تفاعلات ربط الحمض النووي (DNA)

يمكن تعريف الربط بأنه عملية دمج، وفي علم الأحياء يشير هذا المصطلح إلى تفاعل إنزيمي يربط بين جزيئين حيويين برابطة تساهمية. يصف هذا الفيديو تطبيق ربط الحمض النووي DNA في أبحاث البيولوجيا الجزيئية.

تعد إنزيمات الربط (DNA ligases) في الخلية إنزيمات تحدد الفجوات في الحمض النووي DNA وتقوم بسدها عن طريق تحفيز تكوين روابط فوسفاتية ثنائية الإستر بين مجموعات 3’-hydroxyl و 5’-phosphate في العمود الفقري للـ DNA. وتحدث عملية الربط كجزء من العمليات الخلوية الطبيعية، مثل تضاعف الـ DNA، لإصلاح كسور الحمض النووي أحادية الخيط وثنائية الخيط.

أما في المختبر، فتُستخدم إنزيمات الربط (DNA ligases) بشكل روتيني في الاستنساخ الجزيئي - وهي عملية يتم فيها ربط قطع الـ DNA المهضومة بواسطة الإنزيمات القاطعة (endonuclease)، أو القطع المدرجة، مع ناقل مهضوم بإنزيم قاطع، مثل البلازميد، بحيث يمكن إدخال القطعة في الخلايا المضيفة ثم تضاعفها.

تتضمن عمليات الهضم بإنزيمات الـ endonuclease استخدام إنزيمات التقييد (restriction endonucleases)، أو ما يُعرف بالإنزيمات القاطعة، التي تُحدث شقوقاً في مناطق محددة من الـ DNA.

يمكن أن تشبه هذه الشقوق كسور الخيط الواحد التي تنتج بروزات 3’ و 5’، وتسمى النهايات اللاصقة (sticky ends)، أو كسور الخيط المزدوج التي لا تحتوي على بروزات، وتسمى النهايات البليدة (blunt-ends). ويعد ربط النهايات اللاصقة ميزة مفيدة لأن أزواج القواعد المتقابلة في البروزات تعمل على استقرار التفاعل. وبما أن ربط النهايات البليدة يفتقر إلى أي تقابل بين أزواج القواعد، فإن عملية الربط تكون أقل كفاءة ويصعب على الإنزيم ربط النهايات. وفي الظروف العادية، لا يمكن ربط النهايات اللاصقة والبليدة معاً.

ومع ذلك، يمكن لقطعة كلينو (Klenow fragment)، وهي نتاج إنزيم DNA polymerase 1 المهضوم بواسطة سوبتيلسين (subtilisin)، تحويل النهايات اللاصقة إلى نهايات بليدة. تمتلك قطعة كلينو نشاط إنزيم exonuclease من 3’ إلى 5’ يقوم بإزالة بروزات 3’، ونشاط بوليميراز يقوم بجعل بروزات 5’ بليدة عن طريق تمديد الطرف 3’ للخيط المتمم.

عندما يكون الهدف هو إدراج جين في بلازميد، فإن إعادة ربط الـ DNA الناقل، وهو ما يسمى بالربط الذاتي (self-ligation)، يعد نتيجة غير مرغوب فيها وشائعة في تفاعل الربط. لذا فإن معالجة الـ DNA الناقل بإنزيم الفوسفاتاز القلوي (Alkaline phosphatase) بعد عملية الهضم تعمل على إزالة مجموعات 5’phosphates من كلا الطرفين وتمنع حدوث هذه النتيجة غير المرغوبة.

كما ذكرنا سابقاً، يتم هضم الحمض النووي DNA للناقل والقطعة المدرجة باستخدام إنزيمات القطع الداخلية قبل البدء في عملية الربط. وبعد تنقية الناقل والقطعة المدرجة المهضومة عبر الهلام، تُقاس تركيزات DNA باستخدام مقياس الطيف الضوئي لتحديد تركيز الناقل والقطعة المدرجة المنقاة.

