ميكرون على نطاق بصري القرار المقطعي من أدمغة فئران كاملة مع متحد البؤر المجهري الخفيفة ورقة

في هذه المادة ونحن تصف الإجراء التجريبي الكامل لإعادة بناء، مع ارتفاع القرار، وتشريح الدماغ غرامة من أدمغة فئران fluorescently المسمى. ويشمل البروتوكول وصف إعداد العينات وتبادل المعلومات، وعينة تصاعد التصوير، وبعد تجهيز البيانات والتصور متعددة النطاق.

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة بناء وتصور دماغ فأر كامل بدقة مقياس ميكرون. يتم تحقيق ذلك عن طريق التجفيف الأول ، وهو عبارة عن سلسلة رباعية السطوح المدمجة لدماغ الفأر الثابت. الخطوة الثانية هي مسح العينة في Benzyl Ether.

بعد ذلك ، يتم تصوير الدماغ بمجهر ورقة ضوئية متحد البؤر. الخطوة الأخيرة هي استخدام البرنامج لمحاذاة مجموعات الصور المكتسبة ودمجها معا. في النهاية ، يمكن استخدام أداة تصور متعددة الدقة للتنقل في حجم الصورة المعاد بناؤها.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية لطرق أخرى مثل البؤر متحد البؤر أو الفحص المجهري للصور هي أن الحجم الكامل لدماغ الفأر يمكن أن يكون صورة في غضون أيام قليلة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال علم الأعصاب ، مثل توزيع أنواع الخلايا العصبية المختلفة في جميع أنحاء الدماغ. هل يوفر هذا الغطاء المعدني نظرة ثاقبة لاستقلالية الدماغ الدقيقة؟

يمكن تطبيقه أيضا على أجنة الفئران أو ذباب القدم ، مما يدل على أن الإجراء سيتم إعادة تشغيله. طالب دراسات عليا من مختبري. لبدء هذا البروتوكول ، قم بإجراء التثبيت القياسي لأدمغة الفئران عن طريق نضح القلب العابر وبعده طوال الليل قبل إجراء الجفاف والتنظيف.

ثم نظرا لأن مذيب الجفاف ، يقوم THF بإخماد مضان XFP بقوة لإجراء الترشيح لإزالة البيروكسيدات بأكسيد الألومنيوم المنشط الأساسي باستخدام عمود كروماتوغرافيا ، وتجنب تكسير العمود ، مما يقلل من إزالة البيروكسيد عند مثبت للمحلول النهائي. حتى إذا كان THF قد استقر بالفعل قبل الترشيح ، الاحتفاظ بالمثبت بواسطة أكسيد الألومنيوم. لاحظ أن THF بدون مثبت قد يطور كميات كبيرة من البيروكسيدات ويمكن أن يكون متفجرا وخطيرا.

بعد ذلك ، قم بتجفيف السلسلة المتكاملة لدماغ الفأر بالكامل من THF في الماء النقي. ثم ضع القارورة مع العينة على عجلة دوارة لتجنب التعرض للضوء. لف القارورة بورق الألمنيوم.

أخيرا ، قم بتصفية مذيب المقاصة بأكسيد الألومنيوم باستخدام قمع ترشيح. ثم امسح العينة بنسبة 100٪ DBE ، وقم بتغيير المحلول بعد ثلاث وست ساعات عندما يبدو الدماغ شفافا. عادة بعد ساعة واحدة من تغيير DBE الثاني ، قم بتثبيته على لوحة تصوير مائلة بإحدى الطرق الموضحة هنا.

التثبيت المباشر للتركيب عبر قرص agros أو التركيب عبر مكبر صوت زراعي للتركيب المباشر ، اغمر العينة برفق على إحدى النصائح لاستخدام غطس قرص aros. قرص مصنوع من 6٪ هلام أروس على الأطراف. ثم قم بتثبيت العينة برفق على قرص agros باستخدام غراء الأكريليك وانتظر حوالي دقيقة واحدة حتى يتم تركيب المعالجة.

باستخدام غطس دورق agros ، دورق مصنوع من 3٪ جل agros على الأطراف. ثم ضع العينة برفق في قاع الدرق. بعد تركيب العينة باتباع إحدى هذه الطرق ، ضع لوحة التصوير داخل غرفة العينة باستخدام الملقط.

ثم املأ الغرفة بمحلول المقاصة. بعد ذلك ، استعد للتصوير المقطعي. أولا ، قم بإزالة الشق لجمع أكبر قدر ممكن من التألق ، ثم قم بإضاءة العينة بطاقة ليزر منخفضة.

لمنع التبييض الضوئي ، حرك العينة في الاتجاهات الثلاثة x و y و Z باستخدام نظام تحديد المواقع الجزئي المدفوع بالبرمجيات. لكل اتجاه، حدد الحد الأدنى والحد الأقصى للإحداثيات التي تضيء العينة من أجلها أثناء وجودها في مجال رؤية الكاميرا. ثم أدخل الإحداثيات المحددة كمعلمات للروتين الفرعي للتصوير المقطعي المسبق.

حدد أيضا المسافة بين الأكوام المجاورة لاستخدامها في التصوير المقطعي وخطوة أخذ العينات قبل التصوير المقطعي في الاتجاه Z. أخيرا ، ابدأ التصوير المقطعي المسبق ، والذي سيجمع الصور في كل مكدس باستخدام معلمات أخذ العينات Z كما هو محدد في الخطوة السابقة. لبدء الاستحواذ ، أولا ، انقل العينة خارج ورقة الضوء باستخدام نظام تحديد المواقع الجزئي.

