هضم إنزيم التقييد
تستخدم إنزيمات التقييد ، أو نوكليازات التقييد ، في مجموعة متنوعة من التطبيقات المختلفة في البيولوجيا الجزيئية. تتعرف هذه الإنزيمات على تسلسل DNA معين وتشقه ، يسمى موقع التقييد. يوفر الفيديو الذي توشك على مشاهدته بعض المعلومات الأساسية عن هذه الجزيئات المعجزة ويوضح كيفية إعداد هضم إنزيم التقييد.
من أين تأتي إنزيمات التقييد على أي حال؟ تصادف أن تكون هذه الإنزيمات عبارة عن تكيف للبكتيريا التي تعمل كآلية دفاع ضد الفيروسات المعروفة باسم العاثيات. بفضل إضافة مجموعات الميثيل إلى مواقع الإنزيمات المقيدة على الحمض النووي البكتيري ، تتعرف إنزيمات التقييد فقط على الحمض النووي للعاثية وتقطعه ، وبالتالي تمنع العدوى.
إنزيمات التقييد لها بعض الأسماء الغريبة جدا. على سبيل المثال ، HindIII و NotI و EcoRI و BamHI. تشير الأحرف الثلاثة الأولى من اسم إنزيم التقييد إلى الكائن الحي الذي تم عزله منه. على سبيل المثال ، تم عزل إنزيم التقييد EcoRI من الإشريكية القولونية. يشير الحرف الرابع ، إذا لزم الأمر ، إلى السلالة البكتيرية التي تم عزل الإنزيم منها. يشير الرقم الروماني إلى ما إذا كان هو الإنزيم الأول والثاني والثالث المعزول عن هذا الكائن الحي المعين.
تتعرف إنزيمات التقييد على سلسلة من النيوكليوتيدات ، عادة ما يكون طولها من أربعة إلى ثمانية أزواج أساسية ، تسمى موقع التعرف. في نيوكليوتيدات معينة داخل التسلسل ، سيكسر الإنزيم روابط الفوسفوديستر في العمود الفقري للحمض النووي. عادة ما تكون مواقع التعرف متجانسة ، مما يعني أن التسلسل يقرأ نفس الخطوط الأمامية والخلفية. عندما يتم العثور على الحاجز على خيوط تكميلية من جزيء الحمض النووي ، يطلق عليه اسم palindrome المقلوب المتكرر.
يمكن أن تترك إنزيمات التقييد أنواعا مختلفة من النهايات بمجرد شق الحمض النووي: نهايات لزجة ونهايات حادة. تترك النهايات اللاصقة 3 و 5 بوصات متدلية بينما لا تترك النهايات الحادة أي نتوءات. يحدد نوع النهاية كيفية إعادة دمج جزء الحمض النووي المعزول بواسطة هضم إنزيم التقييد مع شظايا الحمض النووي الأخرى في عملية تعرف باسم الربط.
يجب التخطيط بعناية لملخص إنزيم التقييد. يتكون تفاعل الهضم عادة مما يلي: الماء منزوع الأيونات ، والحمض النووي الذي سيتم قطعه ، والمخزن المؤقت الخاص بالإنزيم الذي ستستخدمه ، وأحيانا بروتين يسمى ألبومين مصل الأبقار أو BSA. سيعمل BSA على استقرار التفاعل عن طريق منع الإنزيم من الالتصاق بجانب الحاوية التي تحتوي على الهضم. يمكن أن يكون لكل إنزيم تقييد ظروف عازلة مختلفة ودرجات حرارة حضانة ومتطلبات BSA. سيكون لدى موردي إنزيمات التقييد موارد يمكن للمرء التحقق منها للحصول على جميع المعلومات اللازمة.
لبدء إعداد الملخص ، استرجع إنزيم التقييد من الفريزر أو الثلاجة. احتفظ بإنزيم التقييد على الجليد أو حاوية مقاومة للحرارة للتأكد من وجود نشاط مثالي للتفاعلات المستقبلية. يجب إضافة مكونات تفاعل أنبوب الطرد الصغير بالترتيب التالي. أولا ، حجم من الماء المعقم الخالي من النوكلياز الذي سينتج عنه حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولتر. ثم 10x Restriction Enzyme Buffer ، ثم BSA إذا لزم الأمر ، ما يصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي ، و 2-10 وحدات من الإنزيم. تعرف الوحدات بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج هضم كامل يبلغ 1 ميكروغرام من الحمض النووي للتحكم في 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، امزج عن طريق الدوامة ثم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 12,000 xg في جهاز طرد مركزي دقيق لجمع المحتويات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب. ثم احتضن عند درجة حرارة مثالية لإنزيم التقييد الخاص بك ، عادة 37 درجة مئوية في كتلة تسخين لمدة 1 إلى 4 ساعات.
