ميكرون على نطاق بصري القرار المقطعي من أدمغة فئران كاملة مع متحد البؤر المجهري الخفيفة ورقة

الهدف العام من هذا الإجراء هو إعادة بناء وتصوير دماغ فأر كامل بدقة ميكرونية. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجفيف سلسلة من المقاطع رباعية الأوجه لدماغ فأر مثبت، تليها الخطوة الثانية وهي تصفية العينة باستخدام Benzyl Ether.

بعد ذلك، يتم تصوير الدماغ باستخدام مجهر ورقة الضوء البؤري (confocal light sheet microscope). وتتمثل الخطوة النهائية في استخدام برنامج لمحاذاة ودمج مجموعات الصور التي تم الحصول عليها. وفي النهاية، يمكن استخدام أداة تصوير متعددة الدقة للتنقل داخل حجم الصورة المعاد بناؤه.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى مثل المجهر البؤري أو المجهر الفوتوني في إمكانية تصوير الحجم الكامل لدماغ الفأر في غضون أيام قليلة فقط. يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال العلوم العصبية، مثل توزيع الأنواع العصبونية المختلفة في جميع أنحاء الدماغ. هل يوفر هذا الغطاء المعدني رؤية ثاقبة حول التشريح الدقيق للدماغ؟

يمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أجنة الفئران أو ذباب الفاكهة، مما يثبت إمكانية تكرار الإجراء. قام طالب دراسات عليا من مختبري بـ... لبدء هذا البروتوكول، قم بإجراء التثبيت القياسي لأدمغة الفئران عبر التروية القلبية، ثم التثبيت اللاحق طوال الليل قبل البدء في عمليات التجفيف والترويق.

ونظراً لأن مذيب التجفيف، THF، يثبط بشدة فلورة XFP، يتم إجراء عملية ترشيح لإزالة البيروكيسيدات باستخدام أكسيد الألومنيوم المنشط القاعدي عبر عمود كروماطوغرافي، مع تجنب تشقق العمود، الأمر الذي من شأنه أن يقلل من إزالة البيروكيسيد عند إضافة مادة مثبتة إلى المحلول النهائي. وحتى لو كان THF مثبتاً بالفعل قبل الترشيح، فإن أكسيد الألومنيوم سيقوم باحتجاز المادة المثبتة. يرجى ملاحظة أن THF الخالي من المادة المثبتة قد يطور كميات كبيرة من البيروكيسيدات وقد يكون متفجراً وخطيراً.

بعد ذلك، قم بإزالة الماء من السلسلة المتكاملة لدماغ الفأر الكامل باستخدام THF في ماء نقي. ثم ضع القارورة التي تحتوي على العينة على عجلة دوارة لتجنب التعرض للضوء. غلف القارورة بورق ألومنيوم.

وأخيرًا، قم بترشيح مذيب التصفية باستخدام أكسيد الألومنيوم بواسطة قمع ترشيح. بعد ذلك، قم بتصفية العينة في 100% DBE، مع تغيير المحلول بعد ثلاث وست ساعات عندما يبدو الدماغ شفافًا. عادةً، وبعد ساعة واحدة من تغيير DBE الثاني، قم بتثبيت العينة على لوح تصوير مائل باستخدام إحدى الطرق الموضحة هنا.

التثبيت المباشر عبر قرص Agros أو التثبيت عبر مكبر Agros للتثبيت المباشر، اغمر العينة برفق على إحدى الرؤوس لاستخدام غمر قرص Agros. قرص مكون من 6% من هلام Agros على الرؤوس. ثم ثبت العينة برفق على قرص Agros باستخدام غراء الأكريليك وانتظر لمدة دقيقة واحدة تقريبًا حتى يتم التصلب للتثبيت.

باستخدام غطاسة كؤوس agros، يتم وضع كأس مصنوع من هلام agros بنسبة 3% على الرؤوس. ثم توضع العينة برفق في قاع الكأس. بعد تثبيت العينة باتباع إحدى هذه الطرق، يتم وضع لوحة التصوير داخل غرفة العينات باستخدام الملقط.

