أنثرالين كما مصفوفة لمصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين التصوير على تحويل فورييه ايون السيكلوترون الرنين مطياف الكتلة
نوفمبر 26, 2013
أنثرالين (DT؛ 1،8 ثنائي هيدروكسي-9 ،10-dihydroanthracen-9-واحد) قد سبق وذكرت في شكل مصفوفة MALDI للتصوير الأنسجة من الجزيئات الصغيرة؛ البروتوكولات لاستخدام DT للتصوير MALDI من الدهون الذاتية على يتم توفير سطح أقسام الأنسجة التي كتبها إيجابية أيون MALDI-MS على دقة عالية جدا رباعي-FTICR الصك هنا.
يقوم هذا الإجراء بتحديد موضع العديد من الدهون الداخلية مكانيا داخل عدسة بقرة. باستخدام تقنية تأين الامتصاص بالليزر بمساعدة المصفوفة ، والتصوير الطيفي الكتلي. أولا ، قم بإعداد قسم أنسجة عدسة بقري رقيقة وقم بتطبيق مصفوفة متعددة ، ثم احصل على مجموعة بيانات طيفية لكتلة مالدي.
قم بمعالجة مجموعة البيانات في تمثيل مرئي للدهون المكتشفة في قسم أنسجة العدسة. يمكن لهذه النتائج معا تحديد الموقع والوفرة النسبية للدهون داخل عدسة بقرية وإنتاج تمثيل مرئي لهذا التوزيع مقارنة بالطرق الأخرى مثل استخراج الدهون متبوعا بتحليل LCMS ، يسمح تصوير قياس الطيف الكتلي مالدي بتصور دهون متعددة في وقت واحد دون فقدان توطينها المكاني. قم بإزالة عينات الأنسجة المجمدة من التخزين 80 درجة مئوية تحت الصفر.
قم بإزالة الكبسولة من سطح العدسة لإصلاح قسم عدسة ربلة الساق البقري بالكامل. ضع قطرة أو قطرتين من الماء على مرحلة قطع الأنسجة في ناظم البرد. ضع العدسة بسرعة في الماء قبل أن تتصلب عندما يتوازن ناظم التبريد مع درجة الحرارة المثلى.
قطع الأنسجة استوائية إلى أقسام بسمك 20 ميكرون. تخلص من أقسام الأنسجة الأولى واستخدم فقط الشرائح القريبة من المستوى الاستوائي أو أضفه لتصوير أنسجة عدسة العين. أضف 1.5 ميكرولتر من حمض الفورميك لترطيب سطح الشريحة الزجاجية المطلية ب ITO مسبقا.
ثم انقل أقسام الأنسجة بعناية إلى الشريحة داخل الناظم الكريوست. بعد ذلك ، قم بتجميد الشرائح لمدة 15 دقيقة قبل تطبيق مصفوفة مالدي. باستخدام قلم سائل التصحيح ، أضف ثلاث علامات تعليمية على السطح غير الموصل للشريحة الزجاجية المطلية ب ITO.
الآن التقط صورة بصرية لشريحة الأنسجة باستخدام ماسح ضوئي مسطح واحفظها بتنسيق مناسب مثل TIFF أو jpeg. أولا ، قم بتغطية الحواف الموجودة على السطح الأمامي للشرائح الزجاجية المطلية ب ITO بشريط لاصق حتى لا تغطي المصفوفة حواف الشريحة. تحضير المصفوفة لاستخدامها في مذيب مناسب.
ثم ضع محاليل المصفوفة على أسطح أقسام الأنسجة. قم بتغطية الشريحة الزجاجية باستخدام 20 دورة من طلاء المصفوفة. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام بخاخ البخاخة بمساعدة الهواء المضغوط لتطبيق المصفوفات إذا كان المذيب غير متوافق مع بخاخ المصفوفة الإلكترونية.
