تحسين طريقة لإعداد القائم على الخليوي، الاتصال نموذج الإنسان من حاجز الدم في الدماغ

يهدف هذا الإجراء إلى محاكاة في المختبر للحاجز الدموي الدماغي عن طريق الزراعة المشتركة للخلايا النجمية والخلايا البطانية على جانبي الغشاء المسامي. قم أولا بتغطية السطح اللمعي للغشاء المسامي بمصفوفة خارج الخلية. يناسب البروتين مثل الكولاجين الملحق المقلوب بأنبوب سيليكون خارجي وسدادة سيليكون داخلية لإنشاء بئر قابل للإزالة فوق السطح العظمي للغشاء.

الآن زرع خلايا الخلايا النجمية على الملحق المقلوب بحيث تلتصق بالسطح العظمي. ثم قم بإزالة الأنبوب وضع الملحق في اتجاهه الطبيعي داخل بئر مملوء بوسط. بعد ذلك ، قم بزرع الخلايا البطانية في الحجرة اللمعوية للإدخال والزراعة المشتركة مع الخلايا النجمية المعارضة.

في النهاية ، يتم استخدام مرور متتبعات الفلورسنت أو تسجيل المقاومة الكهربائية البطانية العابرة لقياس تغيرات النفاذية في BBB في المختبر استجابة لعوامل التحفيز المختلفة. سيوضح هذا الإجراء السيد باري نيغو ، وهو باحث ما بعد الدكتوراه في مختبري ، والذي قام خلال فترة الدكتوراه بتطوير بروتوكول البذر المعدل الذي استخدمناه لمحاكاة الحاجز الدموي الدماغي. كانت لدينا فكرة عن هذا الإجراء لأول مرة بعد اختبار المزيد من طرق الجلوس الخام والشعور بالإحباط الشديد من تسرب الوسط خلال التوقف المؤقت ، بالإضافة إلى الأحجام المتوسطة الصغيرة.

هذا أملى فترات جلوس قصيرة وغير كافية للخلايا النجمية ، والتي نحاول معالجتها في إجراءاتنا. ضع إدخالات ثقافة الأنسجة في آبار لوحة 24 بئر. ثم أضف 50 ميكرولترا من 132 ميكروغرام لكل مليلتر من كولاجين الفئران ، واحد لتغطية السطح اللموعي للإدخالات ، واحتضانه طوال الليل في حاضنة رطبة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية من أجل إزالة أي حمض متبقي ، وغسل كل من الجانبين اللموعي واللميعي للإدخالات بالماء المقطر المزدوج.

ثم اقلب الإدخالات وقم بتركيب قطعة قصيرة من أنابيب السيليكون المرنة برفق حول حافة الغشاء المسامي. إنشاء بئر جديد فوق السطح العظمي. لإغلاق الجانب السفلي.

قم بإعداد قابس مصنوع من أنابيب سيليكون محكمة الغلق في أحد طرفيها بطرف مقطوع لأنبوب PCR سعة 0.2 مل. الآن باستخدام ملقط معقم ، أدخل سدادة السيليكون في التجويف اللمعي ودفعها حتى تصل إلى ما يقرب من ملليمتر إلى ملليمتر واحد إلى ملليمترين من الغشاء. البذرة التالية ، 40،000 خلية نجمية في 200 ميكرولتر من وسط صيانتها مباشرة في السيليكون فوق سطح الغشاء العظمي.

لمراقبة حالة التصاق الخلايا النجمية ، استخدم لوحة بئر 96 قياسية لأنها تحتوي على نفس مساحة سطح الإدخال 6.5 ملم وتسمح بها. تصور أسهل للخلايا عن طريق بذرة الفحص المجهري على النقيض من الطور ، وهو حجم متطابق من تعليق الخلية النجمية في لوحة 96 بئر ثمانية. ستتم مراقبة ذلك بمرور الوقت لتحديد متى تلتصقت الخلايا النجمية في البئر 96 وبالتالي في غشاء الإدخال بشكل كاف للحفاظ على العقم.

انقل الإدخالات المجمعة بين لوحين من ستة آبار لتقليل التعرض للهواء غير المصفى. ضع الخلايا في الحاضنة للسماح للخلايا النجمية بالالتصاق. ضع أيضا لوحة التحكم 96 Well في الحاضنة في هذا الوقت.

