طريقة ELISA
ELISA ، أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين مستهدف معين.
من خلال سلسلة من خطوات الغسيل والربط ، سيتعرف الجسم المضاد المترافق أو المرتبط بإنزيم على البروتين المستهدف في قاع صفيحة مكونة من 96 بئرا. عند إضافة الركيزة إلى العينة ، سيحدث تفاعل إنزيمي ، مما يتسبب في تغيير اللون الذي يسمح بتحديد البروتين المستهدف وقياسه كميا.
قبل أن نناقش كيفية إجراء ELISA ، دعنا نتعرف على المعدات والكواشف التي ستحتاجها.
عادة ما يكون إعداد تفاعل ELISA عبارة عن صفيحة سفلية مسطحة ذات 96 بئرا. ستساعد القيعان المسطحة للآبار في تسهيل التوزيع المتساوي لعينتك التجريبية ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة الملتقطة والكشف.
تكتشف ELISAs وجود بروتينات مستهدفة محددة في المحاليل المائية التجريبية. البول ووسائط زراعة الخلايا والمصل هي عينات تجريبية شائعة.
في ELISA ، يكون الجسم المضاد الذي يرتبط مباشرة بالبروتين المستهدف هو الجسم المضاد الأساسي. لها تقارب عال ، أي قدرة عالية على الارتباط بإحكام ، من أجل حاتمة - منطقة معينة - من البروتين المستهدف. عادة ما يكون الجسم المضاد الأساسي غير مسمى أو غير مترافق.
كما ذكرنا ، ترتبط الأجسام المضادة في الغالب بالبروتينات المستهدفة من خلال ارتباط عالي التقارب بحتمة معينة. ومع ذلك، قد تحتوي العينة التجريبية على أجزاء من الخلايا التي تعبر عن مواقع ربط غير محددة، أو مواقع يمكن أن تربط المنطقة الثابتة أو غير الخاصة بالحاتمة من الأجسام المضادة للكاشف.
لذلك ، تعد إضافة مخزن مؤقت للحظر أمرا ضروريا في ELISA لتغطية أي مواقع ربط غير محددة في عيناتك التجريبية. وإلا فقد يكون لديك تفاعلات إنزيمية تحدث في الآبار التي لا تحتوي على البروتين المستهدف ، مما يمنحك بيانات إيجابية خاطئة!
الجسم المضاد الثانوي في ELISA هو الجسم المضاد المستخدم للتعرف على الجسم المضاد الأساسي. عادة ما يتم اقتران هذا الجسم المضاد مع إنزيم. في بعض الأحيان يكون للجسم المضاد الثانوي اسم غير تقليدي. على سبيل المثال ، إذا تم صنع الجسم المضاد الثانوي أو تربيته في حمار للتعرف على الجسم المضاد الأولي الذي تم تربيته في الماعز ، فسيطلق على الجسم المضاد الثانوي اسم الجسم المضاد للماعز للحمار. عندما يتعلق الأمر بتسمية الأجسام المضادة الثانوية ، يشير الاسم الأول إلى الكائن الحي الذي أنتج الجسم المضاد الثانوي ، ويمثل الاسم الثاني الكائن الحي الذي ينتج الجسم المضاد الأساسي.
ستكون هناك حاجة أيضا إلى الركيزة التي ترتبط بالموقع النشط للإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي. يتسبب التفاعل الكيميائي الذي يحدث أثناء هذا التفاعل في تغير اللون في الركيزة عديمة اللون. يسمح هذا الاختبار المزعوم بقياس الألوان بتحديد وقياس وجود البروتين المستهدف.
سيستمر التفاعل الأنزيمي طالما أن هناك ركيزة متاحة. لذلك ، بعد فترة حضانة قصيرة ، يضاف محلول التوقف ، الذي يتسبب في تغيير آخر في اللون للإشارة إلى توقف التفاعل بالفعل ، إلى الآبار.
سيتم استخدام قارئ الصفيحة الدقيقة لتحديد تركيز البروتين محل الاهتمام في كل بئر عن طريق قراءة الامتصاص ، أي كمية المنتج الملون ، في كل بئر. يتناسب الامتصاص مع كمية البروتين المستهدف الموجودة.
الآن بعد أن أصبحت جميع معداتك جاهزة ، دعنا ندير ELISA!
