أنثرالين كما مصفوفة لمصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين التصوير على تحويل فورييه ايون السيكلوترون الرنين مطياف الكتلة

يعمل هذا الإجراء على تحديد التموضع المكاني لعدة ليبيدات داخلية المنشأ داخل عدسة بقريّة. وذلك باستخدام تقنية التصوير بطيف الكتلة بالتأين بالامتزاز/النزع بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI). أولاً، قم بتحضير مقطع رقيق من نسيج عدسة بقريّة وضع مصفوفة متعددة، ثم قم بالحصول على مجموعة بيانات طيف كتلة MALDI.

قم بمعالجة مجموعة البيانات لتحويلها إلى تمثيل بصري للدهون المكتشفة في مقطع نسيج العدسة. يمكن لهذه النتائج مجتمعة أن تحدد موقع الوفرة النسبية للدهون داخل عدسة البقر وإنتاج تمثيل بصري لهذا التوزيع. وبالمقارنة مع الطرق الأخرى مثل استخلاص الدهون المتبوع بتحليل LCMS، فإن التصوير بطيف الكتلة MALDI يسمح بتصور دهون متعددة في آن واحد دون فقدان تموضعها المكاني. أخرج عينات الأنسجة المجمدة سريعاً من وحدة التخزين عند درجة حرارة -80 °C.

أزل المحفظة من سطح العدسة لتثبيت مقطع كامل من عدسة عجل بقري. ضع قطرة أو قطرتين من الماء على منصة قطع الأنسجة في جهاز المقطاع بالتبريد (cryostat). ضع العدسة بسرعة في الماء قبل أن تتجمد، وذلك عندما يصل جهاز المقطاع بالتبريد إلى درجة الحرارة المثلى.

قم بتقطيع النسيج استوائياً إلى مقاطع بسمك 20 micron. تخلص من المقاطع النسيجية الأولى واستخدم فقط الشرائح القريبة من المستوى الاستوائي أو التي تقع عليه لتصوير نسيج عدسة العين. أضف 1.5 µL من حمض الفورميك لترطيب سطح شريحة زجاجية مطلية بـ ITO مسبقاً.

بعد ذلك، انقل مقاطع الأنسجة بعناية إلى الشريحة داخل المبرد المجهري (cryostat). ثم، قم بتجفيف الشرائح بالتجميد (lyophilize) لمدة 15 دقيقة قبل تطبيق مصفوفة maldi. وباستخدام قلم سائل التصحيح، ضع ثلاث علامات إرشادية على السطح غير الموصل لشريحة الزجاج المطلية بـ ITO.

الآن، التقط صورة بصرية لشريحة النسيج باستخدام ماسح ضوئي مسطح واحفظها بتنسيق مناسب مثل TIFF أو jpeg. أولاً، قم بتغطية الحواف على السطح الأمامي للشرائح الزجاجية المطلية بـ ITO باستخدام شريط لاصق حتى لا تكسو المصفوفة حواف الشريحة. قم بتحضير المصفوفة لاستخدامها في مذيب مناسب.

ثم ضع محاليل المصفوفة على أسطح قطاعات الأنسجة. قم بطلاء الشريحة الزجاجية باستخدام 20 دورة من طلاء المصفوفة. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام بخاخ هوائي يعمل بضغط الهواء لتطبيق المصفوفات إذا كان المذيب غير متوافق مع بخاخ المصفوفة الإلكتروني.

بالنسبة لمحلول معايرة الكتلة، يتم تخفيف المحلول القياسي لخليط ضبط ES بنسبة 1 إلى 200 في 60%Isopropanol، ثم يتم إدخال اثنين ميكرولتر في الدقيقة من محلول خليط ضبط ES المخفف في مصدر تأين الرش الكهربائي ثنائي الوضع في جهاز four a transform ion cyclotron resonance ms. يتم تشغيل جهاز F-T-I-C-R في وضع ESI للأيونات الموجبة مع كشف واسع النطاق وحجم الحصول على البيانات بمقدار 1024 كيلوبايت في الثانية. وعادةً ما يتم ضبط معاملات ESI على جهد رش كهربائي شعيري يبلغ 3,900 فولت.

يبلغ جهد درع الرش 3,600 فولت، ومعدل تدفق غاز النيتروجين للمرذاذ لترين في الدقيقة. كما يبلغ تدفق غاز النيتروجين الجاف أربعة لترات في الدقيقة ودرجة الحرارة 200 °C. اضبط أيضاً جهد الكاشط الأول (skimmer one) على 15 فولت.

اضبط زمن الطيران على 0.01 seconds وتدفق غاز الأرجون للتصادم على 0.4 liters per second وزمن تراكم أيونات المصدر على 0.1 second وزمن تراكم أيونات خلية التصادم على 0.2 seconds. قم الآن بضبط بارامترات تشغيل F-T-I-C-R من أجل تحقيق أقصى قدر من الحساسية التحليلية عبر نطاق الكتلة من نسبة الكتلة إلى الشحنة 200 إلى 1400 مع الحفاظ على إشارات اضمحلال الحث الحر إلى حالة التوازن في النطاق الزمني بشكل جيد. ثم قم بالحصول على أطياف كتلة ESI ومعايرة الجهاز باستخدام الكتل المرجعية للمركبات القياسية في محلول E es tuning mix.

