الفصل بين أنواع الخلايا المنوية عن طريق STA-PUT سرعة الترسيب

الهدف العام من هذا الإجراء هو فصل الأنواع المختلفة من الخلايا الموجودة في الخصيتين. أولا ، حصاد مجموعة مختلطة من الخلايا من الفأر. الخصيتين تحميل الخلايا وتدرج BSA داخل البقاء وضعت الجهاز.

الآن اسمح للخلايا بالترسيب من خلال تدرج BSA. ثم اجمع الكسور ودمجها بناء على تكوين الخلية. في النهاية ، يتم استخدام ترسيب السرعة مع وضع البقاء لفصل أنواع مختلفة من الخلايا عن الخصيتين بناء على الاختلافات في الحجم والكثافة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل الحقائق ، هي أنه يمكن للمرء عزل كميات كبيرة من أنواع الخلايا المختلفة بنقاوة عالية إلى حد ما باستخدام الأواني الزجاجية البسيطة والجاذبية. قم بتأمين الأسطوانتين اللترتين وغرفة تحميل الخلية بالمنصة العلوية وقم بتوصيلها بقطعتين صغيرتين من الأنابيب بمشابك أنبوبية. قم بإغلاق جميع الأنابيب وأغلق الفوهة على أسطوانة لترين في أقصى اليمين.

ضع قضيب تقليب صغير في غرفة تحميل الخلية وقضيب تحريك أكبر في الأسطوانة الموجودة في أقصى يسار سعة لترين. ثم ضع غرفة الترسيب سعة لترين على المنصة. ضع الحاجز المعدني مباشرة أعلى الفتحة في قاع غرفة الترسيب لمنع دوامة السائل وتعطيل تدرج الخلية أثناء تجميع الكسور.

الآن ضع الغطاء على غرفة الترسيب. ضع كمية صغيرة جدا من الشحوم المفرغة على المفصل الزجاجي الأرضي لقضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات. ثم قم بتثبيت قضيب الإيقاف في قاع غرفة الترسيب ، وربط الوصلات الزجاجية الأرضية لقضيب التوقف وغرفة الترسيب.

بعد ذلك ، قم بتوصيل غرفة تحميل الخلية بالمخرج الأيمن لقضيب التوقف بالأنابيب. أغلق قضيب التوقف ، ثم قم بتوصيل أنبوب تجزئة الخلية بالمخرج الأيسر لقضيب التوقف وقم بتثبيت الأنبوب الصغير في الأسفل. صب محلول BSA 2٪ في الأسطوانة اليسرى سعة لترين.

صب محلول BSA 4٪ في الأسطوانة اليمنى سعة لترين. تأكد من عدم وجود فقاعات كبيرة في الأنبوب الذي يربط هذه الأسطوانات. صب مخزن Krebs المؤقت في غرفة تحميل الخلية واملأ الأنبوب الذي يربط هذه الغرفة بغرفة الترسيب.

تحقق من عدم وجود فقاعات كبيرة قد تزعج التدرج. إذا لزم الأمر ، اضغط على الأنبوب أو نقره برفق لإزالة الفقاعات. تأكد من أن جميع الزواحف موجودة في الأنبوب وليس في حجرة الخلية.

اسمح لكمية صغيرة من المخزن المؤقت Krebs بالتدفق إلى غرفة الترسيب. ثم قم بتصريف كل المخزن المؤقت تقريبا في أنبوب تجزئة الخلية. من أجل ملء الأنبوب وإزالة أي فقاعات كبيرة ، ضع مجمع الكسر مباشرة أسفل غرفة الترسيب.

تأكد من أن جميع أنابيب الكسر في مكانها وقم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي لمنع التلوث. قم بإزالة الخصيتين في صفيحة منفصلة تحتوي على ثمانية ملليلتر من كريبس. قم بعمل شق في الغشاء الرقيق الذي يحيط بالأنابيب المنوية بزوج واحد من الملقط.

امسك الغشاء الآن بزوج آخر من الملقط. ادفع الأنابيب خارج الغشاء وبعيدا عنه. انقل أربعة ملليلتر من كريبس التي تحتوي على الأنابيب إلى كل أنبوب مخروطي يحتوي على 25 مل من محلول الكولاجيناز.

رج العبوة على حرارة 33 درجة مئوية لمدة 10 دقائق حتى تتطور الأنابيب إلى مظهر يشبه السباغيتي. بعد ذلك ، اترك الأنابيب تستقر لمدة خمس دقائق في قاع الأنبوب. اسكب المادة الطافية واغسلها مرتين ب 25 مل من كريبس في درجة حرارة الغرفة ، مما يسمح للأنابيب بالاستقرار في قاع الأنبوب في كل مرة.

