مقدمة في عملية عفن الخلية (Transfection)
عملية ترانسفكشن (Transfection) هي عملية إدخال المادة الوراثية، مثل DNA و RNA مزدوج السلسلة، إلى خلايا الثدييات. يتيح إدخال DNA إلى الخلية التعبير عن ا…
عملية ترنسفكشن (Transfection) هي عملية إدخال المادة الوراثية، مثل DNA وRNA مزدوج السلاسل، إلى الخلايا الثديية. يتيح إدخال DNA التعبير عن البروتينات، أو إنتاجها، باستخدام الآليات الخلوية الخاصة بالخلية. بينما يُستخدم إدخال RNA مزدوج السلاسل لإيقاف إنتاج بروتين معين عن طريق منع عملية الترجمة. وقد مكنت هذه الأداة القوية الباحثين من دراسة وظيفة الجينات وتعبيرها، ووظيفة البروتين، والطفرات الجينية بشكل أفضل.
لا يوجد كاشف أو طريقة ترنسفكشن واحدة تصلح لجميع أنواع الخلايا. ولحسن الحظ، تم تطوير العديد من الطرق والكواشف في العقود القليلة الماضية لتسهيل عملية الترنسفكشن لمجموعة واسعة من الخلايا. ويمكن تقسيم هذه الطرق إلى مجموعتين رئيسيتين: الترنسفكشن الكيميائي والفيزيائي.
سنركز في هذا الفيديو على أنظمة التوصيل الكيميائية المختلفة، نظرًا لزيادة شيوعها في السنوات الأخيرة. وتشمل هذه الطرق النهج القائم على الليبيدات، والترنسفكشن بوساطة فوسفات الكالسيوم، واستخدام البوليمرات الكاتيونية، على سبيل المثال لا الحصر.
تتشابه المبادئ الأساسية لجميع طرق عفن transfection الكيميائية؛ حيث تعتمد جميعها على استخدام جزيئات حاملة موجبة الشحنة ترتبط بالأحماض النووية لتغليفها من أجل إيصالها إلى داخل الخلية. وتعمل هذه الجزيئات الحاملة على التغلب على الشحنة السالبة لحاجز الغشاء الخلوي، مما يسمح لها بالمرور عبر الغشاء لإيصال محتوياتها.
في عملية transfection الدهون، تشكل الدهون الكاتيونية ليبوزومًا يندمج بعد ذلك مع الأحماض النووية لتكوين "معقد transfection". بينما يقوم فوسفات الكالسيوم ببساطة بتكثيف الـ DNA ومنحه شحنة موجبة صافية. بالإضافة إلى ذلك، تقوم البوليمرات الكاتيونية مثل polyethyleneimine بتكثيف الـ DNA إلى جزيئات موجبة الشحنة.
الخطوة التالية في عملية transfection بوساطة كيميائية هي ارتباط المعقدات موجبة الشحنة بغشاء الخلية سالب الشحنة من خلال التجاذب الإلكتروستاتيكي البسيط.
بعد ذلك، يدخل المعقد إلى الخلية عبر عملية الالتقام الخلوي (endocytosis)، وهي عملية تدخل من خلالها الجزيئات إلى الخلية عبر حويصلات مرتبطة بالغشاء تسمى الإندوزومات (endosomes).
وبمجرد دخولها إلى الخلية، يجب أن تهرب الأحماض النووية من الإندوزوم عبر عملية لا تزال غير معروفة. وبمجرد خروجها من الإندوزوم، ستنتقل الأحماض النووية إلى سيتوبلازم الخلية ثم في النهاية إلى النواة، حيث تستطيع آليات الخلية تصنيع mRNA ثم تصنيع البروتين منه. ويعد السيتوبلازم موقع عمل الحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير (siRNA)، حيث يقوم بتقليل إنتاج البروتين عن طريق التداخل مع جزء من آليات إنتاج البروتين في الخلية.