لإجراء ELISA قياسي أو مباشر ، قم أولا بتغطية آبار اللوحة المكونة من 96 بئرا بالبروتين المستهدف المعني المخفف في محلول الطلاء. ضع ضوابطك الإيجابية والسلبية في هذا الوقت أيضا.
بعد احتضان الصفيحة المطلية لفترة كافية لمنح البروتين وقتا لامتصاص أو التصاق بالجزء السفلي من اللوحة تماما ، تخلص من محلول الطلاء الزائد بنقرة سريعة من معصمك.
ثم قم بحظر أي إشارة ربط أو خلفية محتملة غير محددة عن طريق احتضان كل بئر في المخزن المؤقت للحظر.
الآن تخلص من المخزن المؤقت للحجب واغسل الآبار بحضانة درجة حرارة الغرفة لفترة وجيزة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، و 1٪ BSA.
أثناء شطف الآبار باستخدام PBS ، قم بإعداد تخفيفات بتركيز معروف من البروتين المستهدف لإنشاء منحنى قياسي. سيتم استخدام امتصاص آبار المنحنى القياسية ، التي تحتوي على تركيزات معروفة من البروتين المستهدف ، لحساب تركيز البروتين المستهدف في آبار العينة التجريبية بناء على مقارنة امتصاص آبار العينة بامتصاص آبار المنحنى القياسية.
حان الوقت الآن لإضافة الجسم المضاد للكشف أو الأساسي!
ثم يتم تحضين اللوحة ، عادة في درجة حرارة الغرفة ، للسماح لكمية كافية من الجسم المضاد بالارتباط بالبروتين المستهدف للكشف عن البروتين وقياسه لاحقا.
بعد هذا الحضانة ، تتم إزالة الأجسام المضادة الزائدة وغسل الآبار لفترة وجيزة باستخدام PBS.
ثم يضاف الجسم المضاد الثانوي إلى اللوحة ، ويتم تحضين اللوحة مرة أخرى - عادة على منصة دوارة - للسماح للجسم المضاد الثانوي بالارتباط. تتكرر خطوات الغسيل كما كان من قبل.
بعد ذلك ، أضف الركيزة إلى اللوحة لمعرفة الآبار التي تحتوي على البروتين المستهدف. قم بتغطية اللوحة لحماية التفاعل من الضوء ، ثم بعد حضانة قصيرة ، أوقف التفاعل بمحلول التوقف.
أخيرا ، ضع اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس امتصاص أو كمية المحلول الملون في كل بئر. ستحتاج إلى تحديد الآبار التي تريد أن يقوم القارئ بتحليلها. عند الانتهاء من قراءة اللوحة ، سيتم عرض قراءة الامتصاص لكل بئر.
من المهم ملاحظة أن كل مجموعة ELISA لها حد للكشف. أي أنه يمكن تحديد تركيزات البروتين فقط أعلى وأقل من الحدود المحددة بدقة. عادة ما تكون التركيزات الصغيرة جدا من البروتين قريبة جدا من مستويات الخلفية للتلطيخ غير المحدد ، في حين أن التركيزات العالية جدا قد تشير إلى أن البروتين الزائد أو الجسم المضاد لم يتم غسله بشكل صحيح في تلك العينة جيدا.
فلماذا قد تقوم بإجراء ELISA؟ دعونا نلقي نظرة على بعض التطبيقات الشائعة.
ربما يكون النوع الأكثر شيوعا من ELISA الذي يتم إجراؤه هو شطيرة ELISA.
في شطيرة ELISA ، يتم طلاء صفيحة 96 بئرا أولا بجسم مضاد أساسي يتعرف على البروتين المستهدف محل الاهتمام.
في هذه التجربة ، تم طلاء وسائط زراعة الخلايا التي تم حصادها من خطوط الخلايا المنتجة للأجسام المضادة البشرية بواسطة نظام آلي على ألواح مكونة من 96 بئرا مغلفة مسبقا بجسم مضاد أساسي يتعرف على الأجسام المضادة البشرية.
بعد غسل العينة الزائدة باستخدام PBS ، يضاف جسم مضاد ثانوي مرتبط بالإنزيم ، متبوعا بركيزة لونية.
ثم يتم قياس الامتصاص بنفس طريقة قياس ELISA النموذجية. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، سيتم استخدام بيانات ELISA هذه لتحديد خطوط الخلايا التي تنتج الجسم المضاد البشري بأعلى تقارب - أي أفضل قدرة على الارتباط بدقة - بمستضد مستهدف.
