عبر التشابك تتبع من الأهداف الطرفية مع فيروس داء الكلب الكاذب تلاه سهم الكوليرا السمية والمعقدة البيروكسيديز ديكستران الأمينات مزدوجة وصفها

الهدف العام من هذا الإجراء هو اكتشاف الشبكة الحركية المركزية للخلايا الموزعة التي تصطدم بهدف محيطي معين ثم تأكيد الروابط المحددة بين تلك الخلايا في الدماغ. يتم تحقيق ذلك عن طريق إصابة الدوائر الحركية السابقة للرجوع أولا بناقل فيروسي عبر التشابك يتم توصيله محيطيا عبر العضلات. الخطوة الثانية من الإجراء هي تصور الخلايا المصابة بالفحص المجهري الفلوري الخفيف.

تتمثل الخطوة الثالثة في تأكيد اتصالات محددة في الدماغ عن طريق حقن أجهزة تتبع متشابكة أحادية تستهدف العقد المحددة مسبقا في دائرة ما قبل الحركة. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج كيف ترتبط الخلايا في شبكة ما قبل الحركية الموزعة ببعضها البعض من خلال مزيج من التتبع الفيروسي عبر التشابك ، والتقنيات التشريحية العصبية التقليدية أحادية التشابك. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل التتبع العصبي المشبكي الأحادي التقليدي ، هي أنه يمكن تحديد عقد الشبكة العصبية الموزعة ويمكن حل الروابط المحددة بين الخلايا في تلك الشبكة على فأر مخدر.

جهز موقع الجراحة عن طريق تقليم الشعر وتطهير الجلد بثلاثة مقشرات متناوبة على الأقل من البيتادين و 70٪ كحول. الآن قم بعمل شق جلدي في منطقة الحلق واكشف عن العضلات ذات الاهتمام. على سبيل المثال ، للوصول إلى العضلة الحنجرية الحلقية للغدة الدرقية ، من الضروري أولا إزالة الجزء العلوي من العضلات اللامية القصية التي تغلق أي عضلات عابرة باستخدام مادة لاصقة لأنسجة السندات البيطرية.

بعد ذلك ، قم بتحميل نظام الحقنة الدقيقة سعة 10 ميكرولتر بمحلول PR RV المذاب حديثا. قم بتنظيف المساحة الميتة ببطء وتحقق من خروج المحلول من طرف المحقنة الصغيرة. تخلص من السائل كنفايات خطرة بيولوجيا وقم بتثبيته بعناية على الجهاز التجسيمي.

باستخدام جهاز تحديد المواقع الجزئي ، ضع طرف الإبرة بعناية في العضلة ذات الاهتمام. ثم املأ العضلات ببطء حتى يظهر تورم طفيف. الآن انقل المحقنة إلى العضلة التالية ذات الأهمية ، الحلقي الحلقي الجانبي في هذه الحالة وكرر.

إجراء الحقن ثقب كل عضلة فقط. مرة واحدة معدل الحقن سوف تختلف تبعا لحجم العضلات وحجم الحقن. على سبيل المثال ، يجب إجراء خمس حقن من 200 نانولتر بمعدل أربعة نانولتر في الثانية على بعد دقيقة واحدة في نفس الموقع لملء عضلة الغدة الدرقية.

بعد سحب المحقنة الدقيقة ، أغلق الكسر في اللفافة باستخدام لاصق أنسجة السندات البيطرية. بمجرد الانتهاء من جميع الحقن ، أغلق الجرح باستخدام لاصق الأنسجة البيطرية. راقب حتى يظهر مستلقيا قصيا.

ثم قدم التسكين والطعام والماء والرعاية كما هو مطلوب من قبل حيوانك المؤسسي. استخدام الإرشادات. يتم تغطية إجراء تحليل تعبير EGFP والخلايا العصبية المصابة ب PRV بالتفصيل في بروتوكول النص.

تشبه معالجة الأنسجة إلى حد بعيد تلك التي يتم تناولها لاحقا في هذا الفيديو. ابدأ بتخدير الفأر البالغ لحماية عينيه وتحديد موضع رأسه. ثم قم بإعداد موقع الجراحة كما هو موضح سابقا مع مقشرات متناوبة من البيتادين و 70٪ كحول.