يمكن أن يتواجد الـ DNA الذي تم نقل عبر transfection إما بشكل مستقر أو عابر. تحدث عمليات transfection المستقرة عندما يتم إدخال الـ DNA المنقول في الجينوم وبالتالي يستمر مع انقسام الخلية. أما عمليات transfection العابرة فتحدث عندما لا يتم دمج الـ DNA في الجينوم، ويفقد التعبير عن البروتين المشفر خلال فترة تتراوح بين 24-96 ساعة تقريبًا.
يتم قياس كفاءة transfection الـ DNA عادةً من خلال أنظمة مراسلة (reporter systems) مرتبطة بالجين المُدخل. وهذه أنظمة يمكن اكتشافها بسهولة إما عن طريق المراقبة المباشرة لبروتين المراسلة نفسه، كما هو الحال في حالة البروتين الفلوري الأخضر، أو عن طريق قياس نشاطه الإنزيمي باستخدام مقايسة قياس الألوان، كما هو الحال في حالة إنزيم luciferase المراسِل. وأفضل طريقة لقياس transfection الـ DNA المستقر هي التحليل الجينومي مثل RT-PCR.
لقياس نجاح إسكات siRNA، يمكن تحديد مستويات البروتين المستهدف في كل عينة عن طريق Immunoblot. ويجب أن يؤدي نجاح عملية transfection لـ siRNA إلى خفض تعبير البروتين المستهدف داخل الخلايا، بينما تظل مستويات الجين المرجعي (housekeeping gene)، GAPDH، مستقرة.
لتحقيق أقصى قدر من كفاءة عفن الخلايا (transfection)، يجب الحفاظ على الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمية، وأن تكون نسبة تلاقي الخلايا (confluence) ما بين 40 و80% في وقت عملية العفن. ولتحقيق ذلك، يجب حصاد الخلايا المستزرعة في اليوم السابق... وعدّها... ثم استزراعها في طبق متعدد الآبار بتركيز يضمن الوصول إلى المستوى الصحيح من تلاقي الخلايا في وقت عملية العفن.
بعد ذلك، يتم خلط الكواشف الكيميائية والأحماض النووية وتركها لفترة زمنية كافية لتكوين معقدات الحمض النووي والكاشف. ويجب تحسين التركيزات المحددة لكل مكون لكل نظام توصيل كيميائي.
ثم تُضاف معقدات الحمض النووي والكاشف إلى الخلايا المستزرعة في الأطباق وتُحضن، غالباً طوال الليل، لإعطاء وقت كافٍ للمعقدات للارتباط بالخلايا وتسهيل عملية العفن. وبعد مرور 24 ساعة، يجب إزالة الوسط الغذائي واستبداله بوسط استزراع جديد.
توجد العديد من التنويعات والتطبيقات لعملية عفن الخلايا (transfection). إذ يمكن أن يسمح عفن الخلايا المشترك (Co-transfection) للباحث بدراسة تأثير الطفرات المغلطة (missense mutations) على وظيفة البروتينات الخلوية. في هذه التجربة، تم إدخال RNAi في خلايا HeLa من أجل تثبيط تعبير بروتين BRCA1 الداخلي، مما يؤدي إلى انخفاض في عدد الخلايا الموجبة لـ GFP. وفي الوقت ذاته، تم أيضاً إدخال بروتين BRCA1 طافر لتقوم الخلية بإنتاجه. فإذا كان البروتين الطافر يعمل بكامل كفاءته، فإنه يؤدي إلى استعادة عدد الخلايا الموجبة لـ GFP، أما إذا كانت الطفرة قد أثرت سلباً على الوظيفة، فإن عدد الخلايا الموجبة لـ GFP يظل منخفضاً.
كبديل لطرق عفن الخلايا الكيميائية، يستخدم الباحث، كما هو موضح هنا، مسدس الجينات (gene gun) لإطلاق جزيئات ذهبية مغلفة بـ DNA على خلايا في المزرعة. وتكون الخلايا التي تستقر بداخل سيتوبلازمها هذه الطلقات الصغيرة المغلفة بـ DNA معرضة لفرصة جيدة ليحدث لها عفن خلايا.