لضبط الجهاز للعمل بتقنية MALDI، قم بإذابة عدة أجزاء بحجم 1 µL من محلول قياسي مختلط من turine وINE في محلول المصفوفة بتركيز 1 µM لكل منهما، ثم ضع هذه المحاليل مباشرة على أحد مقاطع الأنسجة العينية. ضع الشريحة في محول شرائح الأنسجة، ثم أدخل المحول من جهة MALDI في مصدر أيونات ESI maldi المزدوج. بعد ذلك، قم بتحسين معاملات تشغيل MALDI المناسبة لقوة الليزر وعدد نبضات الليزر لتجميع إشارة MALDI لكل مسح كتلي.

بعد ضبط الجهاز ومعايرته وتحسينه لتجارب MALDI MSI، قم بمحاذاة الموقع المادي لمقطع النسيج المراد تصويره مع صورته البصرية المسجلة داخل برنامج التصوير. قم بمحاذاة علامات سائل التصحيح الثلاث باستخدام طريقة التثليث ثلاثي النقاط. ثم ابدأ عملية ESI MALDI متزامنة بحيث يحتوي كل طيف كتلة على قمم الكتلة المرجعية لمحلول E ES tuning mix لإجراء معايرة الكتلة الداخلية بعد الاستحواذ.

أولاً، قم بتوهين إشارة ESI عن طريق خفض جهد الشعيرية حتى تهيمن إشارات MALDI على الأطياف، مع الحفاظ على إشارات معايرة ESI مرتفعة بما يكفي لإجراء المعايرة الداخلية للكتلة. بعد ذلك، قم بإعداد طريقة آلية لمسح إشعاع الليزر، وذلك باستخدام تحليل النقاط العشوائية.

حدد مناطق الأنسجة المراد تصويرها واضبط حجم خطوة الـ RA المناسب لليزر. قم بمعايرة أطياف كتلة MALDI باستخدام المعايرة الداخلية للمقارنة الأولية، ولاختيار القمم لعملية MSMS لإزالة النظائر، واختيار القمم أحادية النظير باستخدام نص VBA مخصص وتصدير قوائم القمم أحادية النظير الناتجة. أدخل قيم نسبة الكتلة إلى الشحنة المقاسة في قواعد بيانات Melin nine و/أو HMDB metabolome لمطابقة الكتلة مع إدخالات المكتبة.

بعد ذلك، قم بتوليد صور MALDI لجميع كيانات الليبيدات التي تم اكتشافها عبر المقطع النسيجي بأكمله باستخدام برنامج تصوير بعرض مرشح كتلة يبلغ جزءاً واحداً في المليون عند ذروة القمة. وبمجرد توليد الصور لجميع قيم نسبة الكتلة إلى الشحنة التي تطابق مدخلات قاعدة البيانات، قم بتوليد صور لجميع القمم الأخرى أيضاً للبحث عن أنماط توزيع فريدة يمكن استقصاؤها لاحقاً لبعض الأنسجة المحددة، مثل عدسة البقر. وغالباً ما يُلاحظ تمزق واسع في النسيج عند استخدام طريقة التثبيت بالإذابة المباشرة.

يساعد التجهيز المسبق لشريحة IT OAS باستخدام الإيثانول أو حمض الفورميك في الحفاظ على سلامة مقاطع الأنسجة أثناء تثبيت الأنسجة. ويعد كل من اختيار المصفوفة واختيار المذيب عاملين مهمين يؤثران على جودة أطياف MALDI. تقارن هذه الأمثلة بين طيف تم إنتاجه باستخدام مذيب مصفوفة فعال وبين اختيار غير موفق لمذيب المصفوفة لـ diol.

بمجرد الحصول على مجموعة أطياف الكتلة من تجربة MALDI MSI، يمكن إنشاء صورة لكل أيون من الأيونات التي تم رصدها، حيث يمثل كل بكسل بقعة تشعيع بالليزر من سطح مقطع نسيجي. ويمكن من خلال ذلك تفصيل التركيزات النسبية للمواد التي تم تحليلها في أجزاء مختلفة من المقطع النسيجي.

في معظم التجارب، يتم تطبيع البيانات بناءً على إجمالي تيار الأيونات داخل كل طيف. وبدون هذا التطبيع، فإن المناطق التي تتميز بمصفوفة تحليلية أفضل أو تبلور COC قد تؤدي إلى ظهور إشارات أقوى للمواد التي يتم تحليلها، مما قد يتسبب في انحراف البيانات. كما يمكن أن تؤدي عملية تحضير الأنسجة إلى تغيير الصورة الناتجة بشكل كبير.

إذا كانت العينة شديدة الرطوبة، فستتشتت المواد التحليلية على النسيج وسيُفقد جزء كبير من المعلومات المكانية. استخدم هذا العرض التجريبي لتصوير الأنسجة في عدسة العين مادة diol كـ multi Matrixx لتحديد التوزيع المكاني لليبيدات بواسطة F-T-I-C-R-M-S. ويمكن إتمام تصوير الليبيدات في أنواع مختلفة من الأنسجة باستخدام diol أو مصفوفة أخرى بطريقة مماثلة.