طريقة كمية حساسة ومحددة لتحديد بروتين ربط الميوسين القلبي في المصل C عن طريق المقايسة المناعية الكهربائية الكيميائية

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد البروتين C المرتبط بالميوسين القلبي والتروبونين الأول في عينات المصل في وقت واحد. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء صفيحة 96 بئر أولا بجسم مضاد للبروتين C المرتبط بالميوسين القلبي لمقايسة plex ، أو باستخدام اختبار ثلاثي مشفر مسبقا. في الخطوة الثانية ، يتم تحضين الألواح المطلية بمعايرة وعينات مصل.

بعد ذلك ، تتم إضافة الأجسام المضادة للكشف المسمى في الخطوة الأخيرة ، ويتم إنتاج إشارة تلألؤ كيميائي يتم اكتشافها بواسطة قارئ اللوحة. في النهاية ، يمكن تحديد مستويات بروتينات القلب ذات الأهمية الموجودة في عينات المصل عن طريق المقايسات المناعية الفردية أو المتعددة. في اليوم السابق للتجربة ، وضعت ماصة 30 ميكرولترا من الجسم المضاد للبروتين C أحادي النسيلة المضاد للميوسين القلبي الخالي من الجيلاتين في الزاوية السفلية لكل بئر من لوحة قياسية عارية لاكتشاف مقياس ميسو 96 جيدا.

ثم اضغط على جوانب اللوحة لنشر محلول الجسم المضاد على قاع كل بئر. بعد الختم ، احتضن اللوحة طوال الليل عند أربع درجات مئوية دون اهتزاز. في صباح اليوم التالي ، اضغط على المحلول فوق الحوض ثم على كومة من المناشف الورقية.

ثم أضف 150 ميكرولترا من 1٪ مانع A في PBS إلى كل بئر لمنع الارتباط غير المحدد. احتضان اللوحة محكمة الغلق لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أثناء الاهتزاز عند 700 دورة في الدقيقة أثناء خطوة الحجب ، وقم بتخفيف جزء البروتين C المرتبط بالميوسين القلبي المؤتلف إلى تركيز يبدأ يبلغ 2000 نانوجرام لكل مليلتر في 1٪ مانع A في PBS. ثم قم بتخفيف هذا المحلول بشكل متسلسل بمعامل خمسة ليصبح المجموع سبعة معايير.

الآن قم بإزالة محلول الحظر كما هو موضح للتو ، ثم اغسل اللوحة ثلاث مرات باستخدام 150 ميكرولتر من 0.05٪ من 20 في PBS. بعد الغسيل الثالث ، قم بنفض الغبار بقوة على اللوحة فوق الحوض ثم ربتي بقوة على الطبق على طبقة من المناشف الورقية حتى يجف تماما. بعد ذلك ، قم بإدخال 25 ميكرولترا من كل معيار وعينة في الآبار المناسبة.

ثم أثناء احتضان اللوحة المختومة على شاكر لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتخفيف الجسم المضاد للكشف عن البروتين C المرتبط بالميوسين القلبي المصنوع حسب الطلب المسمى ب sul oag إلى ميكروغرام واحد لكل مليلتر في 1٪ مانع A في PBS. بعد غسل اللوحة بعناية كما هو موضح للتو ، أضف 25 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة للكشف إلى كل بئر ثم احتضان اللوحة المختومة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة أثناء الاهتزاز خلال فترة الحضانة ، وقم بتشغيل اللوحة التجريبية بمصابيح LED لضمان الوظيفة المناسبة لجهاز تصوير القطاع والبرنامج لتخفيف Reid Buffer في هذا الوقت أيضا. بعد غسل اللوحة بعناية كما هو موضح سابقا ، استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 150 ميكرولترا من Reid Buffer إلى كل بئر مع الحرص على تجنب فقاعات الهواء ، ثم امسح اللوحة على الفور في جهاز تصوير القطاع قبل البدء في الفحص ثلاثي التشكيل.