بعد ذلك، املأ الحجرة بمحلول الترويق. تالياً، قم بالتحضير للتصوير المقطعي. أولاً، قم بإزالة الشق لجمع أكبر قدر ممكن من الفلورسنت، ثم قم بإضاءة العينة بطاقة ليزر منخفضة.

لمنع التبييض الضوئي، قم بتحريك العينة في الاتجاهات الثلاثة x وy وZ باستخدام نظام تحديد المواقع الدقيق الذي يتم التحكم فيه عبر البرنامج. حدد لكل اتجاه الإحداثيات الدنيا والقصوى التي تظل عندها العينة مضاءة بينما تكون ضمن مجال رؤية الكاميرا. بعد ذلك، أدخل الإحداثيات المحددة كمعلمات للروتين الفرعي لما قبل التصوير المقطعي.

حدد أيضاً المسافة بين المجموعات المتتالية التي ستُستخدم في التصوير المقطعي وخطوة أخذ العينات السابقة للتصوير المقطعي في اتجاه Z. وأخيراً، ابدأ مرحلة ما قبل التصوير المقطعي، والتي ستعمل على جمع الصور في كل مجموعة وفقاً لمعايير أخذ العينات في اتجاه Z المحددة في الخطوة السابقة. لبدء عملية الاستحواذ، قم أولاً بنقل العينة إلى خارج ورقة الضوء باستخدام نظام تحديد المواقع الدقيق.

بعد ذلك، قم بزيادة قدرة الليزر وإيقاف حركة جميع أنظمة المسح لإنارة خط ثابت فقط في مركز مجال الرؤية. بعد ذلك، قم بتركيب الشق ومحاذاته باستخدام إشارة التألق الذاتي من محلول التصفية. يجب أن ترى الآن خط الشق بوضوح في مركز مجال الرؤية.

الآن قم بإعادة تنشيط نظام المسح. قم بخفض قدرة الليزر وحرك العينة داخل الورقة الضوئية باستخدام نظام تحديد المواقع الدقيق. لاحظ أن قدرة الليزر المستخدمة مع الشق ستكون أعلى من تلك المستخدمة بدونه.

نظرًا لأن المرشح المكاني يحجب جزءاً غير مهمل من الضوء، قم بضبط السعة والإزاحة لأنظمة المسح d والمسح باستخدام برنامج التحكم حتى تبدو الصور واضحة وساطعة. بعد ذلك، حدد خطوة Z المناسبة للتجربة وقم بتشغيل برنامج الحصول على التصوير المقطعي. سيتم تصوير الحجم في العديد من المجموعات المتوازية والمتداخلة جزئياً، وسيتم حفظ الصور في هيكل مجلدات هرمي.

لكي يتمكن برنامج التجميع (stitching software) من العمل مع حجم مكعب كامل، استكمل الحجم المكتسب بصور سوداء اصطناعية، والمقصود بها صور من نفس نوع وأبعاد الصور التي تم جمعها، ولكن بكثافة صفرية باستخدام برنامج مؤتمت. بعد ذلك، قم بتشغيل برنامج VA A 3D مع تثبيت الملحقات Terra وStitcher وtarly، ثم قم بتحميل ملحق Terra Stitcher. حدد المجلد الذي يحتوي على الحجم المصور، ووضح التوجهات النسبية للمحاور بالنسبة لنظام إحداثيات مرجعي يميني، مع تحديد حجم الفوكسل (voxel size).

قم الآن بتشغيل الجزء الأول من عملية الربط (stitching). سيقوم البرنامج بحساب الإزاحة النسبية بين أزواج المجموعات المتراصة (stacks) وإيجاد الموضع الأمثل العام لجميع المجموعات معاً، ثم اختر حفظ المجلد المربوط بتنسيق دقة أحادية (single resolution) أو بتنسيق دقة متعددة (multi resolution). يتيح التنسيق الأخير التصور بدقة متعددة باستخدام ملحق tarly.