بالنسبة لحل معايرة الكتلة ، قم بتخفيف الحل القياسي لمزيج ضبط ES بمعامل واحد إلى 200 في 60٪ أدخل الأيزوبروبانول ميكرولترين في الدقيقة من محلول مزيج ضبط ES المخفف في مصدر أيون التأين بالرش الكهربائي في الوضع المزدوج على الجهاز لأربعة رنين سيكلوترون أيون تحويل مللي ثانية. قم بتشغيل أداة F-T-I-C-R في وضع ESI الأيوني الموجب مع اكتشاف النطاق العريض وحجم الحصول على البيانات يبلغ 1024 كيلوبايت في الثانية. عادة ما يتم تعيين معلمات ESI لجهد الرش الكهربائي الشعري 3 ، 900 فولت.
جهد درع الرش يبلغ 3 ، 600 فولت تدفق غاز النيتروجين البخاخات بمعدل لترين في الدقيقة. تدفق غاز النيتروجين الجاف بمعدل أربعة لترات في الدقيقة ودرجة حرارة 200 درجة مئوية. اضبط أيضا الكاشطة جهد واحد على 15 فولت.
وقت الرحلة إلى 0.01 ثانية تدفق غاز الأرجون إلى 0.4 لتر في الثانية ، وقت تراكم أيونات المصدر إلى 0.1 ثانية ، ووقت تراكم أيونات خلية التصادم إلى 0.2 ثانية. الآن قم بضبط معلمات تشغيل F-T-I-C-R من أجل زيادة الحساسية التحليلية إلى أقصى حد على نطاق الكتلة من نسبة الكتلة إلى الشحن من 200 إلى 1400 مع الحفاظ على إشارات اضمحلال الحث الخالية من المجال الزمني الجيد. ثم احصل على أطياف الكتلة ESI وقم بمعايرة الأداة باستخدام الكتل المرجعية للمركبات القياسية في محلول مزيج الضبط E es.
لضبط الأداة لتشغيل MALDI ، قم بإذابة عدة أجزاء ميكرولتر واحد من محلول تورين مختلط ومحلول قياسي INE في محلول المصفوفة بتركيز ميكرومولار واحد لكل منهما وحدد هذه المحاليل مباشرة على أحد أقسام أنسجة العينة. ضع الشريحة في محول شريحة المناديل وقم بتحميل المحول من جانب MALDI إلى مصدر أيون ESI maldi المزدوج. بعد ذلك ، قم بتحسين معلمات تشغيل MALDI المناسبة لطاقة الليزر وعدد لقطات الليزر لتراكم إشارة MALDI لكل مسح جماعي.
بعد ضبط ومعايرة وتحسين الأداة لتجارب maldi MSI ، قم بمحاذاة الموقع المادي لقسم الأنسجة المراد تصويره مع صورته البصرية المسجلة داخل برنامج التصوير. قم بمحاذاة علامات سائل التصحيح الثلاثة باستخدام طريقة التثليث ثلاثية النقاط. ثم ابدأ عملية ESI MALDI المتزامنة بحيث يحتوي كل طيف كتلي على قمم الكتلة المرجعية لحل مزيج الضبط E ES لمعايرة الكتلة الداخلية بعد الاستحواذ.
قم أولا بتخفيف إشارة ESI عن طريق تقليل الجهد الشعري حتى تهيمن إشارات MALDI على الأطياف ، بينما لا تزال إشارات عيار ESI عالية بما يكفي لمعايرة الكتلة الداخلية. بعد ذلك ، قم بإعداد طريقة صياغة آلية للإشعاع بالليزر. باستخدام تحليل بقعة عشوائية.
حدد مناطق الأنسجة المراد تصويرها وقم بتعيين حجم خطوة الليزر RA المناسب. معايرة أطياف كتلة MALDI باستخدام المعايرة الداخلية للمقارنة الأولية ، وتحديد قمم MSMS de نظائر وتحديد قمم النظائر الأحادية باستخدام برنامج نصي VBA مخصص وتصدير قوائم الذروة أحادية النظائر الناتجة. أدخل قيم نسبة الكتلة إلى الشحن المقاسة في قواعد بيانات Melin nine و / أو قواعد بيانات metabolome HMDB لمطابقة الكتلة مع إدخالات المكتبة.