اختبار الحمل الذي لا يستلزم وصفة طبية هو نوع واحد من شطيرة ELISA.
عند إضافة بول المرأة الحامل إلى الاختبار ، فإن الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالإنزيم المرتبطة بالاختبار ستربط هرمون الحمل hCG إذا كان موجودا. إذا كانت المرأة حاملا ، فسيحدث تفاعل الركيزة عندما يتم التعرف على الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالركيزة في موقع الاختبار ، وسيظهر خط ملون.
نوع آخر من ELISA هو ELISA التنافسي ، والذي يمكن استخدامه للكشف عن وجود الأجسام المضادة.
إذا كانت الأجسام المضادة ذات الأهمية موجودة في العينة ، فسوف ترتبط بالبروتين المستهدف المتصل بالجزء السفلي من اللوحة. في وقت لاحق ، عندما تتم إضافة الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم إلى اللوحة ، ستجد الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم القليل من البروتينات أو لا تجد أي بروتينات مرتبطة بالارتباط. ستكون قد "تفوقت" على الأجسام المضادة ذات الأهمية في العينة التجريبية.
في ELISA التنافسي ، إذن ، تشير الآبار الملونة إلى العينات التي لا تحتوي في الواقع على الجسم المضاد المعني! عادة ما يتم تشغيل عينات بلازما المريض في ELISA تنافسي لتحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة لمسببات الأمراض ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، موجودة في العينة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لأداء ELISA. في هذا الفيديو قمنا بمراجعة: ما هي ELISA وكيف تعمل. ما هي المعدات والكواشف التي ستحتاج إلى أدائها و ELISA ؛ وبعض التطبيقات المختلفة للمقايسة. شكرا على المشاهدة ، وتذكر ألا تدع الركيزة الخاصة بك تتطور بشكل مفرط!
عادة ما يتم إجراء مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) للكشف عن وجود و / أو كمية البروتين المستهدف ذي الأهمية داخل عينة تجريبية. أصبح اكتشاف…
ELISA ، أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين مستهدف معين.
من خلال سلسلة من خطوات الغسيل والربط ، سيتعرف الجسم المضاد المترافق أو المرتبط بإنزيم على البروتين المستهدف في قاع صفيحة مكونة من 96 بئرا. عند إضافة الركيزة إلى العينة ، سيحدث تفاعل إنزيمي ، مما يتسبب في تغيير اللون الذي يسمح بتحديد البروتين المستهدف وقياسه كميا.
قبل أن نناقش كيفية إجراء ELISA ، دعنا نتعرف على المعدات والكواشف التي ستحتاجها.
عادة ما يكون إعداد تفاعل ELISA عبارة عن صفيحة سفلية مسطحة ذات 96 بئرا. ستساعد القيعان المسطحة للآبار في تسهيل التوزيع المتساوي لعينتك التجريبية ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة الملتقطة والكشف.
تكتشف ELISAs وجود بروتينات مستهدفة محددة في المحاليل المائية التجريبية. البول ووسائط زراعة الخلايا والمصل هي عينات تجريبية شائعة.
في ELISA ، يكون الجسم المضاد الذي يرتبط مباشرة بالبروتين المستهدف هو الجسم المضاد الأساسي. لها تقارب عال ، أي قدرة عالية على الارتباط بإحكام ، من أجل حاتمة - منطقة معينة - من البروتين المستهدف. عادة ما يكون الجسم المضاد الأساسي غير مسمى أو غير مترافق.
كما ذكرنا ، ترتبط الأجسام المضادة في الغالب بالبروتينات المستهدفة من خلال ارتباط عالي التقارب بحتمة معينة. ومع ذلك، قد تحتوي العينة التجريبية على أجزاء من الخلايا التي تعبر عن مواقع ربط غير محددة، أو مواقع يمكن أن تربط المنطقة الثابتة أو غير الخاصة بالحاتمة من الأجسام المضادة للكاشف.
لذلك ، تعد إضافة مخزن مؤقت للحظر أمرا ضروريا في ELISA لتغطية أي مواقع ربط غير محددة في عيناتك التجريبية. وإلا فقد يكون لديك تفاعلات إنزيمية تحدث في الآبار التي لا تحتوي على البروتين المستهدف ، مما يمنحك بيانات إيجابية خاطئة!
