفة باستخدام المحلول الملحي المنظم بالفوسفات، أو PBS، و1% BSA.

بينما يتم شطف الآبار باستخدام PBS، قم بتحضير تخفيفات من تركيز معروف للبروتين المستهدف لإنشاء منحنى قياسي. ستُستخدم الامتصاصية في آبار المنحنى القياسي، والتي تحتوي على تركيزات معروفة من البروتين المستهدف، لحساب تركيز البروتين المستهدف في آبار العينات التجريبية بناءً على مقارنة امتصاصية آبار العينات بامتصاصية آبار المنحنى القياسي.

الآن حان وقت إضافة الجسم المضاد للكشف أو الجسم المضاد الأولي!

يتم بعد ذلك تحضين اللوحة، عادةً في درجة حرارة الغرفة، للسماح لكمية كافية من الجسم المضاد بالارتباط بالبروتين المستهدف من أجل الكشف عن البروتين وتقديره كمياً لاحقاً.

بعد هذا التحضين، يتم إزالة الجسم المضاد الزائد وتُغسل الآبار لفترة وجيزة باستخدام PBS.

يتم بعد ذلك إضافة الجسم المضاد الثانوي إلى اللوحة، وتُحضن اللوحة مرة أخرى - عادةً على منصة دوارة - للسماح للجسم المضاد الثانوي بالارتباط. تُكرر خطوات الغسيل كما سبق.

بعد ذلك، أضف مادة الركيزة (substrate) إلى اللوحة لمعرفة الآبار التي تحتوي على البروتين المستهدف. قم بتغطية اللوحة لحماية التفاعل من الضوء، ثم بعد تحضين قصير، أوقف التفاعل باستخدام محلول الإيقاف (stop solution).

أخيراً، ضع اللوحة في قارئ الألواح الدقيقة (microplate reader) لقياس الامتصاصية أو كمية المحلول الملون في كل بئر. ستحتاج إلى تحديد الآبار التي تريد من القارئ تحليلها. عندما ينتهي الجهاز من قراءة اللوحة، ستظهر قراءة للامتصاصية لكل بئر.

من المهم ملاحظة أن لكل مجموعة ELISA حداً للكشف. وهذا يعني أنه يمكن تحديد تركيزات البروتين التي تقع فوق وتحت حدود معينة بدقة فقط. عادةً ما تكون التركيزات الصغيرة جداً من البروتين قريبة جداً من مستويات الخلفية للتلوين غير المحدد، بينما قد تشير التركيزات العالية جداً إلى أن البروتين أو الجسم المضاد الزائد لم يتم غسله بشكل صحيح في بئر تلك العينة.

إذًا، لماذا قد تقوم بإجراء اختبار ELISA؟ دعونا نلقي نظرة على بعض التطبيقات الشائعة.

ربما يكون النوع الأكثر شيوعاً من اختبارات ELISA التي يتم إجراؤها هو اختبار ELISA الساندويتش (sandwich ELISA).

في اختبار ELISA الساندويتش، يتم طلاء لوحة ذات 96 بئراً أولاً بجسم مضاد أولي يتعرف على البروتين المستهدف المراد دراسته.

في هذه التجربة، تم توزيع أوساط زراعة الخلايا التي تم جمعها من خطوط خلايا بشرية منتجة للأجسام المضادة، بواسطة نظام آلي على لوحات ذات 96 بئراً مطلية مسبقاً بجسم مضاد أولي يتعرف على الأجسام المضادة البشرية.

بعد غسل العينة الزائدة باستخدام PBS، يتم إضافة جسم مضاد ثانوي مرتبط بإنزيم، يليه ركيزة لونية.

بعد ذلك يتم قياس الامتصاصية بنفس الطريقة المتبعة في اختبار ELISA النموذجي. على سبيل المثال، في هذه التجربة، ستُستخدم بيانات ELISA هذه لتحديد أي من خطوط الخلايا تنتج الجسم المضاد البشري ذو الألفة الأعلى - أي القدرة الأفضل على الارتباط بدقة - بمستضده المستهدف.

يعتبر اختبار الحمل المنزلي نوعاً من أنواع اختبار ELISA الساندويتش.

عندما يُضاف بول المرأة التي يحتمل أن تكون حاملاً إلى الاختبار، فإن الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بإنزيم والمثبتة في الاختبار سترتبط بهرمون الحمل hCG إذا كان موجوداً. وإذا كانت المرأة حاملاً، سيحدث تفاعل بين الركيزة والإنزيم عندما تتعرف الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالركيزة على الأجسام المضادة الأولية في موقع الاختبار، فيظهر خط ملون.

هناك نوع آخر من اختبار ELISA وهو ELISA التنافسي (competitive ELISA)، والذي يمكن استخدامه للكشف عن وجود الأجسام المضادة.

إذا كانت الأجسام المضادة المراد دراستها موجودة في العينة، فإنها سترتبط بالبروتين المستهدف الملتصق بقاع اللوحة. لاحقاً، عند إضافة أجسام مضادة كاشفة مرتبطة بإنزيم إلى اللوحة، ستجد الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم عدداً قليلاً من البروتينات للارتباط بها أو لن تجد أي بروتينات على الإطلاق؛ حيث تكون الأجسام المضادة المراد دراستها في العينة التجريبية قد "نافستها" وحلت محلها.

وبالتالي، في اختبار ELISA التنافسي، تشير الآبار الملونة إلى العينات التي لا تحتوي فعلياً على الجسم المضاد المراد دراسته! وعادةً ما يتم فحص عينات بلازما المرضى باستخدام ELISA التنافسي لتحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة لمسببات أمراض معينة، مثل فيروس HIV، موجودة في العينة.

لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE حول إجراء مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA). استعرضنا في هذا الفيديو: ماهية مقايسة ELISA وآلية عملها؛ والمعدات والكواشف التي ستحتاجها لإجراء المقايسة؛ وبعض التطبيقات المختلفة لهذا الاختبار. شكراً للمشاهدة، وتذكر ألا تترك الركيزة تتفاعل بشكل مفرط!