عزل الاوعية الدموية الدقيقة البطانية أنابيب الشرايين ماوس المقاومة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل أنابيب الخلايا البطانية من الشريان الشرسوفي العلوي للفأر (SEA) لدراسة ديناميكيات الإشارات داخل الخلايا وبين الخلوية لبطانة وعائية دقيقة أصلية وسليمة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق عزل الشريان SEA من جدار العضلات الهيكلية في منطقة البطن لدى الفأر. وفي الخطوة الثانية، يتم هضم الوعاء الدموي بلطف وبشكل جسدي، ثم يتم إجراء عملية TAT بعناية لفصل خلايا العضلات الملساء والغلالة البرانية عن أنبوب الخلايا البطانية.

في الخطوة النهائية، يتم تثبيت الأنبوب في غرفة تدفق ويتم غمره بمحلول ملحي فسيولوجي. وفي النهاية، يمكن استخدام التصوير البؤري (confocal imaging) لتصور إشارات الكالسيوم في الأنبوب البطاني للأوعية الدقيقة الأصلي والسليم. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل زراعة الخلايا البطانية، في أن الخلايا البطانية التي تشكل الأنبوب تحافظ على شكلها الأصلي، وتعبيرها البروتيني، واستجابتها؛ حيث تُعد البطانة جزءاً أساسياً من التحكم في تدفق الدم في جميع أنحاء الجسم.

يتيح تطبيق هذه التقنية استقصاء أحداث التواصل بين الخلايا التي تتوسط التحكم في تدفق الدم وكيف يمكن أن تختل أثناء الخلل الوظيفي الوعائي. لعزل SEA أولاً، قم بإجراء شق صغير عبر الجلد فوق منطقة العانة مباشرةً لفأر مخدّر، ووسع الشق جانبياً في كل اتجاه وصولاً إلى الأطراف الخلفية المعنية، ثم تابع الشق طولياً على طول الخط الناصف البطني وصولاً إلى أعلى القفص الصدري، مع توسيع الشق جانبياً مرة أخرى في كل اتجاه وصولاً إلى الأطراف الأربعة المعنية. الآن، ارفع الجلد برفق واقطع النسيج الضام الذي يربط الجلد بالعضلات الأساسية، مما يكشف السطح الكامل للعضلات البطنية.

قم بري العضلة المكشوفة بمحلول ملحي في درجة حرارة الغرفة. ثم، وباستخدام مجهر ستيريو، ارفع الوسادة الدهنية الموجودة في أسفل عظم القص. قم بإجراء شق عبر الوسادة الدهنية وعلى طول الضلع السفلي.

يجب أن يكون الشريان السباتي الخارجي (SEA) مرئياً الآن، مع الحرص على عدم إتلاف الشريان، ثم يتم ري الأنسجة المكشوفة بمزيد من المحلول الملحي في درجة حرارة الغرفة. بعد إرجاع الطبقة العلوية من العضلات الهيكلية، يتم تسجيل طول الشريان السباتي الخارجي (SEA)، ثم تُستأصل بعناية طبقة العضلات الرقيقة الموجودة أسفل الشريان. بعد ذلك، تُستخدم ملاقط مائلة لتمرير خيط جراحي من الحرير قياس 6-0 أسفل الشريان السباتي المشترك (SCA).

بعد ذلك، يتم ربط الشريان والوريد المجاور له للحفاظ على الضغط داخل الوعاء الدموي ومنع تسرب الدم من تجويفه. وبعد ربط الشريان السباتي المشترك (SCA) في الجانب المقابل، يتم إجراء شق على طول الخط الناصف للعضلات البطنية لفصل الجانبين عن بعضهما، ثم يتم تمديد الشق جانبيًا في كل اتجاه كما تم القيام به بالنسبة للجلد. استمر في إجراء الشق رأسيًا على طول الحافة الخارجية لفصل العضلة البطنية تمامًا عن الجسم.