الجسم المضاد الثانوي في ELISA هو الجسم المضاد المستخدم للتعرف على الجسم المضاد الأساسي. عادة ما يتم اقتران هذا الجسم المضاد مع إنزيم. في بعض الأحيان يكون للجسم المضاد الثانوي اسم غير تقليدي. على سبيل المثال ، إذا تم صنع الجسم المضاد الثانوي أو تربيته في حمار للتعرف على الجسم المضاد الأولي الذي تم تربيته في الماعز ، فسيطلق على الجسم المضاد الثانوي اسم الجسم المضاد للماعز للحمار. عندما يتعلق الأمر بتسمية الأجسام المضادة الثانوية ، يشير الاسم الأول إلى الكائن الحي الذي أنتج الجسم المضاد الثانوي ، ويمثل الاسم الثاني الكائن الحي الذي ينتج الجسم المضاد الأساسي.
ستكون هناك حاجة أيضا إلى الركيزة التي ترتبط بالموقع النشط للإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي. يتسبب التفاعل الكيميائي الذي يحدث أثناء هذا التفاعل في تغير اللون في الركيزة عديمة اللون. يسمح هذا الاختبار المزعوم بقياس الألوان بتحديد وقياس وجود البروتين المستهدف.
سيستمر التفاعل الأنزيمي طالما أن هناك ركيزة متاحة. لذلك ، بعد فترة حضانة قصيرة ، يضاف محلول التوقف ، الذي يتسبب في تغيير آخر في اللون للإشارة إلى توقف التفاعل بالفعل ، إلى الآبار.
سيتم استخدام قارئ الصفيحة الدقيقة لتحديد تركيز البروتين محل الاهتمام في كل بئر عن طريق قراءة الامتصاص ، أي كمية المنتج الملون ، في كل بئر. يتناسب الامتصاص مع كمية البروتين المستهدف الموجودة.
الآن بعد أن أصبحت جميع معداتك جاهزة ، دعنا ندير ELISA!
لإجراء ELISA قياسي أو مباشر ، قم أولا بتغطية آبار اللوحة المكونة من 96 بئرا بالبروتين المستهدف المعني المخفف في محلول الطلاء. ضع ضوابطك الإيجابية والسلبية في هذا الوقت أيضا.
بعد احتضان الصفيحة المطلية لفترة كافية لمنح البروتين وقتا لامتصاص أو التصاق بالجزء السفلي من اللوحة تماما ، تخلص من محلول الطلاء الزائد بنقرة سريعة من معصمك.
ثم قم بحظر أي إشارة ربط أو خلفية محتملة غير محددة عن طريق احتضان كل بئر في المخزن المؤقت للحظر.
الآن تخلص من المخزن المؤقت للحجب واغسل الآبار بحضانة درجة حرارة الغرفة لفترة وجيزة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، و 1٪ BSA.
أثناء شطف الآبار باستخدام PBS ، قم بإعداد تخفيفات بتركيز معروف من البروتين المستهدف لإنشاء منحنى قياسي. سيتم استخدام امتصاص آبار المنحنى القياسية ، التي تحتوي على تركيزات معروفة من البروتين المستهدف ، لحساب تركيز البروتين المستهدف في آبار العينة التجريبية بناء على مقارنة امتصاص آبار العينة بامتصاص آبار المنحنى القياسية.
حان الوقت الآن لإضافة الجسم المضاد للكشف أو الأساسي!
ثم يتم تحضين اللوحة ، عادة في درجة حرارة الغرفة ، للسماح لكمية كافية من الجسم المضاد بالارتباط بالبروتين المستهدف للكشف عن البروتين وقياسه لاحقا.
بعد هذا الحضانة ، تتم إزالة الأجسام المضادة الزائدة وغسل الآبار لفترة وجيزة باستخدام PBS.
ثم يضاف الجسم المضاد الثانوي إلى اللوحة ، ويتم تحضين اللوحة مرة أخرى - عادة على منصة دوارة - للسماح للجسم المضاد الثانوي بالارتباط. تتكرر خطوات الغسيل كما كان من قبل.
بعد ذلك ، أضف الركيزة إلى اللوحة لمعرفة الآبار التي تحتوي على البروتين المستهدف. قم بتغطية اللوحة لحماية التفاعل من الضوء ، ثم بعد حضانة قصيرة ، أوقف التفاعل بمحلول التوقف.