ثم قم بزيادة قوة الليزر وإيقاف الحركة لجميع أنظمة المسح الضوئي من أجل إضاءة خط ثابت فقط في مركز مجال الرؤية. بعد ذلك ، قم بتركيب الشق ومحاذاة ذلك باستخدام إشارة الفلورسنت الذاتي من محلول المقاصة. يجب أن ترى الآن بوضوح خط الشق في وسط مجال الرؤية.

الآن أعد تنشيط نظام المسح. قلل طاقة الليزر وانقل العينة داخل ورقة الضوء باستخدام نظام تحديد المواقع الجزئي. لاحظ أن قوة الليزر المستخدمة مع الشق ستكون أعلى من تلك المستخدمة بدونها.

نظرا لأن المرشح المكاني يحجب جزءا لا يستهان به من الضوء ، اضبط سعة وإزاحة أنظمة المسح الضوئي والمسح الضوئي باستخدام برنامج التحكم حتى تبدو الصور واضحة ومشرقة. ثم قم بتعيين الخطوة Z المناسبة للتجربة وقم بتشغيل برنامج الحصول على التصوير المقطعي. سيتم تصوير وحدة التخزين في العديد من المكدسات المتوازية والمتداخلة جزئيا، وسيتم حفظ الصور في بنية مجلد هرمي.

لكي يعمل برنامج الخياطة بحجم مكعب كامل ، أكمل الحجم المكتسب بصور سوداء اصطناعية ، مما يعني صورا من نفس نوع وأبعاد الصور التي تم جمعها ، ولكن بدون كثافة باستخدام البرامج الآلية. بعد ذلك ، قم بتشغيل برنامج VA A 3D مع المكونات الإضافية و Terra و Stitcher و tarly المثبت وتحميل المكون الإضافي Terra Stitcher. حدد الدليل الذي يحتوي على وحدة التخزين المصورة وحدد الاتجاهات النسبية للمحاور فيما يتعلق بنظام الإحداثيات المرجعي الأيمن وحجم فوكسيل.

الآن قم بإطلاق الجزء الأول من الخياطة. سيقوم البرنامج بحساب الإزاحة النسبية بين أزواج المكدسات والعثور على موضع مثالي عام لجميع المكدسات معا ، وحدد حفظ الحجم المخيط بدقة واحدة أو بتنسيق متعدد الدقة. يتيح السلم التصور متعدد الدقة باستخدام المكون الإضافي tarly.

في كلتا الحالتين، إذا كانت الصورة ذات الدقة الأعلى أكبر من بضعة غيغابايت، فحدد أيضا طريقة الحفظ متعددة المكدسات وحدد حجم المكدسات الفرعية الفردية. سيتيح ذلك الوصول الفعال إلى البيانات المخزنة. الآن قم بتشغيل الجزء الثاني من الخياطة.

سيقوم البرنامج بدمج المكدسات المحاذاة وحفظها إما في وضع أحادي أو متعدد المكدسات. عند الانتهاء ، أغلق المكون الإضافي Terra Stitcher. بعد ذلك ، قم بتحميل المكون الإضافي terra fly.

حدد المجلد الذي يحتوي على وحدة تخزين متعددة الدقة متعددة المكدسات وحدد حجم الثعلب واتجاهات المحور. سيتم تحميل وحدة التخزين بأقل دقة. للتكبير إلى دقة أعلى ، ما عليك سوى استخدام تمرير الماوس.

بدلا من ذلك ، يمكن للمرء النقر نقرا مزدوجا على نقطة معينة من الصورة أو تحديد التكبير حول معلم موجود أو تحديد إحداثيات حجم الاهتمام مباشرة. للتكبير إلى الدقة المنخفضة ، ما عليك سوى استخدام تمرير الماوس. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لإعادة البناء بدقة مقياس ميكرون إما أدمغة الفأر بأكملها أو الأجزاء المستقطوعة دون الحاجة إلى التقسيم المادي.

كنتيجة تمثيلية ، يظهر المخيخ الكامل لفأر L seven GFP بعد الولادة في اليوم 10 هنا في هذا. يتم تصنيف جميع الخلايا العصبية لجين بيركين ب EGFP. بعد التكبير في الهيكل الرقائقي النموذجي للقشرة المخيخية يمكن رؤيته ، يسمح التكبير الإضافي بالتمييز بوضوح بين كل سوما لخلايا البوركيني.

وبالتالي يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لفحص التنظيم المكاني للخلايا العصبية في دراسات النمو العصبي المختلفة. كنتيجة تمثيلية ثانية ، يمكننا هنا رؤية صور من الدماغ المقسم للأمم المتحدة لفخذ بالغ ، فأر GFPM واحد. في هذا المعدل وراثيا ، يتم التعبير عن EGFP في مجموعة فرعية عشوائية متفرقة من الخلايا العصبية.

يظهر النصف الأيمن من الدماغ هنا. مع تكبير المزيد ، تصبح العمليات العصبية أكثر مميزة. توضح هذه النتيجة أن البروتوكول الموصوف يسمح بالتصوير بدقة الميكرون في أدمغة الفئران البالغة بأكملها مما يفتح إمكانية دراسة تشريح الدماغ بالكامل بدقة خلوية.

في نماذج الفئران للأمراض التنكسية العصبية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تصفية محلول الجفاف والتنظيف بشكل صحيح من أجل الحفاظ على مضان GFP. يمكن أيضا استخدام أداة التصور متعددة الدقة المعروضة هنا لاستكشاف مجموعات بيانات كبيرة جدا تم الحصول عليها باستخدام تقنيات أخرى مثل القسم البصري الدقيق في التصوير المقطعي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التأريخ وتقييم ومسح دماغ الماوس الثابت. قم بتصويرها باستخدام الفحص المجهري للورقة متحد البؤر وتصور الحجم المعاد بناؤه باستخدام VR 3D باستخدام المكون الإضافي Tely.