بعد ذلك، يتم قطع الـ SEA فوق منطقة الربط للحفاظ على الختم، وتوضع العضلة والشريان المعزولتان في دورق سعة 50 milliliter يحتوي على 10 milliliters من محلول التشريح المنظم عند درجة حرارة 4 °C. وبعد عزل العضلة من الجانب الآخر من البطن، تُحضن الأنسجة في محلول التشريح المنظم لمدة 10 دقائق. الآن، توضع العضلة البطنية التي تحتوي على الـ SEA في طبق بتري عند درجة حرارة 4 °C مغطى بطبقة من cyl guard ويحتوي على محلول التشريح المنظم. استخدم دبابيس حشرات مقاس 0.15 millimeter لشد الـ SEA والعضلة إلى أطوالهما التقريبية الملحوظة سابقاً داخل الجسم (in vivo).

ثبّت الشريان السรีلي الخارجي (SEA) إلى واقي الأسطوانة مع توجيه العضلة بحيث تكون الطبقة الرقيقة المواجهة للبريتون في الأعلى. بعد ذلك، وبالعمل من موقع الربط العلوي باتجاه النهاية السفلية، قم بتخليص حوالي 1 إلى 2 سم من الشريان السรีلي الخارجي (SEA) من الوريد المقترن به والأنسجة المحيطة حتى الوصول إلى موقع أول تفرع رئيسي. اقطع الشريان السรีلي الخارجي (SEA) فوق موقع التفرع مباشرةً وأسفل موقع الربط مباشرةً.

بعد ذلك، استخدم قطعة من الأنابيب المرنة لتوصيل الطرف الخلفي للماصة بحقنة سعة 5 mL تحتوي على محلول منظم للتشريح مبرد بالثلج. قم بتثبيت طرف ماصة القسطرة داخل غرفة التشريح وأجرِ عملية القسطرة للشريان السباتي الخارجي (SEA). بمجرد غسل جميع كريات الدم الحمراء، قم بإزالة الشريان السباتي الخارجي (SEA) من ماصة القسطرة، ثم ارفع الماصة من طبق التشريح لعزل الأنابيب البطانية.

أولاً، املأ أنبوب زرع زجاجي مقاس 12 × 75 مليمتر حتى المنتصف بمحلول منظم للتشريح بارد جداً. ثم بعد تقطيع SEA إلى قطع يتراوح طولها من 1 إلى 3 مليمتر، استخدم ملقطاً مائلاً لنقل القطع الشريانية إلى أنبوب الزرع ووضع الأنبوب على الثلج. بعد ذلك، امزج إنزيمات الهضم مع محلول التفكيك للوصول إلى حجم نهائي قدره 1 مليلتر في أنبوب زرع منفصل مقاس 12 × 75 مليمتر، وقم بتسخين محلول الإنزيم مسبقاً إلى 37 درجة مئوية باستخدام كتلة تسخين.

أخرج أنبوبة المزرعة التي تحتوي على قطع الشرايين من درجة حرارة 4 °C وضعها في درجة حرارة الغرفة لتدفئتها بينما يتم تسخين المحلول الإنزيمي إلى 37 °C. قم بسحب منظم التشريح الموجود في أنبوبة المزرعة (والذي أصبح الآن في درجة حرارة الغرفة) بعناية، مع ترك حجم صغير يحتوي على قطع الأوعية. الآن، أضف ببطء منظم التفكيك بدون إنزيمات في درجة حرارة الغرفة إلى قطع الأوعية، بحيث تظل قطع الشرايين في قاع أنبوبة المزرعة لغسل أي كمية متبقية من منظم التشريح.

بمجرد أن يصل محلول الإنزيم إلى 37 درجة مئوية، قم بسحب منظم التفكيك من أنبوب الزراعة الذي يحتوي على قطع الوعاء مرة أخرى، مع ترك حجم صغير يحتوي على قطع الوعاء. الآن، انقل محلول الإنزيم عند 37 درجة إلى أنبوب الزراعة وحضّن أنبوب الزراعة في الكتلة التسخينية لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. وأثناء فترة التحضين، قم بتجهيز ماصة لتراتية مملوءة بالزيت المعدني، وقم بتحديد الماصة، ثم اصنع كسراً نظيفاً، واكسر الماصة باستخدام ملقط النار، وصقل طرف الماصة وثبته في حقنة مجهرية مثبتة في مناور مجهري.