أخيرا ، ضع اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس امتصاص أو كمية المحلول الملون في كل بئر. ستحتاج إلى تحديد الآبار التي تريد أن يقوم القارئ بتحليلها. عند الانتهاء من قراءة اللوحة ، سيتم عرض قراءة الامتصاص لكل بئر.
من المهم ملاحظة أن كل مجموعة ELISA لها حد للكشف. أي أنه يمكن تحديد تركيزات البروتين فقط أعلى وأقل من الحدود المحددة بدقة. عادة ما تكون التركيزات الصغيرة جدا من البروتين قريبة جدا من مستويات الخلفية للتلطيخ غير المحدد ، في حين أن التركيزات العالية جدا قد تشير إلى أن البروتين الزائد أو الجسم المضاد لم يتم غسله بشكل صحيح في تلك العينة جيدا.
فلماذا قد تقوم بإجراء ELISA؟ دعونا نلقي نظرة على بعض التطبيقات الشائعة.
ربما يكون النوع الأكثر شيوعا من ELISA الذي يتم إجراؤه هو شطيرة ELISA.
في شطيرة ELISA ، يتم طلاء صفيحة 96 بئرا أولا بجسم مضاد أساسي يتعرف على البروتين المستهدف محل الاهتمام.
في هذه التجربة ، تم طلاء وسائط زراعة الخلايا التي تم حصادها من خطوط الخلايا المنتجة للأجسام المضادة البشرية بواسطة نظام آلي على ألواح مكونة من 96 بئرا مغلفة مسبقا بجسم مضاد أساسي يتعرف على الأجسام المضادة البشرية.
بعد غسل العينة الزائدة باستخدام PBS ، يضاف جسم مضاد ثانوي مرتبط بالإنزيم ، متبوعا بركيزة لونية.
ثم يتم قياس الامتصاص بنفس طريقة قياس ELISA النموذجية. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، سيتم استخدام بيانات ELISA هذه لتحديد خطوط الخلايا التي تنتج الجسم المضاد البشري بأعلى تقارب - أي أفضل قدرة على الارتباط بدقة - بمستضد مستهدف.
اختبار الحمل الذي لا يستلزم وصفة طبية هو نوع واحد من شطيرة ELISA.
عند إضافة بول المرأة الحامل إلى الاختبار ، فإن الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالإنزيم المرتبطة بالاختبار ستربط هرمون الحمل hCG إذا كان موجودا. إذا كانت المرأة حاملا ، فسيحدث تفاعل الركيزة عندما يتم التعرف على الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالركيزة في موقع الاختبار ، وسيظهر خط ملون.
نوع آخر من ELISA هو ELISA التنافسي ، والذي يمكن استخدامه للكشف عن وجود الأجسام المضادة.
إذا كانت الأجسام المضادة ذات الأهمية موجودة في العينة ، فسوف ترتبط بالبروتين المستهدف المتصل بالجزء السفلي من اللوحة. في وقت لاحق ، عندما تتم إضافة الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم إلى اللوحة ، ستجد الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم القليل من البروتينات أو لا تجد أي بروتينات مرتبطة بالارتباط. ستكون قد "تفوقت" على الأجسام المضادة ذات الأهمية في العينة التجريبية.
في ELISA التنافسي ، إذن ، تشير الآبار الملونة إلى العينات التي لا تحتوي في الواقع على الجسم المضاد المعني! عادة ما يتم تشغيل عينات بلازما المريض في ELISA تنافسي لتحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة لمسببات الأمراض ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، موجودة في العينة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لأداء ELISA. في هذا الفيديو قمنا بمراجعة: ما هي ELISA وكيف تعمل. ما هي المعدات والكواشف التي ستحتاج إلى أدائها و ELISA ؛ وبعض التطبيقات المختلفة للمقايسة. شكرا على المشاهدة ، وتذكر ألا تدع الركيزة الخاصة بك تتطور بشكل مفرط!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
ELISA ، أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ، هي طريقة مستخدمة على نطاق واسع لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين مستهدف معين.
من خلال سلسلة من خطوات الغسيل والربط ، سيتعرف الجسم المضاد المترافق أو المرتبط بإنزيم على البروتين المستهدف في قاع صفيحة مكونة من 96 بئرا. عند إضافة الركيزة إلى العينة ، سيحدث تفاعل إنزيمي ، مما يتسبب في تغيير اللون الذي يسمح بتحديد البروتين المستهدف وقياسه كميا.
