اختبار قابلية المضادات الحيوية الناجم عن الإجهاد على رقاقة

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد مدى حساسية البكتيريا للمضادات الحيوية ذات الأهمية بسرعة. يتم تحقيق ذلك عن طريق شل حركة بكتيريا طور السجل أولا إلى قاع قناة الموائع الدقيقة. في الخطوة الثانية ، يتم دفع الوسائط التي تحتوي على المضاد الحيوي وصبغة فلورية ميتة حية عبر القناة بمعدل تدفق مرتفع ، مما يؤدي إلى إجهاد البكتيريا وتنشيط مساراتها الكيميائية الحيوية المستهدفة بالمضادات الحيوية.

يتم جمع صور تباين المرحلة التالية وصور التألق تلقائيا كل دقيقتين لمدة ساعة واحدة لمراقبة صلاحية البكتيريا ، ويتم حساب نسب موت البكتيريا الطبيعية من الصور المكتسبة في كل نقطة زمنية من التجربة. في النهاية ، يتم تحديد النمط الظاهري لحساسية البكتيريا للمضادات الحيوية من زيادة نسبة موت الخلايا الطبيعية بمرور الوقت. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على طرق اختبار الحساسية المظهرية الحالية مثل المرق أو التخفيف أو الزراعة الدقيقة ، هي أن طريقتنا لا تتطلب مراقبة الانقسام البكتيري.

بدلا من ذلك ، يمكننا الوصول إلى ملف تعريف الحساسية الخاص بهم مباشرة من السكان الصغار الحاليين. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى تشخيص الالتهابات البكتيرية المقاومة لأن الطريقة سريعة ، ويمكن مضاعفة الإرسال بسهولة وأتمتتها لإنشاء طبقة PDMS ، ابدأ بتفريغ خليط لزج PDMS معد حديثا في غرفة مفرغة في درجة حرارة الغرفة بعد ساعة ، استخدم مقياسا لملء قالب الألومنيوم بكتلة محددة مسبقا من خليط DGAs PDMS. صب PDMS ببطء فوق مركز القالب ، مع الحرص على الحفاظ على القالب مستوي والمسامير مكشوفة.

عالج PDMS طوال الليل في فرن 37 درجة مئوية. في صباح اليوم التالي ، حرر لوحة القالب العلوية وقم بإزالة PDMS المعالجة بعناية من القالب لتجميع خلية التدفق. أولا ، ضع النافذة الزجاجية في جيب خلية التدفق.

ثم ضع شريحة زجاجية مطلية فوق النافذة الزجاجية داخل جيب خلية التدفق مع وضع الجانب النشط لأعلى. طبقة PDMS التي تم إنشاؤها حديثا مع توجيه القنوات لأسفل فوقها بحيث تتماشى مدخلات القناة مع الثقوب الموجودة في اللوحة المعدنية. ادفع الهواء برفق للخارج من بين الطبقات ثم اقلب مجموعة الشريحة الزجاجية PDMS بحيث يواجه نظام إدارة المفاتيح الزجاجية النافذة الزجاجية.

قم بتداخل مدخلات قناة PDMS مع الفتحات الموجودة في اللوحة المعدنية ، ثم ضع لوحة الضغط في الأعلى وشد البراغي. الآن ضع خلية التدفق المجمعة تحت المجهر ، واضبط تكبير المجهر على 60 × وقم بمحاذاة مواضع القناة مسبقا لإعداد بكتيريا طور السجل للتحميل في خلية التدفق المختلطة 50 ميكرولترا من المستعمرة البكتيرية المستزرعة بين عشية وضحاها ذات الأهمية في 50 مل من مرق MH الطازج. احتضان لمدة ثلاث ساعات مع الاهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بعد جهاز الطرد المركزي للزراعة الفرعية 10 مل من المزرعة لمدة دقيقتين عند 1,650 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة.

ثم قم بإزالة المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في ملليلتر واحد من وسائط MH الطازجة. بعد ذلك ، قم بتوصيل طول قصير من الأنبوب بحقنة سعة مليلتر واحد وقم بغسل الأنبوب بمليلتر واحد من الوسائط ، مع ترك كمية صغيرة من الوسائط في الأنبوب لتجنب فقاعات الهواء عند السحب في التعليق البكتيري. ثم قم بتحميل 0.7 مل من البكتيريا في المحقنة واملأ قناتين من خلية التدفق بثقافة الخلايا البكتيرية.

تتغير شفافية القناة عندما تمتلئ بالبكتيريا. ثم احتضان خلية التدفق لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية للسماح للبكتيريا بالالتصاق بسطح الشريحة. لإعداد الحلول للتجربة.

أولا ، املأ حقنتين سعة 60 مليلتر بمحلول تحكم معد حديثا وحقنتين سعة 60 مليلتر بمحلول مضاد حيوي طازج. قم بنفض الغبار عن المحاقن لإزالة أي فقاعات هواء ثم قم بإرفاق أنبوب الإدخال لدفع المحاليل المعنية عبر نهاية الأنبوب. احتفظ بالمحاليل ملفوفة بورق الألمنيوم لتجنب تدهور الكواشف الناجم عن الضوء.

الآن قم بتركيب المحاقن بمحلول تجريبي على المضخة ، واحدة تلو الأخرى. اضغط على الغطاسات حسب الضرورة لوضعها على المضخة. أغلق المحاقن في مكانها مع تثبيت العارضة بحقنة.

اضبط سرعة المضخة على مليلتر واحد في الدقيقة وحجم المضخة على 60 مليلتر وقم بغسل المضخة حتى يظهر تدفق سائل ثابت من جميع المحاقن. ابدأ الآن التجربة عن طريق إزالة خلية التدفق من الحاضنة وتركيبها على مرحلة المجهر قبل المحاذاة غير الضارة. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوب إدخال واحد قادم من حقنة وأنبوب إخراج واحد يذهب إلى زجاجة نفايات بكل قناة من قنوات خلية التدفق.