وهناك طريقة بديلة أخرى لعفن الخلايا وهي التثقيب الكهربائي (electroporation). التثقيب الكهربائي هو استخدام تيار كهربائي لإحداث ضرر في غشاء الخلية، مما يسمح لـ DNA أو RNA بدخول الخلية لفترة وجيزة قبل أن تتاح للخلايا فرصة الإصلاح. هنا، يتم وضع أقطاب كهربائية ملقطية حول دماغ فأر، وتمر نبضات كهربائية قصيرة عبر الدماغ لبدء عملية عفن الخلايا خارج الجسم (ex-vivo transfection) لجزيئات RNAi المحقونة داخل المحلول الأزرق. ثم يتم بعد ذلك رصد آثار إسكات الجينات على بنية القشرة الدماغية النامية.
لقد شاهدتم للتو فيديو JoVE حول عملية التعدي (transfection). وكما هو الحال دائماً، شكراً للمشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
عملية ترنسفكشن (Transfection) هي عملية إدخال المادة الوراثية، مثل DNA وRNA مزدوج السلاسل، إلى الخلايا الثديية. يتيح إدخال DNA التعبير عن البروتينات، أو إنتاجها، باستخدام الآليات الخلوية الخاصة بالخلية. بينما يُستخدم إدخال RNA مزدوج السلاسل لإيقاف إنتاج بروتين معين عن طريق منع عملية الترجمة. وقد مكنت هذه الأداة القوية الباحثين من دراسة وظيفة الجينات وتعبيرها، ووظيفة البروتين، والطفرات الجينية بشكل أفضل.
لا يوجد كاشف أو طريقة ترنسفكشن واحدة تصلح لجميع أنواع الخلايا. ولحسن الحظ، تم تطوير العديد من الطرق والكواشف في العقود القليلة الماضية لتسهيل عملية الترنسفكشن لمجموعة واسعة من الخلايا. ويمكن تقسيم هذه الطرق إلى مجموعتين رئيسيتين: الترنسفكشن الكيميائي والفيزيائي.
سنركز في هذا الفيديو على أنظمة التوصيل الكيميائية المختلفة، نظرًا لزيادة شيوعها في السنوات الأخيرة. وتشمل هذه الطرق النهج القائم على الليبيدات، والترنسفكشن بوساطة فوسفات الكالسيوم، واستخدام البوليمرات الكاتيونية، على سبيل المثال لا الحصر.
تتشابه المبادئ الأساسية لجميع طرق عفن transfection الكيميائية؛ حيث تعتمد جميعها على استخدام جزيئات حاملة موجبة الشحنة ترتبط بالأحماض النووية لتغليفها من أجل إيصالها إلى داخل الخلية. وتعمل هذه الجزيئات الحاملة على التغلب على الشحنة السالبة لحاجز الغشاء الخلوي، مما يسمح لها بالمرور عبر الغشاء لإيصال محتوياتها.
في عملية transfection الدهون، تشكل الدهون الكاتيونية ليبوزومًا يندمج بعد ذلك مع الأحماض النووية لتكوين "معقد transfection". بينما يقوم فوسفات الكالسيوم ببساطة بتكثيف الـ DNA ومنحه شحنة موجبة صافية. بالإضافة إلى ذلك، تقوم البوليمرات الكاتيونية مثل polyethyleneimine بتكثيف الـ DNA إلى جزيئات موجبة الشحنة.
الخطوة التالية في عملية transfection بوساطة كيميائية هي ارتباط المعقدات موجبة الشحنة بغشاء الخلية سالب الشحنة من خلال التجاذب الإلكتروستاتيكي البسيط.
بعد ذلك، يدخل المعقد إلى الخلية عبر عملية الالتقام الخلوي (endocytosis)، وهي عملية تدخل من خلالها الجزيئات إلى الخلية عبر حويصلات مرتبطة بالغشاء تسمى الإندوزومات (endosomes).