قبل أن نناقش كيفية إجراء ELISA ، دعنا نتعرف على المعدات والكواشف التي ستحتاجها.
عادة ما يكون إعداد تفاعل ELISA عبارة عن صفيحة سفلية مسطحة ذات 96 بئرا. ستساعد القيعان المسطحة للآبار في تسهيل التوزيع المتساوي لعينتك التجريبية ، بالإضافة إلى الأجسام المضادة الملتقطة والكشف.
تكتشف ELISAs وجود بروتينات مستهدفة محددة في المحاليل المائية التجريبية. البول ووسائط زراعة الخلايا والمصل هي عينات تجريبية شائعة.
في ELISA ، يكون الجسم المضاد الذي يرتبط مباشرة بالبروتين المستهدف هو الجسم المضاد الأساسي. لها تقارب عال ، أي قدرة عالية على الارتباط بإحكام ، من أجل حاتمة - منطقة معينة - من البروتين المستهدف. عادة ما يكون الجسم المضاد الأساسي غير مسمى أو غير مترافق.
كما ذكرنا ، ترتبط الأجسام المضادة في الغالب بالبروتينات المستهدفة من خلال ارتباط عالي التقارب بحتمة معينة. ومع ذلك، قد تحتوي العينة التجريبية على أجزاء من الخلايا التي تعبر عن مواقع ربط غير محددة، أو مواقع يمكن أن تربط المنطقة الثابتة أو غير الخاصة بالحاتمة من الأجسام المضادة للكاشف.
لذلك ، تعد إضافة مخزن مؤقت للحظر أمرا ضروريا في ELISA لتغطية أي مواقع ربط غير محددة في عيناتك التجريبية. وإلا فقد يكون لديك تفاعلات إنزيمية تحدث في الآبار التي لا تحتوي على البروتين المستهدف ، مما يمنحك بيانات إيجابية خاطئة!
الجسم المضاد الثانوي في ELISA هو الجسم المضاد المستخدم للتعرف على الجسم المضاد الأساسي. عادة ما يتم اقتران هذا الجسم المضاد مع إنزيم. في بعض الأحيان يكون للجسم المضاد الثانوي اسم غير تقليدي. على سبيل المثال ، إذا تم صنع الجسم المضاد الثانوي أو تربيته في حمار للتعرف على الجسم المضاد الأولي الذي تم تربيته في الماعز ، فسيطلق على الجسم المضاد الثانوي اسم الجسم المضاد للماعز للحمار. عندما يتعلق الأمر بتسمية الأجسام المضادة الثانوية ، يشير الاسم الأول إلى الكائن الحي الذي أنتج الجسم المضاد الثانوي ، ويمثل الاسم الثاني الكائن الحي الذي ينتج الجسم المضاد الأساسي.
ستكون هناك حاجة أيضا إلى الركيزة التي ترتبط بالموقع النشط للإنزيم المرتبط بالجسم المضاد الثانوي. يتسبب التفاعل الكيميائي الذي يحدث أثناء هذا التفاعل في تغير اللون في الركيزة عديمة اللون. يسمح هذا الاختبار المزعوم بقياس الألوان بتحديد وقياس وجود البروتين المستهدف.
سيستمر التفاعل الأنزيمي طالما أن هناك ركيزة متاحة. لذلك ، بعد فترة حضانة قصيرة ، يضاف محلول التوقف ، الذي يتسبب في تغيير آخر في اللون للإشارة إلى توقف التفاعل بالفعل ، إلى الآبار.
سيتم استخدام قارئ الصفيحة الدقيقة لتحديد تركيز البروتين محل الاهتمام في كل بئر عن طريق قراءة الامتصاص ، أي كمية المنتج الملون ، في كل بئر. يتناسب الامتصاص مع كمية البروتين المستهدف الموجودة.
الآن بعد أن أصبحت جميع معداتك جاهزة ، دعنا ندير ELISA!
لإجراء ELISA قياسي أو مباشر ، قم أولا بتغطية آبار اللوحة المكونة من 96 بئرا بالبروتين المستهدف المعني المخفف في محلول الطلاء. ضع ضوابطك الإيجابية والسلبية في هذا الوقت أيضا.