بمجرد اكتمال الهضم ، من الجيد احتضان خليط التفاعل عند 65 درجة مئوية لتعطيل إنزيمات التقييد بالحرارة. في حين أن إنزيمات التقييد تقطع الموقع على وجه التحديد في معظم الأوقات ، فإن أوقات الحضانة الطويلة يمكن أن تؤدي إلى نشاط النجوم ، والذي يقطع في مواقع متشابهة ، ولكنها تختلف عن مواقع الهضم النموذجية.
بعد التعطيل ، يجب تشغيل الحمض النووي على هلام الاغاروز لضمان نجاح الهضم.
فيما يلي بعض التلميحات المفيدة لتشغيل الملخصات الخاصة بك وضمان النجاح.
في بعض الأحيان قد تجد نفسك في موقف تحتاج فيه إلى استخدام إنزيمات متعددة لتوليد جزء معين من الحمض النووي. في هذه الحالة ، تحتاج إلى التحقق من أن ظروف المخزن المؤقت ودرجات حرارة الحضانة متوافقة بين الإنزيمين ، إذا كان الأمر كذلك ، فيمكنك إجراء هضم مزدوج وقطع كلا الإنزيمين في نفس التفاعل. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، ستجد عدم توافق في ظروف التفاعل بين الإنزيمين ، وفي هذه الحالة الحل البديل هو استخدام الإنزيمات بالتتابع. على سبيل المثال ، يمكن إجراء الهضم باستخدام إنزيم واحد أولا ، ثم يمكن تغيير تركيبة المخزن المؤقت لتكون مثالية للإنزيم الثاني. هناك طريقة أخرى للتغلب على عدم توافق المخزن المؤقت وإجراء هضم متسلسل وهي تنقية الحمض النووي بعد الهضم الأولي ثم إجراء الملخص الثاني.
يعد استخدام عناصر التحكم طريقة جيدة لفهم سبب حدوث خطأ في الملخص. على سبيل المثال ، سيسمح لك التحكم بدون إنزيم بالتحقق من سلامة عينة الحمض النووي وتحديد ما إذا كان نشاط نوكلياز خارجي موجودا أم لا. يسمح استخدام الحمض النووي للتحكم مع مواقع التقييد المعروفة باختبار نشاط الإنزيم.
الآن بعد أن رأينا كيفية تنفيذ الهضمات ، دعنا نلقي نظرة على الطرق المختلفة التي يمكن من خلالها استخدام إنزيمات التقييد.
يمكن استخدام إنزيمات التقييد تشخيصيا ، من أجل تحديد عينات معينة. عن طريق تحميل الملخص في شريحة متخصصة ثم وضع تلك الشريحة في آلة تسمى المحلل الحيوي. يمكن للباحثين فحص أحجام شظايا الحمض النووي ، الناتجة عن الملخص ، من أجل تحديد صحة عينات الأسماك. تسمى أنماط النطاقات المختلفة لنفس الجين من نوع معين ، أو في هذه الحالة الأنواع المختلفة ، تعدد أشكال طول جزء التقييد.
يمكن أيضا استخدام إنزيمات التقييد في الاستنساخ الفرعي لعزل جزء من الحمض النووي من بلازميد وإدخاله في آخر ، بحيث يمكن تكرار الجزء المطلوب باستخدام البكتيريا.