اترك ما يقرب من خمسة ملليلتر من كريبس في كل أنبوب. بعد احتضان الأنابيب مع التربسين. استخدم ماصة واسعة التجويف لتحريك المحلول الذي يحتوي على الأنابيب.

تقطيفهم للداخل والخارج حوالي 10 مرات. يجب أن يبدأ الحل في الظهور أشبه بتعليق خلية واحدة. الآن قم بتصفية كل معلق أحادي الخلية سعة 30 مليلتر من خلال مصفاة خلية شبكية 100 ميكرون.

بعد الجمع بين معلقات الخلية ، احسب العدد الإجمالي للخلايا. تأكد من وضع قضيب الإيقاف لتوجيه التدفق من غرفة الخلية إلى غرفة الترسيب. اقلب كلا لوحي شريط التحريك على إعداد منخفض.

ثم صب معلق الخلية في حجرة الخلية. افتح قضيب التوقف حتى تتدفق الخلايا ببطء إلى غرفة الترسيب بمعدل 10 ملليلتر في الدقيقة. ثم أغلق قضيب الإيقاف لغسل الخلايا خارج غرفة الخلية.

صب خمسة ملليلتر من محلول BSA 0.5٪ وصفيها في غرفة الترسيب بمعدل 10 مل في الدقيقة. أغلق المحبس وكرر غسل BSA أربع مرات أخرى. الآن افتح المشابك بين غرفة الخلية والأسطوانات التي يبلغ حجمها لترين لتصريف السائل على الفور في غرفة الترسيب بمعدل 40 مل في الدقيقة ، واضبط معدل التدفق بحيث يستغرق الأمر حوالي 20 إلى 30 دقيقة لتحميل تدرج BSA في غرفة الترسيب.

راقب وجود طبقة رقيقة غير مضطربة من الخلايا ملقاة فوق تدرج BSA. بمجرد تحميل معظم BSA ، أغلق قضيب الإيقاف وقم بتحويله إلى الموضع الذي يسمح للسائل بالتصريف من غرفة الترسيب إلى أنبوب التجزئة. الآن قم بإيقاف تشغيل ألواح التحريك والسماح للخلايا بالترسيب لمدة ساعة و 45 دقيقة.

بعد اكتمال الترسيب ، قم بتوصيل أنبوب الكسر بمجمع الكسر. اضبط معدل التدفق باستخدام قضيب التوقف بحيث يتم جمع 10 ملليلتر لكل أنبوب تجميع كل 45 ثانية. بمجرد جمع جميع الكسور ، قم بتحليل الكسور مجهريا لمجموعات الخلايا المختلفة.

يمكن تمييز أنواع الخلايا المختلفة بناء على حجم الخلية والتشكل النووي لتحديد نقاء كل جزء. انقل 10 ميكرولترات من الخلايا الملطخة ب DPI إلى شريحة. ضع زلة غطاء وقم بتحليلها بالمجهر الفلوري.

اسحب الكسور المتشابهة في الحجم والتشكل النووي لإنشاء مجموعات من الخلايا. تحضير نموذجي لحوالي 22 خصيت. مع هذا بقاء يضع إجراء ينتج تقريبا 10 إلى الثامنة خلايا.

يمكن تحليل كسور نوع الخلية الميتجانية Perper بسرعة باستخدام مزيج من المجهر الضوئي والفلورسنت. الخلايا العضلية المنوية والخلايا ثنائية الصبغيات الجسدية هي أكبر الخلايا الموجودة في الخصيتين وستحتوي على نوى كبيرة تلطخ بشكل متجانس نسبيا بنقطة في البوصة. المنوية المستديرة هي خلايا أصغر ذات نوى مستديرة أصغر ، وبشكل عام مع مركز كروموي ملطخ بألوان زاهية ، المنوية الممدودة هي خلايا صغيرة لها نوى على شكل منجل.

بمجرد دمج كسور الخلايا ، يمكن تحديد النقاء بشكل أكبر عن طريق تحليل الدم الغربي للخلايا المحللة. العلامات الشائعة للخلايا العضلية هي بروتينات مجمع المشبك نيل واحدة. العلامات الشائعة لتكثيف المنوية هي البروتينات الانتقالية أو البروتامين.

بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في سبع ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح بعد تطويرها. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال تكوين المنوية لاستكشاف العمليات الخلوية في أنواع مختلفة من الخلايا من الخصيتين.