قوالب الطباعية عكس Thermoresponsive لإنشاء منقوشة الهلاميات المائية ثنائي مكون للثقافة الخلية 3D

الهدف العام من هذا الإجراء هو طباعة قالب عكسي لإنشاء هلاميات مائية منقوشة مكونة من مكونين لزراعة الخلايا ثلاثية الأبعاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق طباعة قالب عكسي أولا من بوليمر قابل للانعكاس الحراري ، وهو سائل عند أربع درجات مئوية ، ولكنه هلام ناعم في درجة حرارة الغرفة. يمكن مراوغة هذا القالب العكسي لاحقا.

الخطوة الثانية هي ملء القالب العكسي ببوليمر حيوي من اختيارك. هنا استخدمنا aros. يمكن ربط البوليمر الحيوي إما عن طريق الربط الأنزيمي أو الأشعة فوق البنفسجية أو درجة الحرارة.

بعد ذلك ، يتم التلميح إلى القالب العكسي عن طريق غمر القالب في الماء البارد. بعد هذه الخطوة ، يكون قالب AROS الناتج جاهزا لمزيد من المعالجة. الخطوة الأخيرة هي ملء الفراغات ببوليمر حيوي ثان ، والذي يمكن أن يحتوي على خلايا ويمكن ربطه عن طريق الإنزيمات أو الأشعة فوق البنفسجية أو درجة الحرارة.

في النهاية ، أنشأنا طريقة قابلة للتكرار لإنشاء سقالات ثقافة الخلايا D منظمة مكانيا. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما اقترح أحد الزملاء أنه يمكننا الاستفادة من خصائص الاستجابة الحرارية ل Oxr باستخدامها كقالب قرابين. سيوضح الإجراء ميشا مواه ، طالبة دراسات عليا من مختبري.

للبدء ، أضف 60 مل من محلول PBS المثلج البارد في زجاجة زجاجية وحرك بقوة باستخدام تحريك مغناطيسي. ثم قم بوزن 24.5 جراما من Paul ER وأضفه بكميات صغيرة إلى PBS البارد. انتظر حتى يذوب Paul Oxr جزئيا في PBS قبل إضافة المزيد.

استمر في تقليب المحلول حتى يذوب كل بول أوكسر. بعد ذلك ، أضف PBS مثلج إضافيا حتى يتم الوصول إلى الحجم النهائي البالغ 100 مل ، مما ينتج عنه تركيز نهائي يبلغ 24.5٪ من الوزن لكل حجم. ثم قلبي الخليط حتى يمتزج جيدا.

توقف عن تقليب المحلول واتركه يرتاح عند أربع درجات مئوية طوال الليل حتى تختفي الفقاعات والرغوة في المحلول. يتم نقل الفقاعات المحبوسة داخل الجل إلى خرطوشة الطابعة وستؤدي إلى عيوب في قوالب القرابين المطبوعة. معقم قم بتصفية المحلول مباشرة في خرطوشة الطباعة باستخدام مرشح مسبق التبريد لإزالة أي جزيئات غير مرغوب فيها يمكن أن تسد الإبرة.

قم بتخزين الخرطوشة على درجة حرارة أربع درجات مئوية حتى 30 دقيقة قبل التجربة. قم بإعداد صمام الملف اللولبي والإبرة للطباعة عن طريق وضعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة منفصلة سعة 1.5 مليلتر مملوءة بالماء فائق النقاء وتوزيعها لمدة 30 دقيقة. ثم شطف الصمامات التي تم تنظيفها بالإيثانول وجففها بمسدس النيتروجين.

بعد ذلك ، قم بتثبيت صمام الملف اللولبي النظيف والإبرة في الطابعة. أيضا ، قم بتثبيت خرطوشة طباعة نظيفة فارغة لاختبار النظام. قم بتطبيق ضغط ثلاثة بار على النظام وقم بتفجير أي سوائل متبقية من الصمام والإبرة المثبتة بالهواء المضغوط.

لأقطار الإبرة الصغيرة. قم بتركيب مرشح عند مخرج الهواء المضغوط لتجنب دخول الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تسد الإبرة. ثم أطفئ الضغط.

عندما ينخفض الضغط إلى الصفر ، قم بتثبيت الخرطوشة المحملة مسبقا مع poly oxr. يجب إخراج الخرطوشة من الثلاجة قبل 30 دقيقة تقريبا من تركيب الخرطوشة حتى يصل البولي أوكسر السائل إلى درجة حرارة الغرفة والهلام قبل الطباعة. تحقق مما إذا كان poly oxr قد تم تجنيده عن طريق قلب الخرطوشة.

بعد ذلك ، قم بتطبيق ثلاثة بار من الضغط على النظام واستغني عن Paul Emer حتى يصل إلى طرف الإبرة ويتم بثقه في حبلا مستمر. باستخدام برنامج CAD الحيوي، ارسم خطا واحدا بنفس طول الهيكل الذي تنوي طباعته في قائمة إعدادات برنامج الطابعة. اضبط صمام الملف اللولبي على تردد عال يبلغ 50 هرتز في قسم المعلمة وقم بضبط إعداد الضغط العالي يدويا على ثلاثة بار.

بعد ذلك ، قم بتعيين مجهر زجاجي ، وقم بتمرير الطابعة وثبتها في مكانها عن طريق تشغيل المكنسة الكهربائية. ثم اطبع طبقة واحدة من سطر واحد بسرعة مرحلة 300 ملم في الدقيقة. احصل على عرض الخط المطلوب عن طريق تقليل الضغط يدويا وإعدادات التردد في البرنامج لكل خط جديد ، وتأكد من بقاء الخط مستمرا.