الآن قم بعمل شق في فروة الرأس وسحب فروة الرأس فوق الدماغ. منطقة الاهتمام. قم بإجراء حج صغير من القحف باستخدام المثقاب عند الإحداثيات التجسيمية المناسبة.

على سبيل المثال ، إحداثيات القشرة الحركية المتصلة بالحنجرة التي تم تحديدها بواسطة تتبع PRV في فأر بالغ هي 1.2 ملم جانبي و 0.2 ملم منقاري إلى BGMA. بعد ذلك ، قم بإعداد محلول 7.5٪ من أمينات ديكستران البيوتينيل في ماء معقم. ثم قم بتحميل نظام الماصات الصغيرة النانو النفاثة بمحلول BDA كاف للحقن المخطط لها.

قم بتنظيف المساحة الميتة ببطء وتحقق من خروج المحلول من طرف الماصة الصغيرة. باستخدام جهاز تحديد المواقع الدقيق، اخفض طرف الماصة الدقيقة بعناية في منطقة الدماغ التي تهمك وحقن محلول BDA ببطء. اضبط المعدل حسب حجم المنطقة المراد تسميتها

على سبيل المثال ، يجب إجراء 12 حقنة سعة 4.6 نانولتر في أربعة مواقع مختلفة. 0.2 ملليمتر. Stro coddle لتغطية القشرة الحركية المتصلة بالحنجرة في فأر بالغ.

يجب تعديل حجم الحقن النهائي وفقا لحجم منطقة الاهتمام. مع الأخذ في الاعتبار أن التسمية قد تنتشر من قلب الحقن من خلال أنسجة المخ وعلى طول عمليات الخلايا العصبية المسماة. نظف حج القحف المبلله بمحلول ملحي معقم وأغلق جرح فروة الرأس باستخدام لاصق مناديل السندات البيطرية.

راقب حتى يظهر مستلقيا قصيا. ثم قدم التسكين والطعام والماء والرعاية كما هو مطلوب من قبل حيوانك المؤسسي. استخدام الإرشادات.

بعد ستة أيام ، يمكن حقن الوحدة الفرعية لسم الكوليرا B في عضلة. ثم في غضون ثلاثة أيام ، يجب التضحية بالحيوان للتحليل. قم بقطع الأقسام عند 40 ميكرون على ناظم البرد وحفظ الأقسام العائمة في 0.1 مولار PBS لإخماد الأقسام بنسبة 0.3٪ بيروكسيد الهيدروجين في PBS لمدة 30 دقيقة مع الاهتزاز والحماية من الضوء.

اغسل الأقسام ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة. ثم تفاعل معهم لمدة ساعة في محلول A b ، C المحضر حديثا في درجة حرارة الغرفة. الآن اغسل الأقسام ثلاث مرات في عازلة الفوسفات لمدة 10 دقائق لكل غسلة.

ثم قم بتطوير الأقسام لمدة ثماني دقائق مع التحريض في عازلة الفوسفات. الرقم الهيدروجيني 7.4 يحتوي على بيروكسيد الهيدروجين DAB وكلوريد النيكل. يجب أن يظهر منتج تفاعل DAB داخل الخلايا باللون الأسود.

بعد ذلك ، قم بحظر الأقسام أثناء الاهتزاز لمدة 30 دقيقة في PBS الذي يحتوي على 0.3٪ tween 20 مع مصل الأرانب العادي من مجموعة النخبة للبقع المتجهة. بعد ذلك ، احتضان الأقسام المسدودة في الماعز المضادة ل CTB مع الرج لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الأقسام ثلاث مرات أخرى في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة.

ضع الجسم المضاد المضاد الثانوي للأرانب من مجموعة VE واحتضان الأقسام أثناء الرج لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقسام ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل غسلة ثم تفاعلها لمدة 30 دقيقة في محلول A و b و C المحضر حديثا في درجة حرارة الغرفة. اغسل الأقسام ثلاث مرات في عازلة الفوسفات لمدة 10 دقائق واحتضن الأقسام لمدة ثماني دقائق.