بعد احتضان الصفيحة المطلية لفترة كافية لمنح البروتين وقتا لامتصاص أو التصاق بالجزء السفلي من اللوحة تماما ، تخلص من محلول الطلاء الزائد بنقرة سريعة من معصمك.
ثم قم بحظر أي إشارة ربط أو خلفية محتملة غير محددة عن طريق احتضان كل بئر في المخزن المؤقت للحظر.
الآن تخلص من المخزن المؤقت للحجب واغسل الآبار بحضانة درجة حرارة الغرفة لفترة وجيزة في محلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، و 1٪ BSA.
أثناء شطف الآبار باستخدام PBS ، قم بإعداد تخفيفات بتركيز معروف من البروتين المستهدف لإنشاء منحنى قياسي. سيتم استخدام امتصاص آبار المنحنى القياسية ، التي تحتوي على تركيزات معروفة من البروتين المستهدف ، لحساب تركيز البروتين المستهدف في آبار العينة التجريبية بناء على مقارنة امتصاص آبار العينة بامتصاص آبار المنحنى القياسية.
حان الوقت الآن لإضافة الجسم المضاد للكشف أو الأساسي!
ثم يتم تحضين اللوحة ، عادة في درجة حرارة الغرفة ، للسماح لكمية كافية من الجسم المضاد بالارتباط بالبروتين المستهدف للكشف عن البروتين وقياسه لاحقا.
بعد هذا الحضانة ، تتم إزالة الأجسام المضادة الزائدة وغسل الآبار لفترة وجيزة باستخدام PBS.
ثم يضاف الجسم المضاد الثانوي إلى اللوحة ، ويتم تحضين اللوحة مرة أخرى - عادة على منصة دوارة - للسماح للجسم المضاد الثانوي بالارتباط. تتكرر خطوات الغسيل كما كان من قبل.
بعد ذلك ، أضف الركيزة إلى اللوحة لمعرفة الآبار التي تحتوي على البروتين المستهدف. قم بتغطية اللوحة لحماية التفاعل من الضوء ، ثم بعد حضانة قصيرة ، أوقف التفاعل بمحلول التوقف.
أخيرا ، ضع اللوحة في قارئ الصفيحة الدقيقة لقياس امتصاص أو كمية المحلول الملون في كل بئر. ستحتاج إلى تحديد الآبار التي تريد أن يقوم القارئ بتحليلها. عند الانتهاء من قراءة اللوحة ، سيتم عرض قراءة الامتصاص لكل بئر.
من المهم ملاحظة أن كل مجموعة ELISA لها حد للكشف. أي أنه يمكن تحديد تركيزات البروتين فقط أعلى وأقل من الحدود المحددة بدقة. عادة ما تكون التركيزات الصغيرة جدا من البروتين قريبة جدا من مستويات الخلفية للتلطيخ غير المحدد ، في حين أن التركيزات العالية جدا قد تشير إلى أن البروتين الزائد أو الجسم المضاد لم يتم غسله بشكل صحيح في تلك العينة جيدا.
فلماذا قد تقوم بإجراء ELISA؟ دعونا نلقي نظرة على بعض التطبيقات الشائعة.
ربما يكون النوع الأكثر شيوعا من ELISA الذي يتم إجراؤه هو شطيرة ELISA.
في شطيرة ELISA ، يتم طلاء صفيحة 96 بئرا أولا بجسم مضاد أساسي يتعرف على البروتين المستهدف محل الاهتمام.
في هذه التجربة ، تم طلاء وسائط زراعة الخلايا التي تم حصادها من خطوط الخلايا المنتجة للأجسام المضادة البشرية بواسطة نظام آلي على ألواح مكونة من 96 بئرا مغلفة مسبقا بجسم مضاد أساسي يتعرف على الأجسام المضادة البشرية.
بعد غسل العينة الزائدة باستخدام PBS ، يضاف جسم مضاد ثانوي مرتبط بالإنزيم ، متبوعا بركيزة لونية.
ثم يتم قياس الامتصاص بنفس طريقة قياس ELISA النموذجية. على سبيل المثال ، في هذه التجربة ، سيتم استخدام بيانات ELISA هذه لتحديد خطوط الخلايا التي تنتج الجسم المضاد البشري بأعلى تقارب - أي أفضل قدرة على الارتباط بدقة - بمستضد مستهدف.
اختبار الحمل الذي لا يستلزم وصفة طبية هو نوع واحد من شطيرة ELISA.
