المضادة للسرطان المعادن مجمعات: التجميعي والتقييم السمسة قبل الفحص الإنتقالي العسكري

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أدوية معدنية مضادة للسرطان وتقييم سميتها الخلوية عن طريق مقايسة MTT. يتم تحقيق ذلك عن طريق تصنيع المركبات المضادة للسرطان القائمة على المعادن أولا. الخطوة الثانية هي تحضير 96 لوحة بئر من الخلايا السرطانية.

بعد ذلك ، يتم إدخال المركبات المضادة للسرطان القائمة على المعدن في الخلايا السرطانية. تتمثل الخطوة الأخيرة في قياس صلاحية الخلية عن طريق مقايسة MTT ، حيث يتم قياس تقليل MTT بواسطة إنزيمات الميتوكوندريا والعزول الخلوي لتشكيل zen في النهاية النشاط المضاد للسرطان ونصف التركيز المثبط الأقصى. أو أرى 50 قيمة من المركبات محددة.

بشكل عام ، قد يعاني الأفراد الجدد على هذه الطريقة لأنها إجراء متعدد الخطوات يتطلب الاهتمام الكامل من عامل المختبر ويتم وضعه في جدول زمني صارم. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن تحضير صفيحة الخلية ليس سهلا لأن العمل مع الخلايا القابلة للحياة يتطلب اتباع إرشادات معينة. العمل في صندوق القفازات ، قم بإعداد مركب الفاناديوم الخمسة عن طريق إذابة 0.42 ملليمول من سلائف الترابط في THF الجاف.

ثم أضفه إلى محلول التحريك بكميات مكافئة من أكسيد الفاناديوم أو تريس isop في THF. قلب خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة قبل إزالة المواد المتطايرة تحت الفراغ. بعد ذلك ، أضف الهكسان البارد وقم بإزالته تحت الفراغ.

يجب الحصول على مسحوق أرجواني غامق بعائد كمي. تزن ثمانية ملليغرامات من المركب الذي تم الحصول عليه في قارورة epi orph. لتحضير مركب التيتانيوم الأربعة ، قم بإذابة 0.35 ملليمول من سلائف الترابط في THF الجاف ، وأضفه إلى محلول تحريك يعادل كميات أكسيد التيتانيوم tetra isop في THF.

قلب خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ثم قم بإزالة المواد المتطايرة تحت الفراغ لإعطاء منتج أصفر في عائد كمي. تزن ثمانية ملليغرامات من المركب الذي تم الحصول عليه في قارورة eph لتحضير خلايا HT 29 في 96 لوحة بئر مزرعة أولى.

الخلايا الموجودة في قارورة مساحتها 75 سم مربع كما هو موضح في بروتوكول النص بإزالة الوسيط عندما تصل خلايا HT 29 إلى أقصى طلاقة. بعد غسل الخلايا في مليلتر واحد من محلول التربسين EDTA ، أضف ملليلتر واحد من نفس المحلول واحتضنه لمدة خمس دقائق. افصل خلايا HT 29 عن القارورة وأضف 10 ملليلتر من الوسط لتعطيل نشاط التربسين.

انقل خمسة ملليلتر من خليط الخلية إلى أنبوب. استخدم ماصة لنقل بضع قطرات من خليط الخلية إلى حجرة مضادة. تشتمل غرفة العداد على جزأين من خمسة في خمسة مربعات.

عد الخلايا في خمسة مربعات تمثيلية لكل جزء باستخدام المجهر. أربعة مربعات في الزوايا ومربع واحد في المنتصف. احسب الكمية المقدرة للخلايا الموجودة.

اجمع الخلايا في المربعات الخمسة التمثيلية لكل جزء. احسب متوسط مجموع الجزأين واقسمها على 20. بعد ذلك ، اقسم 0.6 على حاصل القصیة.

الرقم المستلم هو كمية خليط الخلية المطلوبة لكل لوحة. يشير هذا الحساب إلى صفيحة تحتوي على 9000 خلية لكل بئر. باستخدام ماصة ، امزج كمية خليط الخلية المطلوبة لكل لوحة مع 13.2 مل من الوسط.

أضف الخليط إلى طبق 96 جيدا. استخدام ماصة 11 قناة عند 200 ميكرولتر لكل بئر على ستة خطوط تحتوي على 66 بئرا في المجموع. يجب أن يظل بئر واحد من كل سطر فارغا للتحكم الفارغ.

احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة للسماح للخلايا بالالتصاق باللوحة لإدخال المركبات أولا ، أضف 200 ميكرولتر من THF الجاف إلى ثمانية ملليغرامات من مركب الوزن. قم بتخفيف المحلول المركب بشكل أكبر عن طريق إضافة 60 ميكرولترا من THF أولا في تسعة ملفات مختلفة من einor. لكل محلول، استخدم ماصة لنقل 60 ميكرولترا من المحلول المركب إلى ملف einor الأول.