بعد ذلك، اسحب مكبس المحقنة الدقيقة لملء الماصة بـ 2 nanoliters من محلول التفكيك المنظم، وضع طرف الماصة فوق غرفة التدفق عند انتهاء فترة التحضين. بعد سحب المحلول المنظم بعناية كما تم توضيحه للتو، اغسل القطع الشريانية بـ 4 milliliters من محلول التفكيك المنظم في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، اسحب بلطف قطعة وعائية واحدة باستخدام ماصة دقيقة سعة 1 milliliter وضع الوعاء في غرفة تدفق تحتوي على 1 milliliter من محلول التفكيك المنظم.

ضع طرف ماصة التدوير بالقرب من أحد طرفي قطعة الوعاء، ثم اسحب قطعة الوعاء إلى داخل ماصة التدوير بمعدل 225 nanoliters في الثانية تقريبًا، وذلك لتجنب إحداث إجهاد ميكانيكي للخلايا البطانية، ثم أخرج الوعاء مرة أخرى إلى الغرفة. إذا تمت عملية الهضم بنجاح، ستنفصل خلايا العضلات الملساء والطبقة الخارجية عن الأنبوب البطاني. قم بإبعاد الطبقة الخارجية عن الأنبوب البطاني في أسرع وقت ممكن لمنعها من التشابك مع الأنبوب، ثم كرر عملية التدوير كما تم توضيحها للتو حتى تنفصل جميع خلايا العضلات الملساء.

بعد التكرار الأخير، يتم وضع الأنبوب البطاني المعزول في مركز غرفة التدفق، بحيث يكون محاذياً لاتجاه التدفق، ثم تُزال ماصة التحفيز. يتم تثبيت ماصات التثبيت في أجهزة تحريك دقيقة مثبتة عند كل طرف من طرفي غرفة التدفق، ثم توضع رؤوسها عند الطرفين المقابلين للأنبوب البطاني. تُخفض ماصات التثبيت، واحدة تلو الأخرى، فوق الطرفين المتقابلين للأنبوب، مع الضغط على الأنبوب باتجاه قاع الغرفة، على مسافة 50 micrometers تقريباً من كل طرف من طرفي الأنبوب.

بمجرد أن تلمس ماصة التثبيت الأنبوب، اسحبها ببطء على طول محور الأنبوب، مع تمديدها لتصل إلى طولها التقريبي في الجسم الحي. اضغط بالماصة على قاع الغرفة لتثبيت الأنبوب، ثم ابدأ تدفق محلول الإرواء باستخدام مضخة 연دية (peristaltic pump) للحفاظ على تدفق مستمر لمحلول الإرواء عبر الأنبوب البطاني. تظهر في هذه الصورة المأخوذة بتقنية تباين التداخل التفاضلي (differential interference contrast) أنبوب خلايا بطانية معزول من SEA بعد عملية إرواء استمرت لمدة ساعة واحدة باستخدام محلول منظم للإرواء بمعدل 3 mL/min في درجة حرارة الغرفة.

يوضح هذا المقطع استجابات الكالسيوم في أنبوب خلوي بطاني محمل بـ flu oh four استجابةً لتحفيز باستخدام الأسيتيل كولين بتركيز 1 micromolar. تم جمع صور الفلورة التمثيلية هذه في نقاط زمنية مختلفة بعد تحفيز الأنبوب البطاني بالأسيتيل كولين. لاحظ كيف يتذبذب الكالسيوم داخل الخلايا بمرور الوقت.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب إلحاق ضرر ميكانيكي بالأنبوب البطاني أثناء عملية التموضع والتثبيت بالدبابيس، حيث أن الخلايا البطانية رقيقة للغاية وسهلة التلف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تتكون لديك فكرة جيدة عن كيفية عزل الأنابيب البطانية من الشريان الشرسوفي العلوي للفأر، وبالتالي دراسة بطانة الأوعية الدموية الدقيقة السليمة والأصلية.