في هذه المرحلة ، يتم إعداد التجربة بالكامل وتكون جاهزة للبدء. اضبط وقت اكتساب تباين الطور على 10 مللي ثانية ووقت اكتساب التألق على 1600 مللي ثانية ، ثم احصل على تباين الطور وصور مضان لكل موضع قبل بدء التدفق. يرجى ملاحظة أنه قبل بدء صورة التدفق ، قد يكون التركيز على الجزء السفلي من القناة غير قابل للتحقيق بسبب الكثافة العالية للبكتيريا المحملة داخل القناة.

ابدأ الآن تدفق السائل. تحقق على الفور من تركيز المجهر على الجزء السفلي من القنوات. ثم التقط صورا لتباين الطور والفلورة للمناطق المستهدفة خلال الدقيقة الأولى من التدفق.

احصل على الصور كل دقيقتين بعد المجموعة الأولى من الصور حتى يحدث 60 دقيقة من التدفق. إعادة التركيز حسب الضرورة للتأكد من أن التجربة تسير بشكل صحيح ، يمكن للمرء فحص تباين الطور المكتسب وبيانات الفلورة. في عينة البيانات هذه ، تم تحميل سلالة حساسة في القناتين الأولى والثانية ، بينما كانت سلالة المقاومة في القناتين الثالثة والرابعة.

في نهاية التجربة ، قم بتشغيل دورة تنظيف مع تطبيق متسلسل للتبييض والماء. املأ أربع محاقن سعة 20 ملليلتر ب 10 ملليلتر من محلول التبييض بنسبة 10٪ وأربع محاقن سعة 60 مليلتر بالماء. بعد إزالة الفقاعات ، قم بتوصيل المحاقن المملوءة بالتبييض بخلية التدفق واضبط سرعة المضخة على مليلتر واحد في الدقيقة وحجم المضخة إلى ثلاثة ملليلتر.

قم بتشغيل المضخة لمدة ثلاث دقائق ، وراقب تنظيف القناة على الشاشة. بعد ثلاث دقائق ، استبدل محاقن التبييض بمحاقن الماء وقم بتشغيلها لمدة 30 دقيقة بمعدل واحد مليلتر في الدقيقة. أخيرا ، احسب عدد البكتيريا في كل صورة باستخدام برنامج معالجة الصور.

احسب نسبة موت الخلايا البكتيرية الطبيعية كدالة للوقت باستخدام هذه الصيغة حيث يساوي NF عدد البكتيريا الميتة كما هو محسوب. و NP يساوي العدد الإجمالي للبكتيريا كما هو محدد من صورة تباين الطور. توضح الصور المعروضة هنا الاستجابة المعتمدة على الوقت لسلالة المكورات العنقودية الحساسة للأوكساسيلين داخل خلية تدفق الموائع الدقيقة.

تظهر هذه الأرباع صور تباين الطور التي تم الحصول عليها بعد دقيقة واحدة من بدء التجربة وبعد ساعة واحدة مع صور التألق المقابلة الموضحة هنا. لوحظت زيادة كبيرة في عدد البكتيريا الفلورية بنهاية التجربة مما يشير إلى موت الخلايا داخل القناة وقابلية السلالة للمضاد الحيوي بسبب عدم التوحيد العشوائي للشرائح الفردية المطلية بالإيبوكسي. قد يكون هناك فقدان للخلايا البكتيرية طوال التجربة تحت ضغط مطلق مستمر لحساب هذا الاختلاف ، يتم تطبيع كل صورة مضان لمجموعة خلايا ميتة مع صورة تباين الطور المكتسب المشترك مما يعطي إجمالي عدد الخلايا في غضون ثانية واحدة من نفس النقطة الزمنية.

توضح هذه التكبيرات أن خوارزمية العد أكثر نجاحا في حساب البكتيريا الفردية بدقة في صور التألق مقارنة بصور تباين الطور المكتظة بالسكان. تعطي صبغة الخلايا الميتة تباينا عاليا في التألق للبكتيريا الميتة الفردية. نظرا لأن عدد البكتيريا الفلورية نادرا ما يتجاوز 5٪ من العدد الإجمالي ، فإن كل بكتيريا مشرقة جدا مقارنة بالخلفية.

لذلك ، يمكن حساب البكتيريا الفلورية بسهولة بدرجة عالية من الدقة. على سبيل المثال ، في هذه التجربة من إجمالي 5 ، تم اكتشاف 828 بكتيريا إجمالية ، تم تمييزها باللون الأحمر ، تم تحديد 174 ميتة هنا. يتم توضيح بيانات MSSA و Mr.RSA المطبعة لثلاث تجارب مختلفة كما هو متوقع للسلالات المقاومة ، وموت الخلايا الطبيعي منخفض الحجم أقل من 0.5٪ ولا يتغير على مدار التجربة.

ومع ذلك ، تظهر السلالات الحساسة زيادة مطردة في موت الخلايا وقيمة أعلى أكبر من 1٪ بنهاية التجربة. يختلف بدء موت الخلايا للسلالات الحساسة قليلا بين التجارب ، ولكنه يحدث عادة بين 10 و 30 دقيقة. لا تنس أن العمل مع مسببات الأمراض المقاومة للمضادات الحيوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل تقنية الصرف الصحي أثناء تنفيذ هذا الإجراء.

ستمهد هذه التقنية الطريق للباحثين لاستكشاف كيفية استجابة البكتيريا للإجهاد وستؤثر على تطوير تشخيص سريع جديد واكتشاف أدوية جديدة.