نموذج في المختبر لدراسة الاستجابات المناعية لخلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة لعدوى الفيروس المخلوي التنفسي البشري

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة استجابة الخلايا المناعية البشرية للعدوى بالفيروس المخلوي التنفسي أو RSV. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زراعة مخزون معدٍ من RSV على خلايا helo. وفي الخطوة الثانية، يتم تنقية مخزون RSV المزروع بواسطة الطرد المركزي الفائق.

بعد ذلك، يتم عزل الخلايا المناعية الأولية من دم الإنسان عن طريق الطرد المركزي الكثافي. وفي الخطوة النهائية، يتم تحفيز الخلايا المناعية المعزولة باستخدام الفيروس. وفي النهاية، يمكن تقييم الاستجابة المناعية الخلوية لعدوى RSV عن طريق E iza QPCR أو قياس التدفق الخلوي.

تُعد هذه التقنية إضافة قيمة لدراسة عدوى الفيروس المخلوي التنفسي (RSV). يتميز هذا الفيروس بقدرة عالية على التكيف مع البشر؛ ولذلك، من المهم استخدام الخلايا المناعية البشرية لدراسة المسارات الالتهابية المشاركة في إمراضية الفيروس.

على الرغم من أن الفيروس المستخدم في هذا الفيديو هو RSV، إلا أنه يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة لدراسة فيروسات أخرى مثل فيروس الإنفلونزا أو الفيروس الأنفي (rhinovirus). ابدأ بتدفئة أنبوبة من المخزون المجهز من فيروس RSV البشري في حمام مائي عند درجة حرارة 37 °C. وبمجرد ذوبان الفيروس، قم بتخفيف المخزون في حصص مقدارها 4 mL من وسط العدوى لكل دورق.

مع الحفاظ على MOI عند 0.1 أو أقل، أضف الفيروس إلى خلايا heli وبأقل حجم إجمالي ممكن دون التسبب في جفاف الخلايا. ثم قم بتحضين المزارع لمدة تتراوح من ساعتين إلى أربع ساعات عند 37 درجة مئوية و 5%CO2، مع تحريك القارورة كل 15 دقيقة لإعادة توزيع الوسط. بعد ذلك، قم بإزالة اللقاح واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.

ثم أضف 15 milliliters من وسط الزرع إلى الدوارق واحضنها لمدة تتراوح من ثلاثة إلى خمسة أيام تحت ظروف الزرع نفسها. افحص الخلايا مرة واحدة يومياً باستخدام مجهر الحقل المضيء العادي لمراقبة التغيرات السيتوباثولوجية الناتجة عن الفيروس. وعند ملاحظة هذه التغيرات، قم بكشط الخلايا لحصد RSV، ثم اجمع المعلق في أنبوب معقم سعة 50 milliliter، وقم بعمل vortex للخلايا، ثم قم بطردها مركزياً لمدة 10 minutes عند 1800 Gs وفي درجة حرارة الغرفة لترسيب حطام الخلايا.

لا يترسب RSV عند هذه السرعة، وبالتالي يمكن تخزين الطافي عند درجة حرارة 80- درجة مئوية كمخزون بذري بحجم 1 mL. يجب دائماً تجميد حصص RSV المخصصة للاستخدام المستقبلي تجميداً سريعاً باستخدام النيتروجين السائل لمنع فقدان الجسيمات الفيروسية المعدية. لتنقية RSV، ابدأ بوضع أنبوب طرد مركزي معقم في كل سلة من أجهزة الطرد المركزي الفائقة.

أضف بعد ذلك 5 milliliters من محلول السكروز المعقم بالترشيح والمحضّر حديثاً إلى قاع كل أنبوب. ثم أضف ببطء شديد 30 milliliters من محلول RSV فوق محلول السكروز، مع الحرص على عدم تحريك محلول السكروز والحفاظ على تمايز الطبقات. بعد ذلك، وبداخل كابينة التدفق لضمان التعقيم، قم بموازنة دلاء الطرد المركزي الفائق الستة بعناية باستخدام PBS معقم بحيث يكون الفرق بينها في حدود 0.1 grams، بما في ذلك الأغطية. قم بإجراء عملية الطرد المركزي للفيروس لمدة 1.5 hours عند 20,000 RCF ودرجة حرارة 4 °C.

وبعد اكتمال عملية الطرد المركزي، استخدم ملقطاً معقماً لإخراج أنابيب الطرد المركزي بعناية من السلالات. ستكون الجسيمات الفيروسية قد نفذت عبر طبقة السكروز لتشكل راسباً. أفرغ محتويات أنابيب الطرد المركزي في دورق نفايات فيروسية واترك الأنبوب يتصرف وهو مقلوب على سطح معقم.

لا تسمح للراسب بأن يجف تماماً. بعد ذلك، وبحذر، اجعل 1 mL من HPSS يتدفق فوق الراسب، ثم أمل أنبوب الطرد المركزي مرة أخرى لتصريف HPSS. بعد ذلك، اقلب الأنبوب رأساً على عقب مجدداً، مع الحرص على عدم جفاف الراسب.

قم الآن بإعادة تعليق الراسب 40 مرة في ملليلتر آخر من HBSS مع الحرص على تجنب تكون الفقاعات لأن ذلك قد يؤدي إلى تدمير الفيروس. ثم قم بالتجميد السريع لعينات من الفيروس في النيتروجين السائل. يُخزن الفيروس عند درجة حرارة 80- درجة مئوية حتى يتم التكميم والاستخدام اللاحق. بعد الحصول على الدم في أنابيب EDTA سعة 10 ملليلتر من متطوعين أصحاء، يتم تخفيف الدم باستخدام PBS في درجة حرارة الغرفة بمقدار يصل إلى ضعفين، وبحد أقصى 35 ملليلتر من الدم المخفف في أنبوب سعة 50 ملليلتر.

