خلية كاملة MALDI-TOF الطيف الكتلي هو الطريقة السريعة لدقة وتحليل أنماط مختلفة من تنشيط البلاعم

تستخدم هذه التجربة خلية كاملة متعددة إلى قياس الطيف الكتلي. لتحليل حالات التنشيط المتعددة للبلاعم بدقة ، اشتق البلاعم أولا من الخلايا الوحيدة الإيجابية CD 14 ثم تحفيز الخلايا بناهضات مثل السيتوكينات والبكتيريا. قم بتحليل العينات عن طريق المولي إلى هدف فولاذي ، وفصل البروتينات والحصول على طيف لكل عينة.

يمكن أن تميز نتائج بصمات الأصابع المحددة بين حالات التنشيط المختلفة لخلية حقيقية النواة واحدة ، وهي البلاعم بناء على تحليل المعلوماتية الحيوية للأطياف التي تم الحصول عليها بواسطة مطياف كتلة مالوف للخلية بأكملها. الميزة الرئيسية لهذه التقنية للطرق الحالية مثل التدفق هي أنها سريعة وسهلة وليست باهظة الثمن. في هذه التجربة ، أظهرنا أنه تم الحصول على أطياف قابلة للتكرار من البلاعم وأن حالات التنشيط المختلفة تم تمييزها بواسطة الخلية بأكملها.

نحصل أيضا على أطياف من BBMC ، والتي قد تكون مفيدة لتشخيص استجابة المضيف للعدوى. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لحالات تنشيط الخلايا المناعية. يمكن تطبيقه أيضا على أنظمة أخرى ، مثل التنميط المفاهيمي لاستبدال ، على سبيل المثال ، التحليل الإضافي أثناء الجراحة ، وعزل الخلايا من الأوفاكس في أنابيب 50 ملليلترا.

أضف 15 ملليلتر من المكالمة ، وقم بتخفيف الدم عشرة أضعاف في محلول ملحي. ثم افصل 30 مل من الدم المخفف على التدرج اللوني. بعد استعادة حلقة P BMCs ، احتفظ بالخلايا على الجليد.

قم بفصل P BMCs المحببة برفق إلى 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشغيل. أضف 20 ميكرولترا من الخرز المغناطيسي المطلي بالأجسام المضادة للقرص المضغوط 14. تخلط وتحتضن لمدة 15 دقيقة.

اغسل مرة واحدة بخمسة ملليلتر من عازلة التشغيل وجهاز الطرد المركزي عند 300 جي لمدة خمس دقائق. قم بفصل الخلايا المحببة برفق إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتشغيل. حدد العمود المناسب للفصل المغناطيسي.

اشطف البريكو والعمود باستخدام عازلة قيد التشغيل. ثم قم بتحميل pbmc على preco. ضع مجالا مغناطيسيا واشطفه ثلاث مرات باستخدام عازلة قيد التشغيل.

قم بإزالة ما قبل السعرات الحرارية وضع العمود على أنبوب سعة 15 مل. أضف المخزن المؤقت قيد التشغيل وقم بإزالة الخلايا الموجبة CD 14 عن طريق الضغط على العمود. بعد ذلك ، أجهزة الطرد المركزي.

ال ouit في 300 Gs لمدة خمس دقائق. تجاهل الاستلقاء. اغسل حبيبات الخلية الأحادية ب 10 ملليلتر من الثقافة.

متوسط حصار لتحديد نقاء تحضير الخلايا الوحيدة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام الأجسام المضادة المضادة CD 14. زرع الخلايا الوحيدة في ثلاثة ملليلتر من وسط الاستزراع الذي يحتوي على 10٪ مزرعة AB موجبة مصل بشري لمدة أربعة أيام. ثم استبدل الوسيط ب RPMI المكمل بنسبة 10٪ FBS ، وحدد مجموعة الخلايا التي تم الحصول عليها على أنها ضامة أحادية الخلية المشتقة من التدفق الخلوي.

تحفيز العينات حسب التصميم التجريبي. بعد غسل MDMs المحفزة باستخدام PBS ، اكشط الخلايا مع الشرطي المطاطي واجمع تعليق MDM. قم بتكسير الخلايا عن طريق الطرد المركزي ، ثم اغسلها مرة واحدة في PBS لإزالة آثار FBS.

بيليه M dms عن طريق الطرد المركزي وإعادة تعليق الكريات في 20 ميكرولتر من PBS. قم بتحليل الخلايا على الفور أو تخزينها في PBS عند 80 درجة مئوية تحت الصفر قبل التحليل. لتحضير مصفوفة CHCA ، أضف 500 ميكرولتر من نتريل الأسيتيل ، و 250 ميكرولتر من حمض الخليك ثلاثي الفلور بنسبة 10٪ ، و 250 ميكرولتر من الماء من درجة HPLC إلى قارورة.

