المضاعفة نيون ميكروأري لتحليل البروتين اللعابية الإنسان عن طريق البوليمر المجهرية وحزم الألياف البصرية
October 10th, 2013
نحن تصف إجراءات التنميط البروتينات اللعابية باستخدام صفائف المضاعفة الأجسام المضادة المستندة إلى المكروية. كانت مرتبطة تساهميا الاجسام المضادة لفلوري ترميز الصبغة 4.5 ميكرومتر المجهرية البوليمر باستخدام الكيمياء carbodiimide. أودعت المجهرية المعدلة في microwells الألياف الضوئية لقياس مستويات بروتين في اللعاب باستخدام المناعية شطيرة مضان.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل بروتينات متعددة في عينات اللعاب البشري باستخدام مصفوفات الفلورسنت القائمة على الكرة المجهرية. أولا ، قم بترميز الكريات المجهرية بكميات مختلفة من صبغتين الفلورسنت. قم بإقران الأجسام المضادة الملتقطة للبروتينات المختلفة على الكريات المجهرية المشفرة.
ثم قم بتجميع المصفوفة الدقيقة للبروتين متعددة الإرسال على حزمة الألياف البصرية باستخدام المقايسات المناعية المحصورة على مقايسة المصفوفات الدقيقة المجمعة لبروتينات متعددة في عينات اللعاب الاختبارية. في النهاية ، يمكن للتحليل عن طريق المجهر الفلوري قياس استجابات الإشارة للبروتينات المختلفة في عينات اللعاب. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل إليزا هي أنها تتيح التحليل المتزامن لبروتينات متعددة في السوائل الحيوية المعقدة.
على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لتحليل اللعاب البشري ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الإنفلونزا الحيوية الأخرى مثل البول المصلي والبلغم. قم بوزن مادة الأفيون TTA في قارورة زجاجية كهرمانية وقم بإعداد محلول مخزون 200 مللي مولار في tetra hydro Furin. امزج برفق عن طريق سحب العينة وتحقق بصريا من ذوبان الصبغة تماما.
وبالمثل ، قم بإعداد محلول مخزون 12 مليمول من Coumarin 30 ممزوجا برفق عن طريق سحب العينات. بصريا. تحقق من أن D عبارة عن دوامة مذائبة تماما إلى تعليق الكرة المجهرية ، ثم انقل 60 ميكرولترا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 ملليلتر. لغسل الكريات المجهرية ، أضف 600 ميكرولتر من PBS الممزوج بسحب العينات 20 مرة وجهاز الطرد المركزي عند 10،000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق.
بعد ثلاث غسلات بمحلول tetra hydro furin ، قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحنك في 600 ميكرولتر من محلول العمل ، وانقل الخليط إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 مل. أغلق أنبوب الطرد المركزي الصغير بغشاء بارا وضعه على شاكر. احميها من الضوء عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم.
أضف 200 ميكرولتر من نظام التعليق المجهري المشفر إلى قفل آمن ، أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 مل. بطريقة متساقطة ، أضف 150 ميكرولتر ، محلول EDC معد حديثا أضف على الفور 150 ميكرولتر من محلول السلفا NHS. تخلط جيدا عن طريق سحب العينات وتحقق من أن التعليق متجانس.
قم بتغطية الأنبوب وأغلقه بالشكلي وضعه على شاكر. احميها من الضوء عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم. بعد ثلاث غسلات من P-B-S-S-D-S reus العازلة, قم بتعليق الحبيبات في 200 ميكرولتر من مزيج العازلة P-B-S-S-D-S.
حسنا ، انقل المحلول إلى 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت P-B-S-S-D-S الذي يحتوي على 60 ميكروغراما من الأجسام المضادة الملتقطة. امزج 50 ميكرولترا من كل نوع من أنواع الكريات المجهرية لالتقاط البروتين في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد للأوتوكلاف. قم بعمل الطرد المركزي لتجمع الكريات المجهرية عند 7 ، 000 دورة في الدقيقة لمدة ثلاث دقائق وقم بإزالة جميع المواد الطافية باستثناء 100 ميكرولتر.
الآن قطع حزم الألياف البصرية يدويا إلى حوالي خمسة سنتيمترات في الطول ، وتلميع كلا الطرفين بالتتابع باستخدام أفلام اللف الماسية. ثم صوتنة الحزمة المصقولة في الماء منزوع الأيونات لمدة دقيقتين. لإزالة أي جزيئات ، ضع قضيب تقليب مغناطيسي صغير في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.5 ملليلتر.
أضف 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت PBS الخالي من البروتين وحركه على طبق تقليب مغناطيسي لمدة 30 دقيقة. لإزالة فقاعات الهواء ، قم بحفر أحد طرفي حزمة الألياف المصقولة في محلول كلوريد الهيدروجين العادي 0.025 لمدة 150 ثانية. اغمر على الفور وصوتنة N المحفور في ماء منزوع الأيونات لمدة دقيقة واحدة.
ثم قم بتجفيف حزم الألياف بالهواء المضغوط ، وقم بتركيب حزمة الألياف على حامل الألياف وقم بسد الطرف المحفور في المخزن المؤقت PBS الخالي من البروتين الخالي من الفقاعات لمدة ساعة واحدة ، وقم بإيداع ميكرولتر واحد ALI رباعي من تعليق الكرة المجهرية المخزن على الطرف المحفور من حزمة الألياف البصرية. قم بحماية الإعداد من الضوء باستخدام صندوق ملفوف بورق الألمنيوم. بعد 15 دقيقة ، سينخفض حجم التعليق عن طريق التبخر ويجبر الكريات المجهرية على الدخول إلى الآبار الصغيرة المحفورة.