وبمجرد دخولها إلى الخلية، يجب أن تهرب الأحماض النووية من الإندوزوم عبر عملية لا تزال غير معروفة. وبمجرد خروجها من الإندوزوم، ستنتقل الأحماض النووية إلى سيتوبلازم الخلية ثم في النهاية إلى النواة، حيث تستطيع آليات الخلية تصنيع mRNA ثم تصنيع البروتين منه. ويعد السيتوبلازم موقع عمل الحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير (siRNA)، حيث يقوم بتقليل إنتاج البروتين عن طريق التداخل مع جزء من آليات إنتاج البروتين في الخلية.
يمكن أن يتواجد الـ DNA الذي تم نقل عبر transfection إما بشكل مستقر أو عابر. تحدث عمليات transfection المستقرة عندما يتم إدخال الـ DNA المنقول في الجينوم وبالتالي يستمر مع انقسام الخلية. أما عمليات transfection العابرة فتحدث عندما لا يتم دمج الـ DNA في الجينوم، ويفقد التعبير عن البروتين المشفر خلال فترة تتراوح بين 24-96 ساعة تقريبًا.
يتم قياس كفاءة transfection الـ DNA عادةً من خلال أنظمة مراسلة (reporter systems) مرتبطة بالجين المُدخل. وهذه أنظمة يمكن اكتشافها بسهولة إما عن طريق المراقبة المباشرة لبروتين المراسلة نفسه، كما هو الحال في حالة البروتين الفلوري الأخضر، أو عن طريق قياس نشاطه الإنزيمي باستخدام مقايسة قياس الألوان، كما هو الحال في حالة إنزيم luciferase المراسِل. وأفضل طريقة لقياس transfection الـ DNA المستقر هي التحليل الجينومي مثل RT-PCR.
لقياس نجاح إسكات siRNA، يمكن تحديد مستويات البروتين المستهدف في كل عينة عن طريق Immunoblot. ويجب أن يؤدي نجاح عملية transfection لـ siRNA إلى خفض تعبير البروتين المستهدف داخل الخلايا، بينما تظل مستويات الجين المرجعي (housekeeping gene)، GAPDH، مستقرة.
لتحقيق أقصى قدر من كفاءة عفن الخلايا (transfection)، يجب الحفاظ على الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمية، وأن تكون نسبة تلاقي الخلايا (confluence) ما بين 40 و80% في وقت عملية العفن. ولتحقيق ذلك، يجب حصاد الخلايا المستزرعة في اليوم السابق... وعدّها... ثم استزراعها في طبق متعدد الآبار بتركيز يضمن الوصول إلى المستوى الصحيح من تلاقي الخلايا في وقت عملية العفن.
بعد ذلك، يتم خلط الكواشف الكيميائية والأحماض النووية وتركها لفترة زمنية كافية لتكوين معقدات الحمض النووي والكاشف. ويجب تحسين التركيزات المحددة لكل مكون لكل نظام توصيل كيميائي.
ثم تُضاف معقدات الحمض النووي والكاشف إلى الخلايا المستزرعة في الأطباق وتُحضن، غالباً طوال الليل، لإعطاء وقت كافٍ للمعقدات للارتباط بالخلايا وتسهيل عملية العفن. وبعد مرور 24 ساعة، يجب إزالة الوسط الغذائي واستبداله بوسط استزراع جديد.
توجد العديد من التنويعات والتطبيقات لعملية عفن الخلايا (transfection). إذ يمكن أن يسمح عفن الخلايا المشترك (Co-transfection) للباحث بدراسة تأثير الطفرات المغلطة (missense mutations) على وظيفة البروتينات الخلوية. في هذه التجربة، تم إدخال RNAi في خلايا HeLa من أجل تثبيط تعبير بروتين BRCA1 الداخلي، مما يؤدي إلى انخفاض في عدد الخلايا الموجبة لـ GFP. وفي الوقت ذاته، تم أيضاً إدخال بروتين BRCA1 طافر لتقوم الخلية بإنتاجه. فإذا كان البروتين الطافر يعمل بكامل كفاءته، فإنه يؤدي إلى استعادة عدد الخلايا الموجبة لـ GFP، أما إذا كانت الطفرة قد أثرت سلباً على الوظيفة، فإن عدد الخلايا الموجبة لـ GFP يظل منخفضاً.
