الغزو الجرثومي المعوي الخلايا الظهارية المعوية

الهدف العام من التجربة التالية هو استخدام نموذج غرفة الانتشار الرأسية أو VDC لاستقصاء التفاعلات البكتيرية مع غزو الخلايا الظهارية المعوية. ويتحقق ذلك أولاً باستخدام مرشح خاص مثبت عليه طبقة أحادية مستقطبة من خلايا caco two الظهارية المعوية لإنشاء حجرتين منفصلتين، قمة وقاعدية جانبية، في VDC. وفي الخطوة الثانية، تُضاف اللقاحات البكتيرية المستهدفة إلى الحجرة القمية.

في ظل ظروف هوائية محدودة ومزارع خلوية، يتم إضافة الوسط إلى الحجرة القاعدية الجانبية في ظروف هوائية، ثم في النقاط الزمنية المطلوبة أثناء الزراعة المشتركة، يُزال المرشح ويتم تعداد البكتيريا المتفاعلة أو الموجودة داخل الخلايا. وفي النهاية، يمكن ملاحظة زيادة في عدد البكتيريا المتفاعلة وداخل الخلوية باستخدام نموذج VDC مقارنة بظروف الزراعة الهوائية القياسية. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل مقايسات الالتصاق والغزو القياسية في المزارع النسيجية، في أن الزراعة المشتركة للبكتيريا وخلايا الظهارة المعوية تتم في ظروف مخبرية تحاكي بشكل أوثق الظروف الحيوية للأمعاء البشرية.

سيقوم بتقديم هذا الإجراء ن. فيدا ناس، طالبة الدكتوراه في مختبري، ودومينيك ميلز، باحث ما بعد الدكتوراه الذي طور نموذج غرفة الانتشار الرأسية كجزء من دراسته للدكتوراه في مختبري. ابدأ بزراعة 4 × 10⁵ من خلايا Caco-2 الظهارية المعوية لكل مرشح بمسامية 0.4 micron في وسط استزراع، ثم اترك الخلايا تنمو حتى تصل إلى حالة الاستقطاب لمدة 21 يومًا، مع تغيير الوسط كل يومين إلى ثلاثة أيام للتأكد من حالة الاستقطاب للطبقة أحادية الخلية. استخدم مقياس مقاومة الفولت-أوم لقياس المقاومة الكهربائية عبر الظهارة.

قبل 24 ساعة من بدء مقايسة المزارع المشتركة في VDC، يتم تحضين بكتيريا jejuni على طبق آجار دم طازج تحت ظروف هوائية دقيقة في حاضنة ذات جو متغير. وفي الوقت ذاته، يتم تحضين مسبق لـ 30 milliliters من مرق Bruce تحت الظروف ذاتها. وفي يوم التجربة، تُغمر أنصاف غرف VDC وكذلك الحلقات الدائرية والسدادات في محلول تعقيم. ثم تُستخدم حقنة معقمة سعة 20 milliliter لضخ المحلول عبر مداخل الغاز في كلا نصفي الغرف. وبعد مرور ساعة، تُشطف مكونات VDC بماء معقم طازج باستخدام حقنة معقمة أخرى سعة 20 milliliter لشطف مداخل الغاز.

بعد ذلك، يتم حصاد نصف مستنبت طبق أغار الدم الخاص بـ CJ jui في 1 mL من مرق Barella الذي تم تحضينه مسبقاً للحصول على ما يقرب من 10¹⁰ CFU لكل 1 mL. قم بقياس الكثافة الضوئية للمعلق البكتيري عند 600 نانومتر لتقدير عدد الوحدات المكونة للمستعمرات البكتيرية (CFUs) بشكل شبه كمي، ثم اضبط المعلق البكتيري للوصول إلى مستوى اللقاح المطلوب في إجمالي 4 mL من مرق Bruce الذي تم تحضينه مسبقاً. قم بإجراء تخفيف تسلسلي من هذا المعلق البكتيري النهائي، ثم انشر التخفيف المناسب على أطباق أغار الدم في ثلاث مكررات، وحضن الأطباق في حاضنة الجو المتغير لمدة 48 ساعة.

الآن، ضع النصف السفلي من حجرة VDC بشكل مسطح على طاولة المختبر وثبّت حلقة دائرية (O-ring) عليه. بعد ذلك، افصل مرشحًا واحدًا يحمل الخلايا الظهارية المعوية عن الحامل واغسله ثلاث مرات بـ 400 µL من محلول PBS المعقم. ضع المرشح فوق النصف السفلي من الحجرة، مع التأكد من بقاء الحلقة الدائرية في مكانها، ثم أنزل النصف العلوي من الحجرة برفق في موضعه.

بمجرد تجميع غرفتي النصفين، ثبتهما معاً باستخدام المشابك الحلقية وضع جهاز VDC أفقياً على سطح المختبر بحيث تكون الفتحتان متجهتين للأعلى. أضف اللقاح البكتيري إلى غرفة النصف القمية، ثم أضف 4 mL من وسط زراعة الخلايا إلى غرفة النصف الجانبية القاعدية. ضع القطع الطرفية في الفتحات الموجودة في كلا غرفتي النصفين، ثم ضع جهاز VDC في حاضنة الغلاف الجوي المتغير.