استخدم مسحة مشبعة بمحلول عينة لإزالة الكريات المجهرية غير المحاصرة في الآبار الصغيرة. لجعل المصفوفة الدقيقة للبروتين جاهزة للاستخدام ، أضف 200 ميكرولتر من محلول العينة إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق الأوتوكلاف سعة 0.5 ملليلتر. اغمس المصفوفة الدقيقة للبروتين المحملة بالألياف في المحلول وضعها على شاكر.
احميها من الضوء عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم. بعد ذلك ، قم بغمس المصفوفة الدقيقة للبروتين في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد يحتوي على 200 ميكرولتر من محلول الغسيل ورجها عند 600 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين. الآن احتضان المصفوفة الدقيقة في محلول 100 ميكرولتر من كوكتيل الأجسام المضادة للكشف الذي يحتوي على الأجسام المضادة للكشف عن البيوتينيل ومخزن مؤقت مانع PBS لمدة 30 دقيقة.
في درجة حرارة الغرفة في الظلام ، قم بتنظيف الطرف البعيد لحزمة الألياف بمسحة مشبعة بالإيثانول المطلق. ثم جفف طرفي الألياف بالهواء المضغوط ، وقم بتركيب الألياف على مجهر فلوري epi وقم بتصويره من خلال الطرف البعيد للألياف ، واحصل على صور الكرة المجهرية المقابلة لكثافة انبعاثات الفلورسنت الأفيون TTAC 30 و SAP. تظهر هنا صور الترميز لسبعة أنواع من الكرة المجهرية.
لوحظ مستويان من الشدة في صورة ترميز UTTA ، والتي تعني الكريات المجهرية المشفرة بكميات مختلفة من قوالب UTTA لوحظت نتائج مماثلة في صورة ترميز C 30. يسمح تحليل صورة MATLAB بحساب شدة التألق للكريات المجهرية المختلفة في صورة الإشارة. تظهر نتائج فك التشفير في الشكل 2D سبعة.
يتم فك تشفير الكريات المجهرية المختلفة بنجاح. لا تظهر الكريات المجهرية أي استجابة عند احتضانها باستخدام مخزن مؤقت للمقايسة. عند احتضانها بعينات من اللعاب البشري ، لوحظت استجابات فلورية كبيرة.
للحصول على مقارنة أفضل ، تم تعديل التناقضات في هذين الشكلين إلى نفس المستوى. بمجرد إتقانها ، تتيح هذه الطريقة تحليلا قابلا للتكرار للبروتينات المختلفة في عينات اللعاب البشري. يتم عرض نتائج ثلاثة اكتشافات مستقلة على نفس العينة.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير الأشعة المجهرية للبروتين متعدد الإرسال القائم على الكرة المجهرية واستخدامه لتحليل السوائل الحيوية المعقدة. باتباع هذا الإجراء. يمكن أيضا تحليل المؤشرات الحيوية للبروتين الأخرى في السوائل الحيوية المعقدة المختلفة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
نظرة عامة
تصف هذه المقالة إجراءً لتحديد ملامح بروتينات اللعاب باستخدام صفائف الأجسام المضادة المتعددة الميكروسفيرية. تتيح الطريقة التحليل المتزامن للعديد من البروتينات في عينات لعاب الإنسان، مما يعزز قدرات المقايسات التقليدية.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلوم
- علم الأعصاب
- التكنولوجيا الحيوية
- علم البروتينات
الخلفية
- يحتوي اللعاب على مجموعة متنوعة من البروتينات التي يمكن أن توفر رؤى حول الصحة والمرض.
- الطرق التقليدية مثل ELISA تقتصر على تحليل بروتين واحد في وقت واحد.
- يمكن للمقايسات المتعددة تحسين الكفاءة وغنى البيانات.
- تقدم تقنية الميكروسفيرات الفلورية نهجًا جديدًا لاكتشاف البروتينات.
هدف الدراسة
- لتطوير طريقة لتحليل عدة بروتينات في اللعاب في وقت واحد.
- لتعزيز حساسية وخصوصية اكتشاف البروتينات في السوائل الحيوية المعقدة.
- لتوفير بديل أكثر كفاءة للمقايسات القائمة على تحليل وحيد.
الطرق المستخدمة
- ترميز الميكروسفيرات بصبغات فلورية.
- ربط الأجسام المضادة الالتقاطية تساهميًا بالميكروسفيرات.
- تجميع صفائف البروتينات المتعددة على حزم الألياف البصرية.
- استخدام المقايسات المناعية السندويتشية الفلورية لكشف البروتينات في عينات اللعاب.
النتائج الرئيسية
- نجحت الطريقة في كشف عدة بروتينات في عينات اللعاب.
- وفرت الفحص المجهري الفلوري استجابات إشارة واضحة لبروتينات مختلفة.
- أظهرت التقنية مزايا على طرق ELISA التقليدية.
- تشير النتائج إلى تطبيقات محتملة في التشخيصات السريرية.
الاستنتاجات
- يسمح هذا النهج المتعدد بالتحليل الفعال للبروتين اللعاب.
- يمكن أن تسهل الطريقة فهمًا أفضل لظروف صحية مختلفة.
- قد توسع الدراسات المستقبلية تطبيق هذه التقنية في سوائل حيوية أخرى.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