ثم قم بتعليق ونقل 60 ميكرولتر إلى القارورة التالية وهكذا حتى يتم الحصول على 10 تركيزات مختلفة. استمر في تخفيف 20 ميكرولترا من كل تركيز في THF مع 180 ميكرولتر من المتوسط. أيضا ، قم بإعداد محلول تحكم في المذيبات فقط عن طريق إضافة 20 ميكرولتر من THF إلى 180 ميكرولتر من المتوسط.

بعد ذلك ، أضف 10 ميكرولتر من كل محلول ناتج إلى كل بئر. يحتوي هذا بالفعل على 200 ميكرولتر من محلول الخلايا المذكور أعلاه في الوسط لإعطاء تركيزات نهائية للمركب تصل إلى 200 ملليغرام لكل لتر. يحتوي كل سطر على خلايا معالجة بالمركب في 10 تركيزات مختلفة.

واحد ، التحكم جيدا في الخلايا التي تحتوي على المذيبات فقط وواحد بدون خلايا للتحكم الفارغ ، قم بإعداد الخطوط لتكرار كل قياس للمركب ثلاث مرات. احتضان اللوحة المحملة لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية في جو ثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪. قم بإعداد محلول MTT كما هو موضح في بروتوكول النص باستخدام ماصة ذات 11 قناة.

أضف 20 ميكرولترا من محلول MTT إلى كل بئر باستثناء آبار التحكم الفارغة. احتضان اللوحة لمدة ثلاث ساعات إضافية بعد الحضانة. قم بإزالة المحلول المتوسط من كل بئر وأضف 200 ميكرولتر من الأيزوبروبانول إلى كل بئر.

لإذابة الفورمين ، حرك الطبق لمدة 30 دقيقة حتى يتجانس. قم بقياس الامتصاص عند 550 نانومتر لكل 200 ميكرولتر من المحلول المتجانس بواسطة قارئ صفيحة دقيقة ، ومقياس الطيف الضوئي يكرر كل قياس في ثلاثة أيام مختلفة. بعد ذلك ، احسب النسبة المئوية لصلاحية الخلية عن طريق خصم قيمة امتصاص التحكم الفارغة من القيمة المقاسة ، وقسمة النتيجة على امتصاص قيمة التحكم في مذيب THF وضربها في 100٪ احسب قيم التركيز المثبط نصف الحد الأقصى باستخدام برنامج الرسوم البيانية.

IC 50 المبلغ عنه هو متوسط جميع قيم IC 50 التي تم جمعها في ثلاثة أيام مختلفة على الأقل ، وقيمة الخطأ هي الانحراف المعياري. يتم تحليل البيانات الواردة من اختبار MTT لتقييم السمية الخلوية للمركب. يجب إجراء القياسات على مجموعة من التركيزات التي ستنتج رسما بيانيا يعرض توزيعا نقطيا متساويا على الأقل ثلاث نقاط على كل هضبة وثلاث نقاط لتحديد المنحدر.

ستؤدي القياسات غير الكافية بتركيزات عالية أو تركيزات منخفضة إلى إضعاف ملاءمة الانحدار غير الخطي للمنحنى المطلوبة لتحديد قيم IC 50 ، ونتيجة لذلك تقلل من دقتها. تتوافق قيم IC 50 النسبية كما تحددها ملاءمة الانحدار غير الخطي مع التركيزات التي تؤدي إلى 50٪ من تثبيط نمو الخلية الممكن بواسطة المركب الذي تم اختباره. يتم حساب هذا على أنه النقطة الوسطى بين الحد الأقصى والحد الأدنى من صلاحية الخلية المقاسة ، والتي ليست بالضرورة 100٪ و 0٪ على التوالي.

عند فحص نتائج التجارب الموضحة في البروتوكول. من الواضح أن السيسبلاتين وكذلك مجمعات التيتانيوم والفاناديوم نشطة للغاية. من الملاحظ أيضا أنه كلما اقتربت قيمة التثبيط القصوى لمركب معين من 100٪ ، كلما اقتربت قيمة IC 50 النسبية من القيمة المطلقة عند مقارنة قيم IC 50 بين المركبات المختلفة.

يحتوي مركب التيتانيوم الأربعة على أعلى سمية خلوية وقيم IC 50 أقل من تلك الموجودة في السيسبلاتين ومركب الفاناديوم الخمس. ومع ذلك ، فإن الترابط الحر يظهر نشاطا منخفضا بشكل ملحوظ منذ إضافة الترابط بتركيزات مختلفة. لا تنخفض صلاحية الخلية بشكل كبير كما تنخفض بالنسبة لمجمعاتها.

هذا يؤكد أن النشاط العالي المضاد للسرطان للمجمعات يعتمد على المراكز المعدنية أثناء محاولة هذا الإجراء. من المهم الحفاظ على ظروف معقمة في جميع الأوقات. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم السمية الخلوية للمركبات المضادة للسرطان بواسطة M-T-T-S-A.