تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

تهدف هذه العملية إلى إجراء محاكاة في المختبر للحاجز الدموي الدماغي من خلال الزراعة المشتركة للخلايا النجمية والخلايا البطانية على جانبين متقابلين من غشاء مسامي. أولاً، يتم طلاء السطح اللمعي للغشاء المسامي بمصفوفة خارج الخلية. وتناسب البروتينات مثل الكولاجين الغرسة المقلوبة مع أنبوب سيليكون خارجي وسدادة سيليكون داخلية لإنشاء بئر قابلة للإزالة فوق السطح غير اللمعي للغشاء.

الآن، قم باستزراع خلايا النجميات (astrocyte cells) على الغشاء المقلوب بحيث تلتصق بالسطح الخارجي (abluminal surface). ثم قم بإزالة الأنابيب ووضع الغشاء في اتجاهه الطبيعي داخل بئر مملوء بالوسط الغذائي. بعد ذلك، قم باستزراع الخلايا البطانية (endothelial cells) في الحجرة الداخلية (luminal compartment) للغشاء، واتركها في استزراع مشترك مع خلايا النجميات المقابلة.

في نهاية المطاف، يتم استخدام مرور المتتبعات الفلورية أو تسجيل المقاومة الكهربائية عبر البطانية الغشائية لقياس التغيرات في النفاذية في نموذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB) المختبري استجابةً لمواد محفزة مختلفة. وسيقوم السيد Barry Nigo، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري، بتوضيح هذا الإجراء، وهو الذي طور خلال دراسته للدكتوراه بروتوكول الاستزراع المعدل هذا الذي استخدمناه لمحاكاة الحاجز الدموي الدماغي. لقد تبلورت لدينا فكرة هذا الإجراء بعد اختبار طرق استزراع أكثر بدائية ومواجهة الكثير من الإحباط بسبب تسرب الوسط الغذائي عبر المسام، بالإضافة إلى صغر أحجام الوسط الغذائي.

أدى ذلك إلى فترات تثبيت قصيرة وغير كافية للخلايا النجمية، وهو ما نحاول معالجته في إجراءاتنا. ضع أدوات إدخال المزارع النسيجية في آبار صفيحة ذات 24 بئراً. ثم أضف 50 µL من كولاجين الجرذ بتركيز 132 µg/mL، النوع الأول، لتغطية السطح اللمعي لأدوات الإدخال، واحضنها طوال الليل في حضانة رطبة عند 37 °C للتخلص من أي حمض متبقٍ، ثم اغسل كلا الجانبين غير اللمعي واللمعي لأدوات الإدخال بالماء المقطر مرتين.

بعد ذلك، اقلب الأدراج وثبت بلطف قطعة قصيرة من أنبوب السيليكون المرن حول حافة الغشاء المسامي. مما يؤدي أساساً إلى إنشاء بئر جديدة فوق السطح الخارج لوعائي، وذلك لإحكام غلق الجانب السفلي.

قم بتجهيز سدادة مصنوعة من أنبوب سيليكون محكم الإغلاق من أحد طرفيه باستخدام الطرف المقطوع لأنبوب PCR سعة 0.2 ملليلتر. الآن، وباستخدام ملقط معقم، أدخل سدادة السيليكون في التجويف اللمعي وادفعها للأمام حتى تصل إلى مسافة تتراوح بين 1 إلى 2 ملم تقريباً من الغشاء. بعد ذلك، قم باستزراع 40,000 خلية نجمية في 200 ميكروليتر من وسط الصيانة الخاص بها مباشرة في بئر السيليكون فوق سطح الغشاء غير اللمعي.

لمراقبة حالة التزام الخلايا النجمية، استخدم طبقاً قياسياً بـ 96 بئراً، حيث إن له نفس مساحة سطح الغرسة ذات الـ 6.5 millimeter ويسمح بتصور أسهل للخلايا بواسطة مجهر تباين الأطوار؛ قم باستزراع حجم مماثل من معلق الخلايا النجمية في طبق الـ 96 بئراً. سيتم مراقبة ذلك بمرور الوقت لتحديد متى تلتصق الخلايا النجمية في البئر الـ 96، وبالتالي في غشاء الغرسة، بشكل كافٍ للحفاظ على التعقيم.

انقل الحشوات المجمعة بين لوحين من الأطباق ذات الستة آبار لتقليل التعرض للهواء غير المفلتر. ضع الخلايا في الحاضنة للسماح للخلايا النجمية بالالتصاق. كما يجب وضع لوح التحكم ذو الـ 96 بئر في الحاضنة في هذا الوقت.