بعد ذلك، قم بتركيب إبرة قفل لور (lure lock) معقمة على حقنة معقمة سعة 50 milliliter، ثم اسحب وسط تدرج الكثافة إلى داخل الحقنة. ضع الإبرة في قاع أنبوب الدم المخفف، واسحب بعناية 15 milliliters من وسط تدرج الكثافة تحت الدم، مع الحفاظ على فاصل نظيف وواضح بين وسط تدرج الكثافة والدم. الآن، افصل الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 800 GS في درجة حرارة الغرفة وبأقصى تسارع مع تفعيل خاصية الكبح (break off). بعد عملية الفصل، توجد كريات الدم الحمراء في الراسب عند قاع الأنبوب، وتكون فوقها طبقة فضية من الخلايا المتعادلة.

تحتوي الطبقة الشفافة الموجودة فوق الراسب على وسط تدرج الكثافة، بينما تحتوي الطبقة الرقيقة الواقعة بين وسط تدرج الكثافة وطبقة بلازما الدم في الأعلى على pbmc. استخدم ماصة باستور لجمع pbmc بعناية، ثم انقل الخلايا إلى أنبوب جديد سعة 50 milliliter على الثلج. أضف PBS بارداً جداً حتى يصل الحجم إلى 50 milliliters، ثم قم بترسيب الخلايا عند اكتمال عملية الدوران.

اشفط السائل الطافي واغسل الراسب في 50 milliliters من PBS بارد جداً مرتين، وبعد الغسلة الثانية، أضف 1 milliliter من الوسط البارد جداً إلى الراسب، ثم قم بعدّ الخلايا وضبط تركيزها ليكون 5 × 10⁶ pbmc لكل milliliter. لتحفيز pbmc باستخدام RSV حي، أضف أولاً 100 µL من pbmc إلى كل بئر في طبق ذو قاع مستدير يحتوي على 96 بئراً. ثم أضف 50 µL من اثنين من المحفزات المخففة حديثاً إلى كل بئر.

يتم تحضين الطبق لمدة 24 ساعة عند 37 °C و 5%CO2، ثم يتم إجراء عملية الطرد المركزي للطبق، وجمع السائل الطافي لتحليله لاحقاً بواسطة تقنية Eliza. ويمكن تحليل خلايا pbmc المحفزة في الراسب عن طريق QPCR أو صبغها لقياس التدفق الخلوي. عند إجراء تجربة تحفيز A-P-B-M-C، يُقترح استخدام طريقة جزء المحفز مع هذا الإجراء.

تنقسم الظروف إلى ظروف محفزات قياسية مثل RPMI أو فيروس RSV البشري، وظروف أجزاء اختبارية مثل mial أو الببتيد الثنائي أو LPS. ومن المهم دائمًا تضمين ضابط سلبي مثل RPMI وحده وضابط إيجابي مثل LPS في كل تجربة؛ فبعد 24 ساعة من التحفيز بـ RSV، تظهر مجموعات مختلفة من PBMC معدل إصابة يعتمد على الجرعة واختلافًا في كفاءة الإصابة بـ RSV. وبعد 24 ساعة من التحفيز بالفيروس، يوضح تحليل qPCR لـ PBMCs عن تعبير TNF alpha أو interferon gamma أن RSV يحفز زيادة قوية في نسخ هذين السيتوكينين الالتهابيين. وعلى العكس من ذلك، يؤدي التحفيز بـ miam أو الببتيد الثنائي أو LPS إلى تعبير ضعيف فقط عن mRNA.

عند تحفيز خلايا p BMCs باستخدام كل من RSV والببتيد الثنائي MIAL معاً، يُلاحظ حدوث تنظيم تصاعدي تآزري قوي. كما تم تحليل خلايا pbmc المحفزة لتقدير إنتاجها من TNF Alpha أو Interferon gamma بواسطة تقنية Eliza. وبخلاف الملاحظات على المستوى النسخي، فإن RSV يعد محفزاً ضعيفاً لإفراز بروتينات TNF alpha و interferon gamma، كما أن تحفيز p BMCs بالببتيد الثنائي miam يؤدي إلى إنتاج كميات منخفضة من TNF alpha وعدم إنتاج interferon gamma.

على غرار التحليلات النسخية، أظهر كل من TNF alpha وإنترفيرون gamma زيادة تآزرية في التنظيم عند التحفيز المشترك بـ RSV وثنائي الببتيد MIAM كعنصر تحكم لمعرفة ما إذا كان تحفيز السيتوكينات يعتمد على تضاعف RSV. تم تحفيز خلايا BMC من الفئران بـ RSV حي أو RSV مثبط بـ beta propal, lactone، وكما هو موضح في الرسوم البيانية، أدى كل من RSV الحي والمثبط إلى إنتاج سيتوكينات محفزة للالتهاب. لا تنسَ أن التجارب التي تتضمن RSV يجب أن تُجرى داخل كابينة السلامة البيولوجية في مختبر من المستوى الثاني للسلامة البيولوجية.

علاوة على ذلك، أثناء محاولة تطبيق هذه الطريقة، من الضروري تذكر استخدام كواشف ومواد خالية من السموم الداخلية طوال الإجراء بأكمله. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحفيز خلايا pbmc البشرية بواسطة RSV والعديد من المقاييس التي يمكن استخدامها لتحليل الاستجابة المناعية.