بعد حوالي أربع ساعات ، تحقق من عنصر التحكم 96 جيدا لمعرفة ما إذا كانت الخلايا النجمية قد التزمت. إذا كان الأمر كذلك ، فقم بنقل مجموعة الإدخال مرة أخرى إلى غطاء مزرعة الأنسجة. قم بإزالة أنابيب السيليكون الخارجية والمقابس برفق.

ثم أعد الإدخالات إلى الاتجاه المستقيم الطبيعي في الآبار التي تحتوي على 800 ميكرولتر لكل بئر من وسط صيانة الخلايا البطانية. شاهد 20،000 خلية بطانة دماغية في 200 ميكرولتر على الزراعة المشتركة للسطح اللمعي المطلي بالكولاجين لمدة ثلاثة أيام في وسط BEC دون أي تغيير في الوسائط. قبل التجريب.

اغسل أنابيب السيليكون والمقابس بالإيثانول قبل التعقيم لاستخدامها لاحقا. لتحفيز حاجز الدم الدماغي في المختبر ، أولا ، استبدل الوسائط اللمعة واللمعة ب 600 ميكرولتر و 100 ميكرولتر من وسط becs الخالي من المصل على التوالي. استنشق الغسيل اللمعي واستبدله ب 100 ميكرولتر من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على عوامل محفزة.

إذا كنت تحفز BBB في المختبر من الحجرة النجمية ، فقم بشفط الوسط الجلبي واستبدله ب 600 ميكرولتر من المصل الخالي. تستمر العوامل المحفزة التي تحتوي على الوسط في فحوصات النفاذية شبه الخلوية أو عبر الخلايا القياسية لمتتبعات الملصقات من أجل إنشاء نموذج حاجز دموي دماغي للاتصال البشري. تزرع الخلايا النجمية البشرية الخالدة والخلايا البطانية الدماغية على ثلاثة أغشية مسامية ميكرون تسمح بمرور الخلايا النجمية والقدمين للتلامس مع الخلايا البطانية.

سمحت الطريقة بفترة بذر مثالية دون انقطاع للخلايا النجمية و becs ، والتي بدورها ترتبط بقوة بالسطح المسامي مع الحد الأدنى من فقدان الخلايا وتنمو إلى الطلاقة المشتركة لمدة ثلاثة أيام. بعد البذر. يحافظ كلا النوعين من الخلايا على علاماتهما الخاصة بالخلية على الأغشية المسامية كما يتضح من أنماط التعبير عن البروتين الحمضي الليفي الدبقي GFAP في SVGs و von Vand عامل VWF NECs.

تمشيا مع الميزة الأساسية لنموذج BBB التلامس ، يمكن أن يمر NFE النجمي عبر المسام الثلاثة ميكرون إلى الحجرة اللمعة. وبالتالي ، يمكن أن يوجد اتصال بين SVGs و BES الجالسين على مسام هذا البعد. علاوة على ذلك ، يشير تصوير SEM إلى أن SVGs و BBCs كانت قادرة على النمو مباشرة فوق مسام الغشاء ، وهي ظاهرة تساهم بشكل مصطنع في وظيفة الحاجز المادي لنماذج تلامس BBB في المختبر.

في هذه الدراسة ، يتم استخدام نموذج BBB للاتصال البشري لاستكشاف تأثير عامل تحلل الفيبرين TPAA على BBB. تؤكد هذه الدراسات المختبرية أن TPA زادت بالفعل من نفاذية BBB السليمة بطريقة تعتمد على التركيز والوقت ، وكلاهما كان ضمن النطاق الدوائي ذي الصلة. تتجلى التغيرات المورفولوجية الدراماتيكية للخلايا النجمية SVG على الأغشية المسامية بعد التعرض ل TPA مما يشير إلى أن الاستجابة النجمية ل TPA تكمن وراء فتح BBB الناجم عن TPA.

لعبت هذه الطريقة دورا رئيسيا في بحثنا ، والذي كان يهدف إلى التحقيق في كيفية استجابة الحاجز الدموي الدماغي لعقار تحلل التخثر TPAA المستخدم في مرضى السكتة الدماغية لإذابة جلطات الدم. إنه أول عرض لهذه الطريقة في الأدبيات ، ونأمل أن يتمكن الباحثون الآخرون من تبنيها لأغراضهم الخاصة.