إثراء وتطهير الخلايا الجذعية الجنينية البشرية عن طريق الكشف عن مستضدات سطح الخلية باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة TG30 و GCTM-2

الهدف العام من هذا الإجراء هو فرز مجموعات فرعية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال ارتباط مستضد سطح الخلية بهما TG 30 و GC TM وهما جسمان مضادان وحيد النسيلة. يتم تحقيق ذلك عن طريق التفكك الأول للخلايا الجذعية الجنينية البشرية أو مزارع HESC في معلقات خلية واحدة. في الخطوة الثانية ، يتم تلطيخ HESC بالأجسام المضادة وحيدة النسيلة ، TG 30 و GCTM اثنين.

أخيرا ، يتم فصل الخلايا عن طريق فرز الخلايا المنشطة بالفلورة وإعادتها إلى الثقافة. في النهاية ، يمكن تقييم قدرة تكوين المستعمرة للخلايا المصنفة عن طريق قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري لتباين الطور. الصورة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل الملاحظة البصرية ، هي أنها توفر مقياسا موضوعيا لتعدد القدرات على أساس خلية تلو الأخرى لعدد كبير من الخلايا ، وهذا يسهل فصل الخلايا الجذعية الجنينية عن الخلايا المتمايزة.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال تعدد القدرات ، مثل كيفية تأثير التغييرات في ظروف الثقافة كميا على الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المختلفة وخطوط الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان. سيظهر الإجراء اليوم علماء أبحاث من مختبري ، جورج زوي هون تشي وباي وانغ ، لجعل تعليق خلية هيس أحادية الخلية يبدأ عن طريق شفط وسائط Hess Culture من قارورتين T 75 تحتوي على خط خلية هيس مزروع. اغسل كل قارورة ب 10 مل من DPBS ثم احتضن كل مزرعة بثلاثة ملليلتر من محلول التفكك المعبر عنه ثلاثي E عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد خمس دقائق ، ارتطم بجانب القارورة لإخراج الخلايا ثم تأكد من الانفصال تحت المجهر. بعد ذلك ، أضف 10 مل من وسائط الاستزراع البارد إلى كل قارورة باستخدام ماصة معقمة سعة 10 مل. قم بخزف الخلايا المنفصلة برفق عدة مرات على جدار القارورة لتحقيق تعليق خلية واحدة في الغالب.

الآن قم بتجميع معلقات الخلية المفردة من خلال مصفاة خلية 70 ميكرون في أنبوب بولي بروبيلين معقم سعة 50 مليلتر لتلطيخ مستضدات سطح خلية Hess. أولا ، Eloqua حوالي 100 ، 000 خلية في 150 ميكرولتر من الوسائط في كل من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الستة التي تتحكم فيها 1.5 ملليلتر. بعد ذلك ، قم باحتضان أنابيب التحكم وعينة الفرز المتبقية مع الأجسام المضادة الأولية ذات الأهمية في أحجام التفاعل النهائية البالغة 200 ميكرولتر وحوالي تسعة ملليلتر على التوالي في وسط الاستزراع بما في ذلك أدوات التحكم في النمط المتماثل.

ضع الأنابيب أفقيا على الثلج واخلطها برفق لمدة 30 دقيقة على منصة هزازة. بعد تدوير الخلايا ، تخلص من المادة الطافية ثم اغسل عينة الفرز في 20 مل من وسائط الثقافة الباردة وعينات التحكم في 200 ميكرولتر من نفس الشيء. الآن احتضان عينة الفرز في حجم نهائي 2.5 مل مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في وسائط الثقافة الباردة وعناصر التحكم في الحجم النهائي 200 ميكرولتر من نفس الشيء ، أضف الجسم المضاد PE المضاد للولايات المتحدة CD 90.2 المحضر حديثا إلى أنبوب التحكم المناسب في هذا الوقت أيضا.