من خلال استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال مواقع التقييد في الجينات في مواقع محددة للغاية ، يمكن استخدام إنزيمات التقييد لتحديد وجود اختلافات النيوكليوتيدات المفردة في أشكال بديلة لنفس الجين أو الأليل. يصعب اكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، أو SNPs ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي للهلام وحده. مع إدخال موقع التقييد داخل SNP ، يمكن لملخص بسيط التمييز بين الأليلات.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إنزيمات التقييد. لقد تعلمت من أين تأتي هذه الإنزيمات ، وتعلمت بعض الأساسيات حول كيفية عملها ، ورأيت كيفية إعداد الملخص ، وتعلمت كيف يمكن استخدام إنزيمات التقييد في البيولوجيا الجزيئية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تتعرف إنزيمات التقييد أو نوكليازات داخلية على الحمض النووي وتقطعه في تسلسل معين. تحدث هذه الإنزيمات بشكل طبيعي في البكتيريا كدفاع ضد العاثيات - الفيرو…
تستخدم إنزيمات التقييد ، أو نوكليازات التقييد ، في مجموعة متنوعة من التطبيقات المختلفة في البيولوجيا الجزيئية. تتعرف هذه الإنزيمات على تسلسل DNA معين وتشقه ، يسمى موقع التقييد. يوفر الفيديو الذي توشك على مشاهدته بعض المعلومات الأساسية عن هذه الجزيئات المعجزة ويوضح كيفية إعداد هضم إنزيم التقييد.
من أين تأتي إنزيمات التقييد على أي حال؟ تصادف أن تكون هذه الإنزيمات عبارة عن تكيف للبكتيريا التي تعمل كآلية دفاع ضد الفيروسات المعروفة باسم العاثيات. بفضل إضافة مجموعات الميثيل إلى مواقع الإنزيمات المقيدة على الحمض النووي البكتيري ، تتعرف إنزيمات التقييد فقط على الحمض النووي للعاثية وتقطعه ، وبالتالي تمنع العدوى.
إنزيمات التقييد لها بعض الأسماء الغريبة جدا. على سبيل المثال ، HindIII و NotI و EcoRI و BamHI. تشير الأحرف الثلاثة الأولى من اسم إنزيم التقييد إلى الكائن الحي الذي تم عزله منه. على سبيل المثال ، تم عزل إنزيم التقييد EcoRI من الإشريكية القولونية. يشير الحرف الرابع ، إذا لزم الأمر ، إلى السلالة البكتيرية التي تم عزل الإنزيم منها. يشير الرقم الروماني إلى ما إذا كان هو الإنزيم الأول والثاني والثالث المعزول عن هذا الكائن الحي المعين.
تتعرف إنزيمات التقييد على سلسلة من النيوكليوتيدات ، عادة ما يكون طولها من أربعة إلى ثمانية أزواج أساسية ، تسمى موقع التعرف. في نيوكليوتيدات معينة داخل التسلسل ، سيكسر الإنزيم روابط الفوسفوديستر في العمود الفقري للحمض النووي. عادة ما تكون مواقع التعرف متجانسة ، مما يعني أن التسلسل يقرأ نفس الخطوط الأمامية والخلفية. عندما يتم العثور على الحاجز على خيوط تكميلية من جزيء الحمض النووي ، يطلق عليه اسم palindrome المقلوب المتكرر.
يمكن أن تترك إنزيمات التقييد أنواعا مختلفة من النهايات بمجرد شق الحمض النووي: نهايات لزجة ونهايات حادة. تترك النهايات اللاصقة 3 و 5 بوصات متدلية بينما لا تترك النهايات الحادة أي نتوءات. يحدد نوع النهاية كيفية إعادة دمج جزء الحمض النووي المعزول بواسطة هضم إنزيم التقييد مع شظايا الحمض النووي الأخرى في عملية تعرف باسم الربط.
يجب التخطيط بعناية لملخص إنزيم التقييد. يتكون تفاعل الهضم عادة مما يلي: الماء منزوع الأيونات ، والحمض النووي الذي سيتم قطعه ، والمخزن المؤقت الخاص بالإنزيم الذي ستستخدمه ، وأحيانا بروتين يسمى ألبومين مصل الأبقار أو BSA. سيعمل BSA على استقرار التفاعل عن طريق منع الإنزيم من الالتصاق بجانب الحاوية التي تحتوي على الهضم. يمكن أن يكون لكل إنزيم تقييد ظروف عازلة مختلفة ودرجات حرارة حضانة ومتطلبات BSA. سيكون لدى موردي إنزيمات التقييد موارد يمكن للمرء التحقق منها للحصول على جميع المعلومات اللازمة.