عند إضافة بول المرأة الحامل إلى الاختبار ، فإن الأجسام المضادة الأولية المرتبطة بالإنزيم المرتبطة بالاختبار ستربط هرمون الحمل hCG إذا كان موجودا. إذا كانت المرأة حاملا ، فسيحدث تفاعل الركيزة عندما يتم التعرف على الأجسام المضادة الأولية بواسطة الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالركيزة في موقع الاختبار ، وسيظهر خط ملون.
نوع آخر من ELISA هو ELISA التنافسي ، والذي يمكن استخدامه للكشف عن وجود الأجسام المضادة.
إذا كانت الأجسام المضادة ذات الأهمية موجودة في العينة ، فسوف ترتبط بالبروتين المستهدف المتصل بالجزء السفلي من اللوحة. في وقت لاحق ، عندما تتم إضافة الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم إلى اللوحة ، ستجد الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم القليل من البروتينات أو لا تجد أي بروتينات مرتبطة بالارتباط. ستكون قد "تفوقت" على الأجسام المضادة ذات الأهمية في العينة التجريبية.
في ELISA التنافسي ، إذن ، تشير الآبار الملونة إلى العينات التي لا تحتوي في الواقع على الجسم المضاد المعني! عادة ما يتم تشغيل عينات بلازما المريض في ELISA تنافسي لتحديد ما إذا كانت الأجسام المضادة لمسببات الأمراض ، مثل فيروس نقص المناعة البشرية ، موجودة في العينة.
لقد شاهدت للتو مقدمة JoVE لأداء ELISA. في هذا الفيديو قمنا بمراجعة: ما هي ELISA وكيف تعمل. ما هي المعدات والكواشف التي ستحتاج إلى أدائها و ELISA ؛ وبعض التطبيقات المختلفة للمقايسة. شكرا على المشاهدة ، وتذكر ألا تدع الركيزة الخاصة بك تتطور بشكل مفرط!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is an ELISA and how does it detect target proteins?
An ELISA, or enzyme-linked immunosorbent assay, detects specific target proteins in experimental samples through antibody binding. Antibodies conjugated to enzymes recognize target proteins coating the bottom of a 96-well plate. When substrate is added, an enzymatic reaction occurs, causing a color change that allows identification and quantification of the target protein.
Q2: Why is a blocking buffer essential in ELISA procedures?
A blocking buffer covers nonspecific binding sites in experimental samples that could otherwise bind detector antibodies. Without blocking, enzymatic reactions may occur in wells lacking target protein, producing false positive results. This step prevents background signal and ensures accurate detection of only the target protein of interest.
Q3: How do primary and secondary antibodies work together in an ELISA?
The primary antibody directly binds to the target protein with high affinity for a specific epitope region. The secondary antibody, typically raised in a different organism, recognizes and binds to the primary antibody. The secondary antibody is enzyme-conjugated, enabling the colorimetric reaction when substrate is added.
Q4: What role does the microplate reader play in ELISA analysis?
The microplate reader quantifies protein concentration by measuring absorbance, or the amount of colored product, in each well. The absorbance is proportional to the target protein present. By comparing sample well absorbance to a standard curve of known protein concentrations, the reader determines the protein concentration in experimental samples.
Q5: What is a sandwich ELISA and how does it differ from a standard ELISA?
In a sandwich ELISA, the 96-well plate is coated first with a primary antibody that recognizes the target protein, rather than coating with the target protein itself. The target protein binds between the plate-bound primary antibody and an enzyme-linked secondary antibody, creating a sandwich structure. This format is commonly used in pregnancy tests and cell line screening applications.
Q6: How does a competitive ELISA detect antibodies in patient samples?
In a competitive ELISA, antibodies of interest in the sample bind to target protein attached to the plate bottom. When enzyme-linked detection antibodies are added, they find few binding sites because the sample antibodies have already bound the target protein. Colored wells indicate samples without the antibody of interest, making this format useful for detecting pathogen antibodies like HIV.
Q7: What determines the detection limits of an ELISA assay?
Each ELISA kit has specific detection limits based on protein concentration ranges. Very low protein concentrations are too close to background levels of nonspecific staining and cannot be accurately detected. Very high concentrations may indicate excess protein or antibody was not properly washed away, affecting result accuracy.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:43
ELISA: Components and Principles
4:03
Running an ELISA
7:18
Applications
9:53
Summary