باستخدام Coculture لكشف كيميائيا وساطة بين الأنواع التفاعلات

الهدف العام من التجربة التالية هو تحديد التفاعلات بين الميكروبات المختلفة التي تتوسط فيها المركبات المفرزة وتؤدي إلى تغييرات في التعبير الجيني البكتيري. يتم تحقيق ذلك من خلال زراعة السلالة البكتيرية التي تحتوي على مراسل نسخ فلوري مع ميكروبات بيئية كمستعمرات على ألواح أجار بتري. تمثل الدوائر البرتقالية مستعمرات الميكروبات البيئية.

في حين أن الدوائر الزرقاء هي مستعمرات للمراسل ، فإن النمو على الوسائط الصلبة يسمح للمستقلبات التي تنتجها هذه المستعمرات بالانتشار عبر الأجار وتنشيط التعبير الجيني في مستعمرات المراسلين القريبة. الضربات المحتملة المشار إليها هنا مع النجوم هي تلك المستعمرات التي قد تفرز مركبات تغير التعبير الجيني في المراسل. يتم عزل هذه الكائنات الحية عن لوحات شاشة الزراعة المشتركة.

يتم إعادة اختبار هذه المحفزات المحتملة في شاشة ثانوية للتأكد من أنها كانت الكائنات الحية التي تفرز الجزيئات التي تغير التعبير الجيني البكتيري في المراسل. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة على تفاعلات تكوين الأغشية الحيوية للعصيات الدقيقة مع كائنات التربة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على أنظمة أخرى مثل التفاعلات الميكروبية التي تؤثر على تعبير الفوعة في أنواع المكورات العنقودية أو الكاذبة. في الواقع ، يمكن تطبيقه نظريا لتحديد التفاعلات الميكروبية التي تغير التعبير الجيني لأي مراسل في أي ميكروب قابل للتتبع وراثيا بعد إنشاء تركيبات مراسل الفلورسنت للكائن الحي الذي تختاره ، وفقا لبروتوكول النص ، اجمع التربة عن طريق إزالة أعلى 0.5 سم من التربة السطحية المكشوفة قبل استخدام ملعقة لجمع التربة والأنابيب المخروطية ، أضف 0.85٪ محلول ملحي معقم بنسبة 10 مل لكل جرام واحد من التربة لعمل ملاط التربة ودوامته لمدة دقيقة واحدة لطرد البكتيريا من جزيئات التربة.

بعد ترك ملاط التربة يستقر لمدة دقيقة واحدة ، انقل الطبقة المائية العليا إلى أنبوب جديد ، وقم بتخفيف عينات المراسل والتربة وفقا لبروتوكول النص وحدد 50 ميكرولترا من كل منها في مركز ألواح شاشة الزراعة المشتركة في ظل ظروف لن تنشط بناء المراسل وحده. قم أيضا بوضع عينة من التربة بمفرده ومراسل بمفرده كضوابط. أضف حوالي 23 ملم من الخرز الزجاجي المعقم على كل طبق وانشر الخلايا عن طريق إبقاء الألواح على سطح المقعد ورجها ذهابا وإيابا.

أثناء الدوران حتى يتم امتصاص السائل ، اقلب الألواح وتخلص من الخرزات في دورق نفايات يحتوي على الإيثانول. بعد احتضان ألواح الزراعة المشتركة باستخدام التألق والبدء من أعلى اللوحة ، حرك اللوحة ببطء ذهابا وإيابا عبر مجال الرؤية إلى النقاط المضيئة. بعد مسح كامل ، اقلب اللوحة 90 درجة وكرر العملية.

عندما يتم اكتشاف بقعة فلورية ، قم بتشغيل إضاءة المجال الساطع ببطء وحدد ما إذا كان التألق مرتبطا بمستعمرة بكتيرية. لعزل الكائنات الحية المحفزة المفترضة ، والتي ستكون المستعمرات غير الفلورية القريبة من مستعمرات الفلورسنت. ضعها في وسط مجال الرؤية ويمكن الوصول إليها بيدك المهيمنة ، مع ترك مصباح الفلورسنت مضاء.

قم بتشغيل Brightfield ببطء لتحديد مستعمرة الفلورسنت والكائنات الحية المحفزة المحيطة بها حسب الشكل وتحديد موضعها باستخدام قضيب زجاجي ، التقط طرف تحميل هلام دائري معقم سعة 200 ميكرولتر وامسكه مثل قلم رصاص. ضع راحة يدك الخارجية على المسرح لتثبيتها على سطح العمل. ثم ضع يدك الأخرى على جانب الإبهام الداخلي من يدك لتثبيت أداة الانتقاء، مع إبقاء طرف الماصة فوق سطح اللوحة.