لبدء إعداد الملخص ، استرجع إنزيم التقييد من الفريزر أو الثلاجة. احتفظ بإنزيم التقييد على الجليد أو حاوية مقاومة للحرارة للتأكد من وجود نشاط مثالي للتفاعلات المستقبلية. يجب إضافة مكونات تفاعل أنبوب الطرد الصغير بالترتيب التالي. أولا ، حجم من الماء المعقم الخالي من النوكلياز الذي سينتج عنه حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولتر. ثم 10x Restriction Enzyme Buffer ، ثم BSA إذا لزم الأمر ، ما يصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي ، و 2-10 وحدات من الإنزيم. تعرف الوحدات بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج هضم كامل يبلغ 1 ميكروغرام من الحمض النووي للتحكم في 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، امزج عن طريق الدوامة ثم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 12,000 xg في جهاز طرد مركزي دقيق لجمع المحتويات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب. ثم احتضن عند درجة حرارة مثالية لإنزيم التقييد الخاص بك ، عادة 37 درجة مئوية في كتلة تسخين لمدة 1 إلى 4 ساعات.
بمجرد اكتمال الهضم ، من الجيد احتضان خليط التفاعل عند 65 درجة مئوية لتعطيل إنزيمات التقييد بالحرارة. في حين أن إنزيمات التقييد تقطع الموقع على وجه التحديد في معظم الأوقات ، فإن أوقات الحضانة الطويلة يمكن أن تؤدي إلى نشاط النجوم ، والذي يقطع في مواقع متشابهة ، ولكنها تختلف عن مواقع الهضم النموذجية.
بعد التعطيل ، يجب تشغيل الحمض النووي على هلام الاغاروز لضمان نجاح الهضم.
فيما يلي بعض التلميحات المفيدة لتشغيل الملخصات الخاصة بك وضمان النجاح.
في بعض الأحيان قد تجد نفسك في موقف تحتاج فيه إلى استخدام إنزيمات متعددة لتوليد جزء معين من الحمض النووي. في هذه الحالة ، تحتاج إلى التحقق من أن ظروف المخزن المؤقت ودرجات حرارة الحضانة متوافقة بين الإنزيمين ، إذا كان الأمر كذلك ، فيمكنك إجراء هضم مزدوج وقطع كلا الإنزيمين في نفس التفاعل. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، ستجد عدم توافق في ظروف التفاعل بين الإنزيمين ، وفي هذه الحالة الحل البديل هو استخدام الإنزيمات بالتتابع. على سبيل المثال ، يمكن إجراء الهضم باستخدام إنزيم واحد أولا ، ثم يمكن تغيير تركيبة المخزن المؤقت لتكون مثالية للإنزيم الثاني. هناك طريقة أخرى للتغلب على عدم توافق المخزن المؤقت وإجراء هضم متسلسل وهي تنقية الحمض النووي بعد الهضم الأولي ثم إجراء الملخص الثاني.
يعد استخدام عناصر التحكم طريقة جيدة لفهم سبب حدوث خطأ في الملخص. على سبيل المثال ، سيسمح لك التحكم بدون إنزيم بالتحقق من سلامة عينة الحمض النووي وتحديد ما إذا كان نشاط نوكلياز خارجي موجودا أم لا. يسمح استخدام الحمض النووي للتحكم مع مواقع التقييد المعروفة باختبار نشاط الإنزيم.
الآن بعد أن رأينا كيفية تنفيذ الهضمات ، دعنا نلقي نظرة على الطرق المختلفة التي يمكن من خلالها استخدام إنزيمات التقييد.
يمكن استخدام إنزيمات التقييد تشخيصيا ، من أجل تحديد عينات معينة. عن طريق تحميل الملخص في شريحة متخصصة ثم وضع تلك الشريحة في آلة تسمى المحلل الحيوي. يمكن للباحثين فحص أحجام شظايا الحمض النووي ، الناتجة عن الملخص ، من أجل تحديد صحة عينات الأسماك. تسمى أنماط النطاقات المختلفة لنفس الجين من نوع معين ، أو في هذه الحالة الأنواع المختلفة ، تعدد أشكال طول جزء التقييد.
يمكن أيضا استخدام إنزيمات التقييد في الاستنساخ الفرعي لعزل جزء من الحمض النووي من بلازميد وإدخاله في آخر ، بحيث يمكن تكرار الجزء المطلوب باستخدام البكتيريا.