مرة أخرى ، قم بخلط الأنابيب برفق أفقيا على الجليد لمدة 30 دقيقة على منصة هزازة. بعد تدوير الخلايا ، أعد تعليق عينة الفرز مرة أخرى في 20 مل من وسائط الثقافة الباردة وأدوات التحكم في 200 ميكرولتر وغسل الخلايا مرتين في الوسائط. أعد تعليق عينة الفرز في ملليلترين إلى ثلاثة ملليلتر من وسائط الاستزراع البارد المكملة بيوديد البروبيديوم وكل عنصر من الضوابط باستثناء الخلايا غير الملوثة في 300 ميكرولتر من نفس الشيء.

ثم قم بتصفية كل تعليق خلية فردية من خلال مصفاة خلية بغطاء 35 ميكرون مقترنة بخمسة مليلتر من البوليسترين وأنابيب اختبار القاع المستديرة وأجهزة الطرد المركزي للأنابيب لإجبار أي تعليق خلوي متبقي على أغطية المصفاة في الأنابيب. ثم اضغط على جوانب الأنابيب لإعادة تعليق كل معلق خلية واحدة ووضع الخلايا على الجليد. قم بإعداد مقياس التدفق الخلوي ل TG 30 GCTM فرز الخلايا المنشطة باللون الفلوري بحيث يتم بوابات معلقات خلايا Hess المنفصلة كخلايا مفردة للتخلص من الكتل والأزواج المحتملة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الحطام المحتمل باستخدام بوابات التشتت الأمامية والجانبية بحيث يتم فرز الخلايا السليمة فقط. ثم استبعد الخلايا غير القابلة للحياة بناء على تعبير يوديد البروبيديوم. قم بإخراج الخلايا الليفية الجنينية للفأر أو الخلايا المغذية للميثامفيتامين عن طريق الاختيار السلبي بناء على تعبيرها عن قرص الماوس CD 90.2 pe.

اضبط مشية TG 30 G CTM سالبة وفقا للتألق الذاتي في الخلفية للخلايا غير الملوثة وكذلك عناصر التحكم في النمط المتماثل. يمكن بعد ذلك أخيرا تقسيم جزء HESC المعزول القابل للحياة الخالي من مغذيات الميثامفيتامين إلى TG 30 سلبي GCT M اثنين من TG 30 منخفض GCT M اثنان من TG 30 منتصف GC TM اثنين متوسط و TG 30 مرتفع GCTM اثنين من مجموعات سكانية فرعية عالية. بعد إعداد مقياس التدفق الخلوي ، أضف ملليلترا واحدا من الوسائط المكيفة للميثامفيتامين إلى كل من أنبوبي اختبار من البوليسترين مستديرة القاع سعة خمسة ملليلتر وضعها على الجليد.

ثم استرجع 400 ، 000 خلية لكل منها من TG 30 سالب GC TM المتمايز واثنين من سالبين و TG 30 عالي GCTM متعدد القدرات ، وهما كسرتان فرعيتان للخلايا العالية. بعد تدوير أنابيب التجميع ، يقوم النسخ بتعليق كل حبيبات خلية في مليلتر واحد من الوسائط المكيفة MEF المتوازنة مسبقا. ثم تقوم بذرة واحدة متوازنة مسبقا ، وثلث قارورة MEF T 75 مع HESC من كل جزء في الوسائط المكيفة للميثامفيتامين تحتضن مزارع الخلايا عند 37 درجة مئوية عند 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 ، مما يؤدي إلى تحديث الوسائط يوميا لمدة أسبوعين تقريبا.

ثقافات TG 30 عالية GCTM متعددة القدرات مستعمرات شبيهة بالجذع البشري بعد أسبوع واحد وتصل إلى حوالي 80٪ من الطلاقة المشتركة في تسعة إلى 11 يوما. تنمو ثقافات TG 30 سلبية GC TM خليتان سالبتان في الغالب كعشب من الخلايا الليفية مثل الخلايا التي تصل إلى الطلاقة المشتركة في 11 إلى 13 يوما. يسمح الكشف المشترك عن مستضدات سطح الخلية TG 30 و GC TM two بتمييز عدد من المجموعات الفرعية للخلايا في المرحلة متعددة القدرات وفي مراحل مختلفة من تمايز HESC المبكر كما يتضح من تعبيرها عن علامات الخلايا الجذعية وعوامل النسخ الخاصة بالنسب بالاتفاق مع التقارير السابقة ، TG 30 GC TM اثنين من السلبيين المنخفضين ، يمكن التمييز بين الكسور الفرعية المتوسطة والعالية داخل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية للذكور في سطر واحد يستخدم في هذه الدراسة هنا ، يتم عرض النسب المئوية للمجموعات السكانية الفرعية ذات البوابات المختلفة النموذجية لتحليل قياس التدفق الخلوي TG 30 GCTM في التجربة الموضحة هنا.