كبديل لطرق عفن الخلايا الكيميائية، يستخدم الباحث، كما هو موضح هنا، مسدس الجينات (gene gun) لإطلاق جزيئات ذهبية مغلفة بـ DNA على خلايا في المزرعة. وتكون الخلايا التي تستقر بداخل سيتوبلازمها هذه الطلقات الصغيرة المغلفة بـ DNA معرضة لفرصة جيدة ليحدث لها عفن خلايا.
وهناك طريقة بديلة أخرى لعفن الخلايا وهي التثقيب الكهربائي (electroporation). التثقيب الكهربائي هو استخدام تيار كهربائي لإحداث ضرر في غشاء الخلية، مما يسمح لـ DNA أو RNA بدخول الخلية لفترة وجيزة قبل أن تتاح للخلايا فرصة الإصلاح. هنا، يتم وضع أقطاب كهربائية ملقطية حول دماغ فأر، وتمر نبضات كهربائية قصيرة عبر الدماغ لبدء عملية عفن الخلايا خارج الجسم (ex-vivo transfection) لجزيئات RNAi المحقونة داخل المحلول الأزرق. ثم يتم بعد ذلك رصد آثار إسكات الجينات على بنية القشرة الدماغية النامية.
لقد شاهدتم للتو فيديو JoVE حول عملية التعدي (transfection). وكما هو الحال دائماً، شكراً للمشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the difference between transfecting DNA and RNA into cells?
DNA transfection enables protein expression using the cell's machinery, while RNA transfection, particularly double-stranded RNA or siRNA, shuts down specific protein production by stopping translation. DNA must reach the nucleus for effective expression, whereas RNA acts in the cytoplasm. DNA can be stably incorporated into the genome or transiently expressed, while RNA effects are temporary.
Q2: How do chemical transfection methods deliver genetic material into cells?
Chemical transfection uses positively charged carrier molecules—such as cationic lipids, calcium phosphate, or polymers—that complex with negatively charged nucleic acids. These complexes attach to the negatively charged cell membrane through electrostatic attraction, then enter via endocytosis in membrane-bound vesicles called endosomes. The nucleic acids escape the endosome and reach their destination in the cytoplasm or nucleus.
Q3: What cell conditions optimize transfection efficiency?
Cells should be in log phase growth and between 40 and 80% confluent at transfection time. Prepare cells by harvesting them the day before, counting them, and seeding at appropriate concentration. After adding nucleic acid-reagent complexes, incubate overnight to allow attachment and transfection. Replace media with fresh culture after 24 hours to support cell recovery and gene expression.
Q4: How is transfection efficiency measured in cells?
Reporter systems tethered to inserted genes measure DNA transfection efficiency. Green fluorescent protein can be directly observed, while luciferase enzyme activity is measured using colorimetric assays. Stable transfection is verified by genomic analysis such as RT-PCR. For siRNA silencing success, immunoblot analysis determines target protein levels; successful transfection decreases target protein while housekeeping genes like GAPDH remain stable.
Q5: What is the difference between stable and transient transfection?
Stable transfection occurs when transfected DNA integrates into the genome and persists through cell division, creating permanent genetic changes. Transient transfection involves DNA that remains outside the genome, resulting in temporary protein expression lasting 24 to 96 hours before being lost. Stable transfection is measured by genomic analysis, while transient effects are detected through reporter systems.
Q6: What are alternative physical methods for transfecting cells?
Electroporation uses electrical current to temporarily damage the cell membrane, allowing DNA or RNA entry before cells repair. A gene gun fires gold particles coated with DNA directly into cells; particles reaching the cytoplasm enable transfection. These physical methods complement chemical approaches and are useful for cell types resistant to chemical reagents or for in vivo applications like brain tissue transfection.
Q7: How can co-transfection be used to study protein mutations?
Co-transfection simultaneously introduces interfering RNA and mutant DNA into the same cell. RNAi down-regulates the endogenous protein while the transfected mutant version is produced. Comparing functional outcomes—such as recovery of fluorescent reporter signals—reveals whether the mutation preserves or impairs protein function. This approach enables direct assessment of mutation effects on cellular processes.