من خلال استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال مواقع التقييد في الجينات في مواقع محددة للغاية ، يمكن استخدام إنزيمات التقييد لتحديد وجود اختلافات النيوكليوتيدات المفردة في أشكال بديلة لنفس الجين أو الأليل. يصعب اكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، أو SNPs ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي للهلام وحده. مع إدخال موقع التقييد داخل SNP ، يمكن لملخص بسيط التمييز بين الأليلات.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إنزيمات التقييد. لقد تعلمت من أين تأتي هذه الإنزيمات ، وتعلمت بعض الأساسيات حول كيفية عملها ، ورأيت كيفية إعداد الملخص ، وتعلمت كيف يمكن استخدام إنزيمات التقييد في البيولوجيا الجزيئية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
تسجيل الدخول أو للوصول إلى المحتوى الكامل. تعرّف على المزيد حول وصول مؤسستك إلى محتوى JoVE هنا
تستخدم إنزيمات التقييد ، أو نوكليازات التقييد ، في مجموعة متنوعة من التطبيقات المختلفة في البيولوجيا الجزيئية. تتعرف هذه الإنزيمات على تسلسل DNA معين وتشقه ، يسمى موقع التقييد. يوفر الفيديو الذي توشك على مشاهدته بعض المعلومات الأساسية عن هذه الجزيئات المعجزة ويوضح كيفية إعداد هضم إنزيم التقييد.
من أين تأتي إنزيمات التقييد على أي حال؟ تصادف أن تكون هذه الإنزيمات عبارة عن تكيف للبكتيريا التي تعمل كآلية دفاع ضد الفيروسات المعروفة باسم العاثيات. بفضل إضافة مجموعات الميثيل إلى مواقع الإنزيمات المقيدة على الحمض النووي البكتيري ، تتعرف إنزيمات التقييد فقط على الحمض النووي للعاثية وتقطعه ، وبالتالي تمنع العدوى.
إنزيمات التقييد لها بعض الأسماء الغريبة جدا. على سبيل المثال ، HindIII و NotI و EcoRI و BamHI. تشير الأحرف الثلاثة الأولى من اسم إنزيم التقييد إلى الكائن الحي الذي تم عزله منه. على سبيل المثال ، تم عزل إنزيم التقييد EcoRI من الإشريكية القولونية. يشير الحرف الرابع ، إذا لزم الأمر ، إلى السلالة البكتيرية التي تم عزل الإنزيم منها. يشير الرقم الروماني إلى ما إذا كان هو الإنزيم الأول والثاني والثالث المعزول عن هذا الكائن الحي المعين.
تتعرف إنزيمات التقييد على سلسلة من النيوكليوتيدات ، عادة ما يكون طولها من أربعة إلى ثمانية أزواج أساسية ، تسمى موقع التعرف. في نيوكليوتيدات معينة داخل التسلسل ، سيكسر الإنزيم روابط الفوسفوديستر في العمود الفقري للحمض النووي. عادة ما تكون مواقع التعرف متجانسة ، مما يعني أن التسلسل يقرأ نفس الخطوط الأمامية والخلفية. عندما يتم العثور على الحاجز على خيوط تكميلية من جزيء الحمض النووي ، يطلق عليه اسم palindrome المقلوب المتكرر.
يمكن أن تترك إنزيمات التقييد أنواعا مختلفة من النهايات بمجرد شق الحمض النووي: نهايات لزجة ونهايات حادة. تترك النهايات اللاصقة 3 و 5 بوصات متدلية بينما لا تترك النهايات الحادة أي نتوءات. يحدد نوع النهاية كيفية إعادة دمج جزء الحمض النووي المعزول بواسطة هضم إنزيم التقييد مع شظايا الحمض النووي الأخرى في عملية تعرف باسم الربط.
يجب التخطيط بعناية لملخص إنزيم التقييد. يتكون تفاعل الهضم عادة مما يلي: الماء منزوع الأيونات ، والحمض النووي الذي سيتم قطعه ، والمخزن المؤقت الخاص بالإنزيم الذي ستستخدمه ، وأحيانا بروتين يسمى ألبومين مصل الأبقار أو BSA. سيعمل BSA على استقرار التفاعل عن طريق منع الإنزيم من الالتصاق بجانب الحاوية التي تحتوي على الهضم. يمكن أن يكون لكل إنزيم تقييد ظروف عازلة مختلفة ودرجات حرارة حضانة ومتطلبات BSA. سيكون لدى موردي إنزيمات التقييد موارد يمكن للمرء التحقق منها للحصول على جميع المعلومات اللازمة.