في كلتا الحالتين، إذا كان حجم صورة الدقة العالية أكبر من بضعة جيجابايت، فقم أيضاً باختيار وضع حفظ المجموعات المتعددة (multi-stack save modality) وحدد حجم المجموعات الفرعية الفردية. سيتيح ذلك وصولاً فعالاً إلى البيانات المخزنة. الآن، قم بتشغيل الجزء الثاني من عملية الربط (stitching).

سيقوم البرنامج بدمج المجموعات المتراصة المحاذية وحفظها إما في وضع المجموعات الأحادية أو المتعددة. عند الاكتمال، أغلق ملحق Terra Stitcher. بعد ذلك، قم بتحميل ملحق terra fly.

حدد المجلد الذي يحتوي على المجلد الحجمي متعدد المجموعات ومتعدد الدقة، وحدد حجم الفجوة واتجاهات المحاور. سيتم تحميل المجلد الحجمي بأدنى دقة. للتكبير إلى دقة أعلى، استخدم ببساطة عجلة التمرير في الماوس.

وبدلاً من ذلك، يمكن النقر المزدوج على نقطة معينة في الصورة، أو اختيار التكبير حول علامة مميزة موجودة، أو تحديد إحداثيات الحجم المراد دراسته مباشرةً. وللعودة إلى دقة أقل، ما عليك سوى استخدام عجلة التمرير في الماوس. يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لإعادة بناء أدمغة الفئران بأكملها أو أجزاء مستأصلة منها بدقة تصل إلى الميكرون، وذلك دون الحاجة إلى إجراء تقطيع فيزيائي.

كنتيجة ممثلة، يظهر هنا المخيخ كاملاً لفأر L seven GFP في اليوم العاشر بعد الولادة. تظهر جميع عصبونات Perkin gene مصنفة بـ EGFP. وبعد التكبير، يمكن رؤية البنية الصفائحية النموذجية للقشرة المخيخية، كما يتيح التكبير الإضافي تمييز جسم كل خلية burkini بوضوح.

وبذلك، يمكن استخدام البروتوكول الموصوف لفحص التنظيم المكاني العصبي في مختلف دراسات التطور العصبي. وكنتيجة تمثيلية ثانية، يمكننا هنا رؤية صور من مقاطع دماغ لحيوان فأر GFPM بالغ. وفي هذا الحيوان المعدل وراثياً، يتم التعبير عن EGFP في مجموعة فرعية عشوائية ومتباعدة من الخلايا العصبية.

يظهر هنا النصف الأيمن من الدماغ. ومع زيادة التكبير تدريجياً، تصبح الزوائد العصبونية قابلة للتمييز. وتوضح هذه النتيجة أن البروتوكول الموصوف يسمح بالتصوير بدقة الميكرون في أدمغة الفئران البالغة بأكملها، مما يفتح المجال لدراسة تشريح الدماغ كاملاً بدقة خلوية.

في نماذج الفئران المصابة بالأمراض التنكسية العصبية، يمكن تنفيذ هذه التقنية في غضون ثلاثة إلى أربعة أيام بمجرد إتقانها، وذلك في حال تنفيذها بشكل صحيح. وأثناء محاولة إجراء هذه العملية، من المهم تذكر ترشيح محلول التجفيف والتنظيف بشكل صحيح للحفاظ على فلورة GFP. كما يمكن استخدام أداة التصوير متعددة الدقة المقدمة هنا لاستكشاف مجموعات البيانات الضخمة للغاية التي يتم الحصول عليها بتقنيات أخرى مثل التصوير المقطعي للبصريات الدقيقة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحديد تاريخ ومعدل وتصفية دماغ الفأر المثبت. وتصويرها باستخدام مجهر الصفائح البؤرية (confocal sheet microscopy) وتصور الحجم المعاد بناؤه بتقنية VR 3D باستخدام ملحق Tely.