زراعة عدد محدد من خليتين سالبتين TG 30 من GCT M على التوالي بعد الفرز لمدة أسبوعين تقريبا ، ثم لجأ إلى جمع TG 30 سالب GCT M فقط جزأين سالبين قبل إعادة الطلاء. في كل مقطع ، تشير النتائج إلى أن TG 30 سالب gct M اثنين من الأجزاء الفرعية السالبة يثري ل TG 30 GCT M سالب خليتين متمايزتين سالبتين بعد التعبئة المتتالية. تم اكتشاف مجموعة صغيرة من TG 30 عالية GCT M خليتين مرتفعتين في الممر الأولي ، ولكنها تختفي في النهاية مع مزيد من العبوات تاركة فقط عينات خالية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات.

هنا يتم عرض التشكل النموذجي للعشب المتمايز TG 30 سلبي GCT M خليتين سالبتين بعد 14 يوما. لاحظ أن مستعمرات HESC المتفرقة التي شوهدت بعد 14 يوما اختلطت مع TG 30 سلبي GC TM خليتان سالبتان على الأرجح تم إنشاؤهما بواسطة TG 30 عالية GCT M الملوثة خليتين مرتفعتين. لاحظ أن هذا نادرا ما يحدث فقط وفي المقطع الأولي بعد الحقائق بناء على الملاحظات السابقة باستخدام هذا الاختبار ، من المتوقع أن يتم إثراء جمع وثقافة TG 30 عالية GCTM خليتين عاليتين لتشكيل مستعمرة HSCs متعددة القدرات.

لذلك ، تم أيضا فحص التعبئة المتتالية ل TG 30 عالية GCTM عالية الخليتين بعد الفرز عن طريق قياس التدفق الخلوي في هذه الثقافات التمثيلية ، وتم فرز الخلايا بالفاكس باستخدام TG 30 و G CT M اثنين ، لتحل محل خليتين مرتفعتين فقط TG 30 عالية G CTM في كل ممر. وبهذه الطريقة ، لوحظ أن غالبية الخلايا كانت موجودة في الكسور الفرعية المرتبطة بتعدد القدرات مما يشير إلى مجموعة غنية من الخلايا متعددة القدرات التي تحافظ أيضا على القدرة على التفريق وتجديد نسبة صغيرة من خليتين سالبتين TG 30 سالب G CTM. علاوة على ذلك ، فإن الثقافات المتتالية ل TG 30 عالية G CTM تظهر خليتان عالية الفرز عددا كبيرا من مستعمرات HESC الشبيهة بعد المرور مما يشير أيضا إلى الحفاظ على حالة تعدد القدرات.

أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن تتذكر معايرة جهاز الفاكس قبل الاستخدام في كل مرة لضمان إمكانية تكرار النتائج باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل المصفوفات الدقيقة أو تسلسل الجينوم الكامل أو الأورام المسخية للإجابة على أسئلة مثل هل هذه الخلايا متعددة القدرات حقا بعد تطورها؟ مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لاستكشاف سلامة واستقرار هذه الخلايا مقارنة بالخلايا الجذعية الجنينية البشرية.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير وتلطيخ الثقافات المختلطة للخلايا الجذعية البشرية بعناية من أجل إثراء الخلايا الجذعية المحيطة. لا تنس أن العمل مع الخلايا البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ويجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات والعمل مع الفئة الثانية بواسطة خزانة الأمان أثناء تنفيذ هذا الإجراء.