لبدء إعداد الملخص ، استرجع إنزيم التقييد من الفريزر أو الثلاجة. احتفظ بإنزيم التقييد على الجليد أو حاوية مقاومة للحرارة للتأكد من وجود نشاط مثالي للتفاعلات المستقبلية. يجب إضافة مكونات تفاعل أنبوب الطرد الصغير بالترتيب التالي. أولا ، حجم من الماء المعقم الخالي من النوكلياز الذي سينتج عنه حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولتر. ثم 10x Restriction Enzyme Buffer ، ثم BSA إذا لزم الأمر ، ما يصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي ، و 2-10 وحدات من الإنزيم. تعرف الوحدات بأنها كمية الإنزيم المطلوبة لإنتاج هضم كامل يبلغ 1 ميكروغرام من الحمض النووي للتحكم في 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حجم تفاعل 50 ميكرولتر. بعد ذلك ، امزج عن طريق الدوامة ثم جهاز الطرد المركزي لفترة وجيزة عند 12,000 xg في جهاز طرد مركزي دقيق لجمع المحتويات الموجودة في الجزء السفلي من الأنبوب. ثم احتضن عند درجة حرارة مثالية لإنزيم التقييد الخاص بك ، عادة 37 درجة مئوية في كتلة تسخين لمدة 1 إلى 4 ساعات.
بمجرد اكتمال الهضم ، من الجيد احتضان خليط التفاعل عند 65 درجة مئوية لتعطيل إنزيمات التقييد بالحرارة. في حين أن إنزيمات التقييد تقطع الموقع على وجه التحديد في معظم الأوقات ، فإن أوقات الحضانة الطويلة يمكن أن تؤدي إلى نشاط النجوم ، والذي يقطع في مواقع متشابهة ، ولكنها تختلف عن مواقع الهضم النموذجية.
بعد التعطيل ، يجب تشغيل الحمض النووي على هلام الاغاروز لضمان نجاح الهضم.
فيما يلي بعض التلميحات المفيدة لتشغيل الملخصات الخاصة بك وضمان النجاح.
في بعض الأحيان قد تجد نفسك في موقف تحتاج فيه إلى استخدام إنزيمات متعددة لتوليد جزء معين من الحمض النووي. في هذه الحالة ، تحتاج إلى التحقق من أن ظروف المخزن المؤقت ودرجات حرارة الحضانة متوافقة بين الإنزيمين ، إذا كان الأمر كذلك ، فيمكنك إجراء هضم مزدوج وقطع كلا الإنزيمين في نفس التفاعل. ومع ذلك ، في بعض الأحيان ، ستجد عدم توافق في ظروف التفاعل بين الإنزيمين ، وفي هذه الحالة الحل البديل هو استخدام الإنزيمات بالتتابع. على سبيل المثال ، يمكن إجراء الهضم باستخدام إنزيم واحد أولا ، ثم يمكن تغيير تركيبة المخزن المؤقت لتكون مثالية للإنزيم الثاني. هناك طريقة أخرى للتغلب على عدم توافق المخزن المؤقت وإجراء هضم متسلسل وهي تنقية الحمض النووي بعد الهضم الأولي ثم إجراء الملخص الثاني.
يعد استخدام عناصر التحكم طريقة جيدة لفهم سبب حدوث خطأ في الملخص. على سبيل المثال ، سيسمح لك التحكم بدون إنزيم بالتحقق من سلامة عينة الحمض النووي وتحديد ما إذا كان نشاط نوكلياز خارجي موجودا أم لا. يسمح استخدام الحمض النووي للتحكم مع مواقع التقييد المعروفة باختبار نشاط الإنزيم.
الآن بعد أن رأينا كيفية تنفيذ الهضمات ، دعنا نلقي نظرة على الطرق المختلفة التي يمكن من خلالها استخدام إنزيمات التقييد.