بعد ذلك ، قم بإنشاء صور maldi لجميع الكيانات الدهنية المكتشفة عبر قسم الأنسجة بأكمله باستخدام برنامج تصوير بعرض مرشح كتلة يبلغ جزءا واحدا في المليون في ذروة الذروة. بمجرد إنشاء الصور لجميع قيم نسبة الكتلة إلى الشحن التي تتطابق مع إدخالات قاعدة البيانات ، قم بإنشاء صور لجميع القمم الأخرى أيضا للبحث عن أنماط التوزيع الفريدة التي يمكن التحقيق فيها لاحقا لبعض الأنسجة المحددة ، مثل عدسة البقر. غالبا ما يلاحظ تمزق واسع النطاق للأنسجة عند استخدام تركيب الذوبان المباشر.
يساعدPreco من شريحة OAS مع الإيثانول أو حمض الفورميك في الحفاظ على سلامة أقسام الأنسجة أثناء تركيب الأنسجة. يعد كل من اختيار المصفوفة واختيار المذيب من العوامل المهمة التي تؤثر على جودة أطياف MALDI. تقارن هذه الأمثلة طيفا المنتج بمذيب مصفوفة فعال مع اختيار ضعيف لمذيب المصفوفة للديول.
بمجرد الحصول على مجموعة الأطياف الكتلية من تجربة Maldi MSI ، يمكن إنشاء صورة لكل من الأيونات المكتشفة. مع كل بكسل يمثل بقعة تشعيع الليزر من سطح قسم الأنسجة. يمكن تفصيل التركيزات النسبية للتحليلات في الأجزاء المختلفة من قسم الأنسجة.
في معظم التجارب ، يتم تطبيع البيانات إجمالي تيار الأيونات داخل كل الطيف. بدون مناطق التطبيع هذه مع مصفوفة تحليل أفضل ، يمكن أن يتسبب بلورة COC في إشارات أقوى للتحليلات ، وهذا من شأنه أن يحرف البيانات. يمكن أن يؤدي تحضير الأنسجة أيضا إلى تغيير الصورة التي يتم إنشاؤها بشكل كبير.
إذا كانت العينة رطبة جدا ، إلغاء تحديد موقع التحليلات على الأنسجة وستفقد الكثير من المعلومات المكانية. استخدم هذا العرض التوضيحي لتجربة تصوير الأنسجة على عدسة العين الديول كمصفوف متعدد لتحديد التوزيع المكاني للدهون بواسطة F-T-I-C-R-M-S. يمكن تصوير الدهون في أنواع مختلفة من الأنسجة باستخدام الديول أو مصفوفة أخرى بطريقة مماثلة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه الدراسة بروتوكولاً لاستخدام الديثرانول (DT) كمصفوفة MALDI لتصوير الدهون الذاتية في أنسجة عدسة البقر. تسمح الطريقة بالتحديد المكاني لدهون متعددة دون فقدان سياقها المكاني.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأعصاب
- الكيمياء الحيوية
- قياس الطيف الكتلي
الخلفية
- تم استخدام الديثرانول سابقًا كمصفوفة MALDI.
- يمكن تصوير MALDI تحليل الجزيئات الصغيرة في الأنسجة.
- الدهون الذاتية تلعب أدوارًا حاسمة في العمليات البيولوجية.
- قد تفقد طرق تحليل الدهون التقليدية المعلومات المكانية.
غرض الدراسة
- لتوفير بروتوكول مفصل لاستخدام DT في تصوير MALDI.
- لتصور توزيع الدهون في أنسجة عدسة البقر.
- لمقارنة تصوير MALDI بطرق استخلاص الدهون التقليدية.
الطرق المستخدمة
- إعداد أقسام رقيقة من أنسجة عدسة البقر.