إذا تم كسر الخط المرسوم، فقد تم الوصول إلى الحد الأدنى. بمجرد تحقيق خط مستمر بالعرض المطلوب ، حدد سرعة المرحلة المثلى وسمك الطبقة عن طريق التحقق من وجود عيوب في التركيبات المطبوعة. من أجل ضبط سمك الطبقة ، قد يحتاج الضغط والتردد أيضا إلى إعادة ضبط قليلا.

لاختبار إعداد سمك الطبقة ، قم بطباعة عدة طبقات فوق بعضها البعض وراقب للتأكد من أن الإبرة في الموضع الصحيح فوق الطبقة السابقة. اضبط سمك الطبقة بحيث تتم طباعة كل طبقة مباشرة فوق الطبقة السابقة. لتحسين سرعة المرحلة ، ابدأ بتقليل سرعة المرحلة من 300 ملم في الدقيقة خطوة بخطوة بحيث تبدأ الطبقات المبثوقة وتنتهي في نفس مواضع الطبقات السابقة.

إذا تحركت المرحلة بسرعة كبيرة ، فسيظهر نمط يشبه الموجة في الجزء العلوي من الطبقة. لطباعة هياكل الأعمدة ، ارسم نقطة واحدة بدلا من خط في برنامج CAD. ثم قم بضبط الضغط والتردد لتنظيم سمك الطبقة وقطر العمود ووقت خطوة رأس الطباعة لزيادة سرعة الطباعة.

بمجرد التحسين ، احفظ المعلمات لاستخدامها لاحقا. أولا ، اطبع الهيكل الداخلي مثل مجموعة الأعمدة هذه على شريحة مجهر زجاجي واتركها تجف. يقلل التجفيف طوال الليل من حجم وسمك الهياكل ويوفر التصاق أفضل بين الهيكل والركيزة.

في اليوم التالي ، ارسم هيكلا يتكون من جدار خارجي يحيط بالهياكل التي تنوي التخلص منها وملئها. يجب طباعة جدار البوليمر على بعد 3.5 ملم على الأقل من الهياكل الداخلية بسبب أبعاد الإبرة. بعد ذلك ، قم بإعداد خليط من 1٪ aros في الماء منزوع الأيونات عن طريق تسخينه في الميكروويف بمجرد إذابته بالكامل.

قم بتبريد المحلول الزراعي إلى ما بين 35 و 45 درجة مئوية. ثم املأ قالب القرابين بالمحلول الزراعي باستخدام ماصة. يجب أن يتم ذلك ببطء لتجنب تدمير الهيكل داخل الجدار.

بمجرد ملئه ، ضع القالب على أربع درجات مئوية لترسيخ الجل. بعد حوالي 10 دقائق ، أخرج الجل من الثلاجة وضعه في حمام جليدي لمدة 10 دقائق لتصفية بنية البوليمر. ثم قم بإزالة الهيكل بعناية وإزالة الماء المتبقي عن طريق نشفه بمنديل ورقي.

اضغط على الهيكل بعناية على شريحة مجهر زجاجي جديدة لإنشاء ختم جيد يمنع تسرب الهيدروجيل الثالث. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول 1٪ من الألجينات ميثاكريلات في 0.15 كلوريد الصوديوم المولاري. دوامة الحل لإذابة الألجينات ميثاكريلات.

ثم أضف 2.5٪ حجم إلى الحجم. Alexa ، 4 88 فيبرينوجين مترافق ، و 0.05٪ وزن لكل حجم. ليثيوم فينيل 2 4 6 ثلاثي ميثيل بنزويل فوسفات للحصول على هيدروجيل ثالث يمكن تصوره بسهولة عن طريق التألق.

ضع هذا المحلول في حقنة سعة 0.3 ملليلتر مزودة بإبرة قياس 30. ثم استخدم المحقنة لملء الفراغات التي خلفها البوليمر المراوغ. تأكد من ملء كل عمود بالكامل عن طريق إخراج البوليمر حيث يتم سحب الإبرة من كل عمود.

أخيرا ، قم ببلمرة البوليمر المحقون بمصباح الأشعة فوق البنفسجية عالي الكثافة لمدة خمس دقائق ، ثم قم بتصوير البناء باستخدام مضان epi ، أو مجهر متحد البؤر. يظهر هنا إعادة بناء Zack ثلاثية الأبعاد لبناء مشابه لتلك التي تم تصنيعها للتو ، وهي الألجينات المسمى بالفلورسنت المستخدمة في الردم. تظهر أشكال الأعمدة على شكل أعمدة خضراء والجزء الخارجي من البناء شفاف.

التقنيات المعروضة في هذا الفيديو قابلة للتكيف على نطاق واسع مع العديد من الترتيبات ثلاثية الأبعاد المختلفة ، مثل الدوائر متحدة المركز الموضحة هنا. القرار يعتمد على قطر الإبرة. يمكن أن تنتج الإبرة التي يبلغ قطرها 150 ميكرون المستخدمة في هذا التصميم خيوطا يتراوح قطرها بين 120 و 200 ميكرون.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد للخطوات المتبعة في طباعة oxr. لقد أظهرنا استخدام oxr كقالب قرابين لإنشاء أنماط الهلاميات المائية ، ولكن يمكن أيضا تثبيت oxr للأشعة فوق البنفسجية إذا تم استخدام نسخة ذات صلة بالتصنيع من البوليمر.