وبناءً على هذا التركيز، يمكن تحديد عدد جزيئات القطعة المدرجة أو الناقل في 1 µl اعتماداً على متوسط الوزن الجزيئي لزوج القواعد في DNA وعدد أزواج القواعد في كل قطعة. وبناءً على التركيز الجزيئي المحسوب للناقل والقطعة المدرجة، يتم حساب نسبة 3 إلى 1 من القطعة المدرجة إلى الناقل، لتحديد حجم الناقل والقطعة المدرجة المستخدمين في التفاعل. تُعد نسبة 3 إلى 1 هذه من DNA القطعة المدرجة إلى الناقل مرغوبة، لأنها تزيد من احتمالية ربط القطعة المدرجة في الناقل بدلاً من ربط الناقل بنفسه.

الآن وبعد أن حددنا كمية DNA الناقل والقطعة المدرجة الواجب استخدامها في التفاعل، ننتقل إلى إعداد تفاعل الربط على الثلج. ويكون ترتيب إضافة مكونات التفاعل إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق على النحو التالي: ما يكفي من الماء المعقم للوصول إلى حجم نهائي قدره 10 µl (في حالتنا سنستخدم 4 µl)، و 1 µl من محلول الربط المنظم بتركيز 10X، و 1 µl من ATP بتركيز 10mM، و 1 µl من الناقل و 3 µl من DNA القطعة المدرجة حسب الحسابات، وأخيراً 1 µl من إنزيم DNA Ligase. يُخلط التفاعل جيداً، ثم يُوضع في جهاز الطرد المركزي ويُحضن في درجة الحرارة المناسبة.

تؤثر طبيعة عملية الربط، سواء كانت بنهايات لزجة أو نهايات بليدة، على درجة حرارة ومدة تفاعل الربط. فعلى سبيل المثال، يمكن إجراء ربط النهايات اللزجة ذات البروز المكون من ستة أزواج من القواعد في درجة حرارة قريبة من درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة تقريباً، لأن النهايات المتكاملة تعمل على استقرار ربط القطع. أما في حالة البروزات القصيرة أو ربط النهايات البليدة، فيجب إجراء العملية في درجة حرارة تتراوح بين 14-20˚C طوال الليل.

بعد أن تعلمنا كيفية إعداد تفاعل الربط، دعونا نلقي نظرة على بعض تطبيقات هذا الإجراء.

يمكن استخدام تفاعلات الربط لإدراج القطع المُضخمة بواسطة PCR مباشرة في البلازميدات الخطية. تظهر هنا باحثة تأخذ عينة من دماغ فأر مجمد، وتعزل منها DNA جينومي، ثم تخضعه لـ bisulfite PCR، وهي طريقة تعتمد على PCR للكشف عن DNA الميثيلي. بعد ذلك، يتم ربط نواتج PCR مباشرة في البلازميد لإنشاء مكتبة من الجينات الميثيلية في تلك المنطقة المحددة من الدماغ.

يمكن استخدام تفاعلات الربط لإلحاق روابط oligonucleotide، التي تحتوي على مواقع ارتباط لبادئات PCR، وذلك لتنقية قطع DNA. وعند العمل مع عينات الأورام، يمكن للعلماء استخدام هذا النهج لتسلسل DNA الجينومي للورم، على أمل تحديد الطفرات المسببة للأورام.

في هذا الفيديو، يتم إجراء عملية الربط على DNA معزول من خلايا مثبتة بالفورمالديهايد وعولجت لاحقاً بإنزيم قطع و klenow في وجود البيوتين، والذي يُستخدم بعد ذلك لسحب DNA المربوط. ثم يتم تضخيم هذا DNA باستخدام PCR وتحديد تسلسل النواتج لتحديد تفاعلات الكروماتين بمقاييس مختلفة كما هو موضح.

لقد تعلمت الآن عن إنزيم DNA ligase، والمبادئ المختلفة المتبعة لإجراء عملية الربط في المختبر، والمشكلات المحتملة وكيفية حلها، والتطبيقات المتنوعة لعملية الربط في أبحاث البيولوجيا الجزيئية. شكراً للمشاهدة.