بالقرب من مجمع الغازات، افتح منظم إمداد الغاز المتصل بمجمع الغازات. قم بتوصيل الأنبوب الممتد من المجمع بمدخل الغاز في الغرفة النصفية الجانبية القاعدية لـ VDC، ثم قم بتوصيل أنبوب مخرج الغاز المؤدي إلى خارج حاضنة الغلاف الجوي المتغير بأحد المخارج الموجودة في القطعة الطرفية للغرفة النصفية الجانبية القاعدية. أغلق المخرج الآخر في القطعة الطرفية للغرفة النصفية الجانبية القاعدية.

بعد ذلك، افتح تدفق الغاز في مجمع الغاز ببطء شديد لتجنب زيادة ضغط الغاز ولتحقيق تدفق غاز بمعدل فقاعة واحدة كل ثانيتين إلى خمس ثوانٍ بعد فترة الزراعة المشتركة المناسبة. أغلق منظم إمداد الغاز المتصل بمجمع الغاز. ثم قم بتفريغ تدفق الغاز الموجود في VDC عند المجمع وافصل مدخل الغاز ومخرج الغاز والسدادة من VDC.

بعد ذلك، قم بإزالة الـ VDC من حاضنة الغلاف الجوي المتغير. ثم قم بسحب السوائل الطافية الجانبية القمية والقاعدية وتخزينها عند درجة حرارة -80 درجة مئوية للتحليل اللاحق. قم بإزالة مشابك الحلقة وتفكيك الـ VDC برفق.

قم بإزالة المرشح من نصف الغرفة وانقله إلى طبق زراعة خلايا معقم يحتوي على ستة آبار. بعد ذلك، اغسل جهاز VDC بالماء المعقم واحفظه لجولة التجارب التالية من أجل تعداد العدد الإجمالي للبكتيريا المتفاعلة. اغسل الخلايا الظهارية المعوية من ثلاث إلى أربع مرات باستخدام 400 µL من PBS المعقم، ثم قم بتحليلها في 400 µL من PBS المعقم الذي يحتوي على Triton X 100 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وأجرِ تخفيفاً تسلسلياً من ناتج تحلل الخلايا، يليه زرع التخفيفات المناسبة على أطباق أغار الدم في ثلاث مكررات.

ثم تُحضن الأطباق عند 37 درجة Celsius في حاضنة ذات جو متغير لمدة 48 ساعة لتعداد العدد الإجمالي للبكتيريا الغازية. تُحضن الخلايا الظهارية المعوية مع 400 µL من وسط زراعة الخلايا المحتوي على 150 µg/mL من Gentamycin لمدة ساعتين في حاضنة زراعة أنسجة قياسية لقتل البكتيريا خارج الخلوية. بعد ذلك، يتم قياس وحدات تشكيل المستعمرات بعد تحلل الخلايا، والتخفيف المتسلسل، والزراعة كما تم توضيحه للتو.

توضح البيانات التالية مقارنة بين عدد بكتيريا CJ jui التي تتفاعل مع خلايا caco two أو تغزوها بعد ثلاث، أو ست، أو 24 ساعة من الزراعة المشتركة تحت ظروف مقايسة الزراعة الخلوية القياسية مقابل استخدام نموذج VDC. على سبيل المثال، بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة، يمكن ملاحظة أقل من 10⁷ CFU من بكتيريا CJ Juna تتفاعل مع خلايا CACO two في ظل ظروف الزراعة الخلوية القياسية. ومع ذلك، بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة في نموذج VDC، يمكن ملاحظة ما يقرب من 10⁸ CFU من بكتيريا CJ jui تتفاعل مع خلايا CACO two، وهي زيادة في تفاعلات CJ jui مع الخلايا الظهارية المعوية (IEC) تصل إلى عشرة أضعاف تقريبًا.

عند مقارنة عدد بكتيريا CJ jui الغازية تحت ظروف الزرع القياسية مقابل ظروف VDC، يمكن عزل ما يقرب من 10⁵ من وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) داخل الخلوية لـ CGE jui من خلايا CACO two بعد 24 ساعة في ظروف الزرع الخلوي القياسية. بينما بعد 24 ساعة من الزراعة المشتركة في نموذج VDC، يمكن عزل ما يقرب من 10⁷ من وحدات تشكيل المستعمرات (CFUs) داخل الخلوية من خلايا CACO two، مما يمثل زيادة في CGE داخل الخلوية تصل إلى 100 ضعف تقريباً. وأثناء تنفيذ هذا الإجراء، من المهم مراقبة تدفق الغاز في الغرفة القاعدية الجانبية بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال إمراضية abuc لاستقصاء كل من الأساس الجيني للتفاعل البكتيري مع الخلايا الظهارية المعوية، وكذلك استجابة المضيف المناعية الفطرية للعدوى البكتيرية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية استخدام نموذج غرفة الانتشار الرأسي لدراسة تفاعلات البكتيريا المعوية الأخرى مع الخلايا الظهارية المعوية والظروف التي تمثل بشكل أدق تلك الموجودة في الأمعاء البشرية.