- تطبيق مصفوفة متعددة لتصوير MALDI.
- اكتساب مجموعات بيانات طيف الكتلة MALDI.
- تجهيز مجموعات البيانات إلى تمثيلات مرئية لتوزيع الدهون.
النتائج الرئيسية
- التحديد الناجح للعديد من الدهون الذاتية.
- تمثيل مرئي لوفرات وتوزيع الدهون.
- تبيان مزايا التحديد المكاني على LCMS.
- رؤى حول أدوار الدهون داخل عدسة البقر.
الاستنتاجات
- تصوير MALDI باستخدام DT فعال لتحليل الدهون.
- تحافظ هذه الطريقة على المعلومات المكانية للدهون.
- تطبيقات محتملة في مجالات بحث بيولوجية مختلفة.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Matrix-assisted laser desorption/ionization imaging (MALDI-IMS) enables spatial mapping of endogenous lipids in tissue sections, supporting target validation and mechanistic de-risking in early drug discovery. The use of dithranol as a matrix on ultrahigh-resolution FTICR-MS improves detection of low-molecular-weight compounds while reducing chemical noise, enhancing predictive confidence in lipid biomarker identification. This approach supports assay development and screening readiness by providing reproducible, label-free molecular distributions directly from tissue, informing go/no-go decisions in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of lipid-mediated therapeutic hypotheses by mapping endogenous lipid distributions in disease-relevant tissue models.
- Operational Value: Provides label-free, spatially resolved lipid profiles that support functional target validation and pathway de-risking.
- Predictive Value: Increases confidence in lipid target selection by reducing false positives from matrix interference through high-resolution FTICR-MS detection.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, multiplexed lipid readouts from single tissue sections, enabling parallel compound screening without spatial information loss.
- Operational Value: Delivers reproducible MALDI-IMS data through standardized matrix application (e.g., dithranol in solvent) and instrument calibration protocols.
- Assay Readiness: Supports scalable lipid screening workflows by producing stable, high-fidelity mass spectra suitable for database matching and image generation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase lipid localization to preclinical validation by preserving spatial context lost in extraction-based methods like LCMS.
- Mechanistic De-risking: Clarifies lipid roles in tissue physiology (e.g., bovine lens) to inform biomarker relevance and pathway modulation strategies.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on spatially resolved lipid modulation patterns, reducing late-stage attrition due to unanticipated tissue-specific effects.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing spatially resolved lipid data that informs mechanistic understanding and assay design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing endogenous lipid dynamics in tissue sections.
- Screening: Enables assay-ready, reproducible lipid profiling via standardized matrix application and FTICR-MS data acquisition.
- Analytics: Delivers high-resolution mass measurements (1 ppm mass filter width) and isotopic peak selection for confident lipid identification via HMDB or METLIN database matching.
- Translational Research: Maintains spatial continuity from discovery to preclinical work by avoiding analyte delocalization during tissue processing.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable MALDI-IMS platform for lipid screening across tissue types, reducing reliance on destructive extraction methods.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Improves target validation confidence by reducing matrix background and resolving analyte signals via FTICR-MS.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized tissue preparation, matrix coating (20 cycles), and internal calibration using ES tuning mix.
- Strategic Value: Increases capital efficiency by enabling parallel lipid detection in single experiments, reducing need for sequential LCMS runs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by revealing tissue-specific lipid distributions that inform target safety and efficacy profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue cryosectioning, matrix application, and FTICR-MS operation in dual ESI/MALDI mode.
- Depends on access to ultrahigh-resolution FTICR-MS instrumentation and optimized laser parameters for MALDI signal accumulation.
- Necessitates cross-team standardization of tissue mounting (e.g., ITO slide pre-wetting with formic acid) to prevent delocalization.
- Involves adaptation considerations for solvent-matrix compatibility (e.g., avoiding solvents that cause tissue tearing during thaw mounting).
- Limited by tissue integrity challenges during preparation, which can be mitigated by pre-coating slides with ethanol or formic acid.
