تفاعلات ربط الحمض النووي

يمكن تعريف الربط على أنه فعل الانضمام ، وفي علم الأحياء يشير المصطلح إلى تفاعل إنزيمي يربط جزيئين حيويين برابطة تساهمية. يصف هذا الفيديو تطبيق ربط الحمض النووي في أبحاث البيولوجيا الجزيئية.

في الخلية ، فإن ليغازات الحمض النووي هي إنزيمات تحدد الفواصل في الحمض النووي وتغلقها عن طريق تحفيز تكوين روابط الفوسفوديستر بين مجموعات 3′-hydroxyl و 5′-phosphate من العمود الفقري للحمض النووي. يحدث الربط كجزء من العمليات الخلوية الطبيعية ، مثل تكرار الحمض النووي ، لإصلاح فواصل الحمض النووي أحادية ومزدوجة الخيط.

في المختبر ، يتم استخدام ليغازات الحمض النووي بشكل روتيني في الاستنساخ الجزيئي – وهي عملية تنضم إلى شظايا الحمض النووي المهضومة بالإندونوكلياز ، أو إدخالها ، مع ناقل مهضوم بدونوكلياز ، مثل البلازميد ، بحيث يمكن إدخال الجزء في الخلايا المضيفة ثم تكراره.

تتضمن عمليات الهضم النوويات الداخلية استخدام نوكليازات التقييد ، أو إنزيمات التقييد ، والتي تخلق شقوقا في امتدادات معينة من الحمض النووي.

يمكن أن تشبه هذه النكات فواصل الخيوط المفردة التي تنتج 3 ‘و 5’ متدلية ، تسمى النهايات اللاصقة أو فواصل الخيوط المزدوجة بدون نتوءات ، تسمى النهايات الحادة. يعد ربط الأطراف اللاصقة مفيدا ، لأن أزواج القواعد المتدلية المجانية تعمل على استقرار التفاعل. نظرا لأن الربط النهائي الحاد لا يحتوي على أي اقتران أساسي مجاني ، فإن الربط يكون أقل كفاءة ويصعب على الإنزيم الانضمام إلى الأطراف. لا يمكن ربط النهايات اللزجة والحادة ، في ظل الظروف العادية ، معا.

ومع ذلك ، فإن جزء Klenow ، وهو نتاج بوليميراز الحمض النووي 1 ، المهضوم باستخدام subtilisin يمكن أن يحول النهايات اللاصقة إلى نهايات حادة. يمتلك Klenow نشاط نوكلياز خارجي من 3 إلى 5 بوصات يمضغ 3 بوصات متدلية ونشاط البوليميراز الذي يخفف من 5 بوصات متدلية عن طريق تمديد نهاية 3 بوصات من الخيط التكميلي.

عندما يكون الهدف هو إدخال جين في البلازميد ، فإن إعادة ختم الحمض النووي الناقل ، المسمى الربط الذاتي ، هي نتيجة شائعة غير مرغوب فيها لتفاعل الربط. يزيل علاج الفوسفاتيز القلوي للحمض النووي الناقل بعد الهضم 5 فوسفات على كلا الطرفين ويمنع هذه النتيجة غير المرغوب فيها.

كما ذكرنا سابقا ، يتم هضم الحمض النووي المتجه والإدخاله باستخدام نوكليازات داخلية قبل بدء الربط. بعد تنقية الهلام للناقل المهضوم وإدخاله ، يتم قياس تركيزات الحمض النووي بمقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الناقل المنقى وإدخاله.

من هذا التركيز ، يمكن تحديد عدد جزيئات الإدخال أو المتجه في 1 ميكرولتر بناء على متوسط الوزن الجزيئي لزوج قاعدة الحمض النووي وعدد أزواج القواعد في كل جزء. بناء على التركيز الجزيئي المحسوب للمتجه والإدراج ، يتم حساب نسبة 3 إلى 1 من الإدخال إلى المتجه ، لتحديد حجم المتجه وإدخاله المستخدم في التفاعل. هذه النسبة 3 إلى 1 من إدخال الحمض النووي إلى المتجه مرغوبة ، لأنها تزيد من احتمالية ربط الإدخال في متجه مقابل ربط المتجه نفسه.

والآن بعد أن حددنا كمية المتجه وإدخال الحمض النووي لاستخدامه في التفاعل، ننتقل إلى إعداد تفاعل الربط على الجليد. ترتيب الإضافة التي يجب أن تضاف بها مكونات التفاعل إلى أنبوب الطرد الدقيق الخاص بك هو كما يلي: ماء معقم يكفي لتكوين حجم نهائي 10 ميكرولتر ، في حالتنا سنستخدم 4 ميكرولتر ، 1 ميكرولتر 10X من مخزن الربط ، 1 ميكرولتر 10 ملي مولار من ATP ، 1 ميكرولتر من المتجه و 3 ميكرولتر إدخال الحمض النووي ، كما تم حسابه ، وأخيرا 1 ميكرولتر DNA Ligase. يتم خلط التفاعل جيدا ، والطرد المركزي وتحضانه عند درجة الحرارة المناسبة.

سواء كنت تقوم بربط نهاية لزج أو حاد يؤثر على درجة حرارة ومدة تفاعل الربط. على سبيل المثال ، يمكن إجراء ربط نهاية لزجة مع ستة أزواج من القواعد المتدلية بالقرب من درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة تقريبا ، لأن الأطراف التكميلية تعمل على تثبيت انضمام الشظايا. يجب إجراء الأجزاء المتدلية القصيرة أو الربط النهائي الحاد بين 14-20 درجة مئوية بين عشية وضحاها.

والآن بعد أن تعلمنا كيفية إعداد تفاعل الربط، دعونا نلق نظرة على بعض تطبيقات هذا الإجراء.

يمكن استخدام الربط لإدخال شظايا مكبرة تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة في البلازميدات الخطية. هنا ترى باحثا يأخذ عينة من دماغ الفأر المجمد ، ويعزل الحمض النووي الجيني عنه ، ثم يعرضه لثنائي كبريتيت تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وهي طريقة قائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل للكشف عن الحمض النووي الميثيلي. ثم يتم ربط منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرة في البلازميد لإنشاء مكتبة من الجينات التي يتم ميثلها في تلك المنطقة المعينة من الدماغ.

يمكن استخدام الروابط لربط روابط قليل النوكليوتيدات ، التي تحتوي على مواقع ربط لبادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، لتنقية شظايا الحمض النووي. عند العمل مع عينات الورم ، يمكن للعلماء استخدام هذا النهج لتسلسل الحمض النووي الجيني للورم ، على أمل تحديد الطفرات المسببة للورم.

في هذا الفيديو ، يتم إجراء الربط على الحمض النووي المعزول من الخلايا الثابتة للفورمالديهايد ومعالجته لاحقا بإنزيم تقييد وكلينو في وجود البيوتين ، والذي يستخدم بعد ذلك لسحب الحمض النووي المربوط. ثم يتم تضخيم هذا الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والمنتجات المتسلسلة لتحديد تفاعلات الكروماتين على مقاييس مختلفة كما هو موضح.

لقد تعلمت الآن عن DNA ligase ، والمبادئ المختلفة التي ينطوي عليها إعداد الربط في المختبر ، والمشاكل والإصلاحات المحتملة والتطبيقات المختلفة للربط في أبحاث البيولوجيا الجزيئية. شكرا للمشاهدة.