اسمح للوحة ثلاثية الطبقات 96 بئر والمحاليل المخففة بالتوازن مع درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 25 ميكرولترا من 1٪ مانع A في PBS إلى اللوحة ، مع التأكد من تغطية البئر بالكامل بالمحلول واحتضان اللوحة المختومة في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة أثناء الرج. في غضون ذلك ، قم بتخفيف البروتين المرتبط بالميوسين القلبي المؤتلف C-C-K-M-B والتروبونين القلبي I معا في 1٪ blocker A في PBS لإنشاء معيار يحتوي على 2000 نانوغرام لكل مليلتر من بروتين ربط الميوسين القلبي C و 100 نانوغرام لكل مليلتر من CKMB و 25 نانوغرام لكل مليلتر من التروبونين القلبي.

ثم أقوم بتخفيف هذا الخليط بشكل متسلسل بمعامل خمسة إلى حجم نهائي لا يقل عن 100 ميكرولتر لكل عينة مخففة قياسية مرتين باستخدام 1٪ مانع A في PBS. بعد ذلك ، أضف 2 25 ميكرولتر من التكرارات التقنية للمعايير بالإضافة إلى العينات إلى 25 ميكرولترا من المخزن المؤقت المانع الموجود بالفعل في آبار لوحة البليكس الثلاثة ، وقم بتضمين فراغ من المخفف فقط بعد احتضان اللوحة المختومة أثناء الاهتزاز ، وتخفيف الأجسام المضادة للكشف عن SUL OAG الثلاثة معا إلى تركيز نهائي قدره ميكروغرام واحد لكل مليلتر لكل منهما في 1٪ مانع محلول A و PBS بعد ساعتين. اغسل اللوحة كما هو موضح للتو، ثم استخدم ماصة متعددة القنوات لإضافة 25 ميكرولترا من محلول الأجسام المضادة للكشف إلى كل منها.

احتضان اللوحة المختومة جيدا لمدة ساعة واحدة أثناء الرج بسرعة 700 دورة في الدقيقة خلال فترة الحضانة. قم بتشغيل اللوحة التجريبية وقم بتخفيف المخزن المؤقت Reid كما هو موضح للتو. ثم بعد غسل اللوحة بنسبة 0.05٪ tween 20 في PBS ، استخدم الماصة متعددة القنوات لإضافة 150 ميكرولتر من Reid Buffer إلى كل بئر لتجنب فقاعات الهواء ومسح اللوحة على الفور في جهاز تصوير القطاع.

في هذا الشكل ، تتم مقارنة المنحنى القياسي لبروتين ربط الميوسين القلبي C في مقايسة plex ببروتين ربط الميوسين القلبي C في مقايسة plex الثلاثة. يظهر كلا المقياسين حساسية عالية جدا ونطاقا ديناميكيا عاليا. يتم عرض منطقة الكشف عن الفحص باللون الرمادي ، سواء plex أو ثلاثة plex.

تتشابه المنحنيات القياسية لبروتين ربط الميوسين القلبي C. الحد الأدنى للكشف والحد الأدنى للقياس الكمي والحد الأعلى لمستويات القياس الكمي قابلة للمقارنة في كل من فحوصات plex و threeplex. تظهر هذه الرسوم البيانية منحنيات التروبونين القلبي I و CKMB القياسية للوحة ثلاثية التشكيل.

أظهر كلا المعايرين حساسية عالية ونطاق ديناميكي كبير. يتم عرض منطقة الكشف عن الفحص باللون الرمادي. تمت دراسة التفاعل المتبادل للأجسام المضادة للكشف مع المعايرين الآخرين عن طريق احتضان المنحنيات القياسية الفردية لجميع أجهزة المعايرة الثلاثة مع الأجسام المضادة للكشف الفردي ، ولم يشاهد سوى قدر منخفض من التفاعل المتقاطع بين معاير CKMB وكل من التروبونين القلبي I والأجسام المضادة للكشف عن البروتين C المرتبط بالميوسين القلبي.

في حين لم يلاحظ أي تفاعل متقاطع بين أجهزة المعايرة الأخرى والأجسام المضادة للكشف كدليل على قابلية تطبيق الفحص للكشف عن إصابة القلب ، تمت مقارنة مستويات المصل ل 16 شخصا مصابا باحتشاء عضلة القلب مع مجموعة ضابطة باستخدام مستويات مصل لوحة plex الثلاثة من بروتين ربط الميوسين القلبي C-C-K-M-B والتروبونين القلبي. لقد قررت زيادة جميع المؤشرات الحيوية الثلاثة في المرضى الذين يعانون من احتشاء عضلة القلب مقارنة بالمجموعة الضابطة.