ثم أضف 10 ميكرولترات من مزيج CHCA وصوتنة المصفوفة لمدة 20 دقيقة على الأقل. جهاز طرد مركزي عند 13 ، 000 Gs لمدة خمس دقائق ، احفظ المادة الطافية وتخلص من الحبيبات. بعد ذلك ، قم بترطيب الهدف الفولاذي البولندي بفرك ماء الصنبور الساخن بورق أبيض دقيق.

أضف 70٪ إيثانول وافرك RINs بالماء. ثم أضف 70٪ من الإيثانول وافرك بورق دقيق. اغمر الهدف في 70٪ للإيثانول والصوتنة لمدة 15 دقيقة على الأقل.

قم بتغطية الهدف ب 500 ميكرولتر إلى ملليلتر واحد من حمض الفلورو الحمضي الجاف بنسبة 80٪ ، وافركه وامسحه بورق دقيق. ثم اشطفها بماء HPLC دون فرك. جفف الهدف في درجة حرارة الغرفة.

الآن قم بإذابة عينات MDM برفق على الجليد. امزج معلق خلية MDM عن طريق سحب العينات وقم بإيداع ميكرولتر واحد على هدف MALDI. أضف ميكرولتر واحد من محلول مصفوفة MALDI على العينة.

للتكرارات التقنية. قم بإيداع 12 إلى 16 عينة لكل اختبار يتبخر تلقائيا في درجة حرارة الغرفة. الآن ، أدخل الهدف الفولاذي الذي يحتوي على عينات في مطياف الكتلة.

تكوين مطياف الكتلة وتشغيل الحصول على البيانات. يتكون كل طيف من قائمة من القمم مع الكتل والشدة ذات الصلة التي تشير إلى الوفرة النسبية. استخدم الجذر التربيعي للشدة لتحسين التصور الرسومي للأطياف.

ثم قم بتصحيح الخلفية باستخدام خوارزمية قص الذروة غير الخطية الحساسة للإحصاء. لتقدير خط الأساس، قم بتطبيق نسبة إشارة إلى ضوضاء قدرها ستة لاكتشاف القمم. ضع في اعتبارك أن القمم المكتشفة متشابهة عبر الأطياف عندما تكون قيم شحنة الكتلة ضمن نافذة 2000 PM.

في هذه التجربة ، تم تحضير البلاعم المحفزة من عينات الدم. الخلايا الوحيدة مسورة للتعبير عن CD 14 ، ولكن ليس CD 68. على العكس من ذلك ، تم تحديد البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة بواسطة CD 68 ، ولكن ليس تعبير CD 14.

توضح هذه البيانات دور مستحضرات العينات في تفسير نتائج مرض التصلب العصبي المتعدد في MALDI. عادة ما يحتوي الطيف عالي الجودة على ذروة رئيسية حوالي خمسة كيلو دالتون. مطلوب الحد الأدنى لتركيز الخلية للحصول على عينات جيدة كما يتضح من هذا الطيف ذي الجودة الرديئة الذي تم الحصول عليه بتركيز منخفض للخلية.

يتم الحصول على نتائج سيئة مماثلة عندما يتم خلط العينة مع المصفوفة قبل الترسيب على اللوحة المستهدفة. هنا ، يتم تمثيل الأطياف من عينات مختلفة كخريطة حرارية. يتم ترميز الوفرة النسبية بالألوان بكثافة اللون الأزرق.

تمثيل عرض الهلام الافتراضي هذا قابلية استنساخ العينات داخل كل فئة. يتم تلخيص التحليل غير الخاضع للإشراف عن طريق التجميع الهرمي على أنه agram. تجمعت جميع العينات ضمن ثلاث مجموعات مختلفة.

غير محفزة ، MDMs ، IFN Gamma محفزة ، أو IL أربعة MDMs محفزة. الأهم من ذلك ، يسمح تحليل MALDI TOF بتمييز البلاعم M1 من M اثنين من الضامة و MDMs غير المحفزة. يظهر تمثيل الذروة للطيف المرجعي ل IFN أو جاما IL أربعة أو MDMs غير المحفزة قمم محددة لكل فئة.

يمكن إحداث بصمات أصابع محددة بواسطة العديد من الناهضات لتوضيح دقة سوء الخلية بأكملها. تم فصل أطياف السيدة من جميع العينات المحفزة بوضوح عن تلك الموجودة في الضامة غير المحفزة. أظهرت MDMs أيضا بصمات أصابع محددة ناتجة عن البكتيريا المقتولة بالحرارة.

تدعم هذه النتائج الفرضية القائلة بأن MALDI إلى Ms.يمكن استخدامها لتحليل الخلايا المنتشرة لتقييم استجابة المضيف للعدوى أو الأمراض الالتهابية في البيئة السريرية عندما تكون العينة جاهزة. يمكن إكمال هذه التقنية في ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تقييم حالات تنشيط الخلايا الفوضوية عن طريق قياس الطيف الكتلي OV للخلية بأكملها.