في محلول التطوير ، يجب أن يظهر منتج تفاعل DAB داخل الخلايا باللون البني. الآن قم بتركيب الأقسام على الصقيع الفائق بالإضافة إلى الشرائح على الشرائح ، وقم بتجفيف الأنسجة من خلال سلسلة الكحول المتدرجة ، متبوعة بغسلتين للمقاصة في الزيلين. ثم قم بتغطية الشرائح مع الأولوية والمضي قدما في التصوير.

يجب أن يبدأ تلطيخ EGFP في إظهار إشارة ضعيفة في الخلايا العصبية الحركية الأولية بعد 72 ساعة من حقن P RV 1 52 مع تلطيخ يصبح قويا بعد 90 ساعة. هذه النواة الغامضة ، التي تضم الخلايا العصبية الحركية للحنجرة ، تظهر بعد 94 ساعة من حقن P RV 1 52 في اثنتين من عضلات الحنجرة السبعة. لأن الفيروس دخل الدماغ من خلال الخلايا العصبية التي تغذي العضلات المصابة.

لا تعبر تجمعات الخلايا العصبية الحركية الإلزامية الأخرى مثل النواة تحت اللسان عن EGFP بعد 90 ساعة. يمكن رؤية EGFP في خلايا الدرجة الثانية. تم تلطيخ هذه الخلايا العصبية في جذع الدماغ بعد العدوى الأولية في النواة الغامضة.

كان الحقن أحادي الجانب ويظهر النمط الناتج من الملصق في جذع الدماغ إصابة النواة المماثلة. كما أصيبت الخلايا العصبية الشبكية الغامضة والمفردة بالعدوى وصمة عار بشدة ل EGFP. تربط هذه الخلايا العصبية البينية بهياكل مختلفة بما في ذلك تجمعات الخلايا العصبية الحركية الإلزامية والنواة المقابلة. غامضه.

ومع ذلك ، تظل أهدافهم الصادرة غير مصنفة لأن الفيروس ينتشر فقط في الاتجاه الرجعي. وقت البقاء على قيد الحياة مع PRV محدود ، ولكن يمكن أن يظهر تلطيخ EGFP في الخلايا الثالثة والعليا المصابة بالخلايا العصبية قبل الحركية في القشرة الحركية المعبر عنها EGFP مقابل موقع الحقن المحيطي. من المفترض أن عدد الخلايا التي تتكون من التمثيل القشري الحركي للعضلات الحنجرية فقط هم من المصابين.

محاور BDA المسماة على مستوى النواة الغامضة التي تتميز برؤوس الأسهم ، وتتواصل مع الخلايا العصبية الحركية الإيجابية CTB إلى الوراء المسمى عن طريق الحقن في عضلات الحنجرة التي تظهر باللون البني ، وتشكل المحاور الدوالي والهراوات الطرفية المفترضة بالقرب من تشعبات الخلايا العصبية الحركية الحنجرية وبالقرب من سوما الخلايا العصبية الحركية الحنجرة. هناك حاجة إلى مزيد من التجارب باستخدام المجهر الإلكتروني أو الفيزيولوجيا الكهربية لتحديد ما إذا كانت هذه الدوالي تمثل متشابك. يظهر الحقن الثنائي من BDA الذي يتم وضعه في القشرة الحركية المتصلة بالحنجرة باللون الأسود لأن BDA ليس محددا اتجاهيا ، ويمكن تصنيف كل من الوصلات الواردة والصادرة.

على سبيل المثال ، يظهر كل من مجال الإسقاط للعلامة الأمامية وأجسام الخلايا المسماة بالارتجاع في المهاد. يتم التعرف على الخلايا الماثلية بواسطة رأس السهم ويتم تصنيف الكبسولة الداخلية للتوجيه. لا تنس أن العمل مع فيروس داء الزائف و DAB يمكن أن يكون خطيرا للغاية واحتياطات مثل التعقيم.

جميع المواد التي كانت على اتصال مع PRV أو DAB باستخدام محلول التبييض بنسبة 10٪. يجب دائما اتخاذ التخلص المناسب من النفايات الصلبة والسائلة الخطرة بيولوجيا وفقا للوائح مؤسستك أثناء تنفيذ هذا الإجراء.