يمكن استخدام إنزيمات التقييد تشخيصيا ، من أجل تحديد عينات معينة. عن طريق تحميل الملخص في شريحة متخصصة ثم وضع تلك الشريحة في آلة تسمى المحلل الحيوي. يمكن للباحثين فحص أحجام شظايا الحمض النووي ، الناتجة عن الملخص ، من أجل تحديد صحة عينات الأسماك. تسمى أنماط النطاقات المختلفة لنفس الجين من نوع معين ، أو في هذه الحالة الأنواع المختلفة ، تعدد أشكال طول جزء التقييد.
يمكن أيضا استخدام إنزيمات التقييد في الاستنساخ الفرعي لعزل جزء من الحمض النووي من بلازميد وإدخاله في آخر ، بحيث يمكن تكرار الجزء المطلوب باستخدام البكتيريا.
من خلال استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال مواقع التقييد في الجينات في مواقع محددة للغاية ، يمكن استخدام إنزيمات التقييد لتحديد وجود اختلافات النيوكليوتيدات المفردة في أشكال بديلة لنفس الجين أو الأليل. يصعب اكتشاف تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة ، أو SNPs ، باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل والرحلان الكهربائي للهلام وحده. مع إدخال موقع التقييد داخل SNP ، يمكن لملخص بسيط التمييز بين الأليلات.
لقد شاهدت للتو فيديو JoVE حول إنزيمات التقييد. لقد تعلمت من أين تأتي هذه الإنزيمات ، وتعلمت بعض الأساسيات حول كيفية عملها ، ورأيت كيفية إعداد الملخص ، وتعلمت كيف يمكن استخدام إنزيمات التقييد في البيولوجيا الجزيئية. كما هو الحال دائما ، شكرا على المشاهدة!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Where do restriction enzymes come from and why do bacteria produce them?
Restriction enzymes are a bacterial defense mechanism against bacteriophages, viruses that infect bacteria. Bacteria produce these enzymes to recognize and cut invading phage DNA while protecting their own genomic DNA through methylation. This natural adaptation allows bacteria to survive viral infection.
Q2: What do the letters and numbers in restriction enzyme names mean?
Restriction enzyme names encode their origin and discovery order. The first three letters identify the organism source, such as EcoRI from E. coli. The fourth letter, if present, indicates the bacterial strain. Roman numerals denote whether it was the first, second, or third enzyme isolated from that organism.
Q3: What is the difference between sticky ends and blunt ends in restriction digests?
Sticky ends leave 3' and 5' overhangs after enzyme cleavage, while blunt ends produce no overhangs. The type of end determines how DNA fragments can be recombined with other fragments through DNA ligation reactions principle procedure and applications. Sticky ends are generally more useful for cloning applications.
Q4: What components are needed to set up a restriction enzyme digest?
A typical digest requires sterile, nuclease-free water, the DNA to be cut, buffer specific to the enzyme, and sometimes bovine serum albumin (BSA) to stabilize the reaction. BSA prevents the enzyme from sticking to the tube walls. Suppliers provide detailed information about buffer conditions, incubation temperatures, and BSA requirements for each enzyme.
Q5: How should a restriction enzyme digest be incubated and why is heat inactivation important?
Digests are typically incubated at 37°C in a heating block for 1 to 4 hours. After digestion completes, heat inactivation at 65°C stops enzyme activity and prevents star activity, which is unwanted cutting at sites similar to the recognition site. This ensures accurate, specific digestion results.
Q6: What is a double digest and when would you use sequential digestion instead?
A double digest uses two restriction enzymes simultaneously if their buffer conditions and incubation temperatures are compatible. If enzymes are incompatible, sequential digestion is used: perform the first digest, alter buffer conditions for the second enzyme, or purify DNA between digests. This approach ensures both enzymes can cut effectively.
Q7: How can restriction enzymes be used to identify DNA samples or detect genetic variations?
Restriction enzymes produce different banding patterns called restriction fragment length polymorphisms (RFLPs) that identify samples or species. By introducing restriction sites at specific locations using PCR, enzymes can detect single nucleotide polymorphisms (SNPs) that distinguish between alleles. These applications enable diagnostic identification and genetic analysis.
الفصول في هذا الفيديو
0:00
Overview
0:38
Background and Nomenclature
1:53
Basic Principles
3:03
Setting up a Restriction Enzyme Digest
5:55
Hints
7:35
Applications
9:17
Summary