انقله إلى مجال الرؤية وقم بتوسيطه فوق المستعمرة التي ترغب في اختيارها. ستكون النصيحة خارج التركيز. باستخدام الحافة الخارجية ليدك ، قم بتدوير طرف الماصة ببطء لأسفل إلى المستعمرة المراد التقاطها.

المسها برفق شديد في محاولة لتقليل عدد المستعمرات الأخرى التي يلامس بها الطرف دون تدوير أداة الانتقاء. ضع الطرف على جزء من طبق جديد. بعد قطف المستعمرات ، احتضان الألواح وفقا لإرشادات الفحص.

عندما تكون المستعمرات مرئية ، استخدم مجسما لتحديد ما إذا كانت أنواعا فردية أو متعددة من الكائنات الحية تنمو على صفيحة إعادة الخط كل نوع مورفو على طبق جديد ويحتضن حتى ينمو. لاختبار ما إذا كانت المحفزات المفترضة هي محفزات حقيقية ، قم بإعداد مروج المراسل والسلالات الأبوية غير الفلورية. بعد أن تجف الألواح ، استخدم أعواد أسنان معقمة لالتقاط الخلايا من مستعمرات الاختبار.

رقعة على طبق فارغ ثم على لوحين من العشب. بدلا من ذلك ، قم بتعليق الكائنات الحية المحفزة المفترضة في مليلتر واحد من الوسط السائل في طبيب بيطري بلاستيكي معقم ، وقم بقياس OD 600 من المعلقات بعد تطبيع OD لكل تعليق للوصول إلى OD 600 من 0.5 بقعة ، ميكرولتر واحد من كل تعليق على كل من اللوحات الثلاثة. أخيرا ، بعد السماح للكائنات الحية بالنمو ، استخدم التألق تحت مجهر تشريح لتحديد الكائنات الحية المحفزة المفترضة التي تنشط سلالة مراسل الفلورسنت ، ولكن ليس سلالة الرقابة الأبوية.

تم استخدام الشاشة هنا لتحديد كائنات التربة التي تفرز المركبات التي تغير التعبير الجيني لمكون هيكلي لمصفوفة الأغشية الحيوية في ب خفية باستخدام مراسل نسخ الفلورسنت. من الناحية المثالية ، يجب أن تحتوي كل لوحة استزراع مشترك على نسبة واحد إلى واحد من المراسل إلى مستعمرات التربة التي تكون مستعمرات فردية متقاربة. نوضح هنا كيف أن وجود نسبة عالية من مستعمرات المراسلين المعروضة على شكل دوائر زرقاء بالنسبة لمستعمرات التربة الموضحة على شكل دوائر بنية يزيد من الثقة في تحديد الكائن الحي المحفز الفعلي من لوحات الزراعة المشتركة.

تفرز الكائنات الحية المحفزة للتربة مركبات تنشط المراسل. سيتم تحفيز مستعمرات مراسلين متعددة على اللوحة مع ارتفاع نسبة المراسل إلى التربة مما يسهل تحديد المحفزات الحقيقية الموضحة باللون الأحمر من المحفزات المفترضة الأخرى التي تشير إليها النجوم. يتحكم محتوى المغذيات في مدى تكوين مستعمرة النمو ، بينما يحدد تخفيف اللقاح ما إذا كانت المستعمرات الناتجة مشتتة بشكل مناسب.

كما هو موضح في هذه الثقافة المشتركة ، تنتج الصورة B الدقيقة مصفوفة غشاء حيوي فلورية استجابة للعديد من الميكروبات من التربة. بالنسبة للتربة التي فحصناها ، كان لدينا معدل إصابة مرتفع لمراسل مصفوفة Ptap A YFP. هذا على النقيض من نتائجنا غير المنشورة من الشاشات المماثلة.

باستخدام المراسلين المؤهلين والكفاءة ، تم تحديد عدد قليل من الضربات. وبالتالي ، فإن معدلات HI لأنواع الخلايا المختلفة متغيرة للغاية وقد يكون من الصعب التنبؤ بها مسبقا. يظهر هنا مثالان على لوحات شاشة الزراعة المشتركة قبل وبعد اختيار المستعمرات المحفزة المحتملة للعزل.

عرض النتائج السلبية والإيجابية من كل من طريقة التصحيح والبقعة هنا مع ما يقرب من 50٪ من المستعمرات التي تم فحصها في شاشتنا الثانوية هي إيجابيات حقيقية. باتباع هذا الإجراء ، يمكن تنفيذ طرق أخرى للإجابة على أسئلة إضافية ، على سبيل المثال تسلسل الحمض النووي SR 16 ثانية لتحديد الهوية التطورية للكائن الحي المحفز ، أو استخدام قياس الطيف الكتلي HPLC في الرنين المغناطيسي النووي لتحديد الهوية الكيميائية للمركب النشط.