بعد مرور حوالي أربع ساعات، افحص بئر التحكم المكون من 96 بئراً للتأكد من التصاق الخلايا النجمية. إذا حدث ذلك، فانقل مجموعة الإدراج مرة أخرى إلى غطاء زراعة الأنسجة. قم بإزالة أنابيب السيليكون الخارجية والسدادات برفق.

بعد ذلك، أعد الملحقات إلى الوضع العمودي الطبيعي داخل آبار تحتوي كل منها على 800 microliters من وسط صيانة الخلايا البطانية. قم بتوزيع 20,000 من الخلايا البطانية الدماغية في 200 microliters على السطح اللمعي المغطى بالكولاجين، ثم ازرعها بشكل مشترك لمدة ثلاثة أيام في وسط BEC دون إجراء أي تغيير للوسط قبل البدء في التجربة.

اغسل الأنابيب والسدادات المصنوعة من السيليكون في الإيثانول قبل تعقيمها بجهاز الموصدة (autoclaving) لاستخدامها لاحقاً. لتحفيز حاجز الدم الدماغي في المختبر (in vitro)، استبدل أولاً الأوساط في الجانبين الخارج عن اللمعة (abluminal) واللمعي (luminal) بـ 600 µL و 100 µL من وسط becs الخالي من المصل على التوالي. اسحب غسول الجانب اللمعي واستبدله بـ 100 µL من الوسط الخالي من المصل والمحتوي على عوامل تحفيزية.

في حال تحفيز الحاجز الدموي الدماغي (BBB) في المختبر من الحجرة النجمية، قم بشفط الوسط الأبلوميني (abluminal medium) واستبداله بـ 600 microliters من وسط خالٍ من المصل يحتوي على عوامل محفزة، ثم استكمل اختبارات النفاذية عبر الخلوية (transcellular) أو بين الخلوية (paracellular) القياسية للمقتفيات المحددة من أجل إنشاء نموذج بشري للحاجز الدموي الدماغي التلامسي. تُزرع الخلايا النجمية والخلايا البطانية الدماغية البشرية الخالدة على أغشية مسامية بحجم ثلاثة micron تسمح بمرور الزوائد النجمية للاتصال بالخلايا البطانية.

سمحت هذه الطريقة بفترة استزراع مثالية وغير منقطعة للخلايا النجمية وخلايا البطانة الدموية الدماغية، والتي ارتبطت بدورها بقوة بالسطح المسامي مع الحد الأدنى من فقدان الخلايا، ونمت حتى وصلت إلى مرحلة التلاقي الخلوي المشترك بحلول اليوم الثالث بعد الاستزراع. حافظ كلا النوعين من الخلايا على المؤشرات الخاصة بكل نوع منها على الأغشية المسامية، كما يتضح من أنماط تعبير البروتين الحمضي الليفي الدبقي GFAP في الخلايا الدبقية SVGs وعامل فون ويلبراند VWF في الخلايا البطانية NECs.

واتساقاً مع الميزة الأكثر جوهرية في نموذج حاجز دموي دماغي (BBB) التلامسي، يمكن لـ NFE النجمية المرور عبر المسام التي يبلغ قطرها ثلاثة ميكرون إلى الحيز اللمعي. وبناءً على ذلك، يمكن أن ينشأ تلامس محتمل بين SVGs و BES المستقرة على مسام بهذا البعد. علاوة على ذلك، تشير صور SEM إلى أن SVGs و BBCs كانت قادرة على النمو مباشرة فوق مسام الغشاء، وهي ظاهرة تساهم بشكل اصطناعي في وظيفة الحاجز الفيزيائي لنماذج تلامس BBB المخبرية (in vitro).

في هذه الدراسة، تم استخدام نموذج الحاجز الدموي الدماغي (BBB) بالتلامس البشري لاستكشاف تأثير العامل المذيب للفبرين TPAA على الحاجز الدموي الدماغي. وتؤكد هذه الدراسات المختبرية (in vitro) أن TPA قد زاد بالفعل من نفاذية الحاجز الدموي الدماغي السليم بطريقة تعتمد على التركيز والوقت، وكلاهما كان ضمن نطاق ذي صلة صيدلانية. وتظهر تغيرات مورفولوجية حادة في الخلايا النجمية SVG على الأغشية المسامية بعد التعرض لـ TPA، مما يشير إلى أن الاستجابة النجمية لـ TPA تكمن وراء فتح الحاجز الدموي الدماغي الناجم عن TPA.

لعبت هذه الطريقة دوراً رئيسياً في بحثنا، الذي كان يهدف إلى استقصاء كيفية استجابة الحاجز الدموي الدماغي لعقار TPAA المذيب للخثرات والمستخدم لمرضى السكتة الدماغية لإذابة الجلطات الدموية. ويعد هذا أول عرض لهذه الطريقة في الأدبيات العلمية، ونأمل أن يتبناها الباحثون الآخرون لأغراضهم الخاصة.