تشكيل الهياكل الجزيئية البيولوجية أمرت قبل التجميع الذاتي من الببتيدات قصير

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد تجميعات قائمة على الببتيد في شكل قلادات جزيئية حيوية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تحضير محاليل المخزون أولا عن طريق إذابة ثنائي فينيل ألانين ونظيره المحمي باخ بشكل منفصل بالكمية المناسبة من HFP إلى تركيز نهائي قدره 100 ملليغرام لكل ملليلتر. تتمثل الخطوة الثانية في مزج محاليل مخزون الببتيد بنسبة خمسة إلى ثلاثة عن طريق خلط 10 ميكرولترات من محلول ببتيد ثنائي فينيل ألانين مع ستة ميكرولترات من محلول ببتيد ثنائي فينيل ألانين المحمي من باخ.

بعد ذلك ، يضاف محلول مخزون الببتيد المخلوط إلى 50٪ من الإيثانول المحضر حديثا لإعطاء تركيز نهائي قدره خمسة ملليغرام لكل مليلتر من ثنائي الفينيل ألانين وثلاثة ملليغرامات لكل مليلتر لديفينيل ألانين محمي باخ على التوالي. يتم استخدام المجهر الإلكتروني المسح بشكل فعال في نهاية المطاف لإظهار القلائد الجزيئية الحيوية التي تم تجميعها بواسطة الببتيدات. الميزة الرئيسية لاستخدام عمليات التجميع الذاتي مثل تلك الموضحة هنا ، هي أنه من خلال التقدم التلقائي ، من الممكن إنشاء بنية معقدة.

في المختبر هنا تمثل التجميع الذاتي للببتيد, على وجه التحديد التجميع المشترك لثنائي الببتيد الذي يدل على هذا الإجراء سيكون نوران, مختبر سابق لطالب الدراسات العليا. لبدء إجراء التجميع الذاتي لثنائي فينيل ألانين في هياكل أنبوبية ، قم بإعداد 100 ملليغرام لكل مليلتر محلول مخزون الببتيد عن طريق إذابة ببتيد ثنائي فينيل ألانين في HFP. لضمان تجانس المحلول ، اخلطه بخلاط دوامة لبضع ثوان وضعه جانبا على المقعد لبضع دقائق حتى يذوب الببتيد تماما ويصبح المحلول صافيا.

قم بتخفيف محلول مخزون الببتيد إلى تركيز نهائي قدره ملليغرام لكل ملليلتر في الماء المقطر الثلاثي. احتفظ بالمحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 24 ساعة. بالنسبة لإجراء التجميع المشترك ، تم إذابة ملليغرامين من ببتيد ثنائي الفينيل ألانين ومليغرام واحد من ببتيد ثنائي فينيل ألانين محمي باخ بشكل منفصل في HFP بتركيز 100 ملليغرام لكل مليلتر.

ثم اخلطي المحاليل بخلاط دوامة لبضع ثوان وضعيها جانبا على المقعد لبضع دقائق حتى تذوب الببتيدات تماما وتصبح المحاليل صافية. امزج محاليل مخزون الببتيد بنسبة خمسة إلى ثلاثة عن طريق خلط 10 ميكرولترات من محلول ببتيد ثنائي فينيل ألانين مع ستة ميكرولترات من محلول ببتيد ثنائي الفينيل ألانين المحمي من باخ. ثم امزج المحلول باستخدام خلاط دوامة.

بعد ذلك ، أضف ثمانية ميكرولترات من محلول مخزون الببتيد المخلوط إلى 92 ميكرولتر من الإيثانول المحضر حديثا بنسبة 50٪ لإعطاء تركيز نهائي قدره خمسة ملليغرام لكل مليلتر لثنائي فينيل ألانين ، وثلاثة ملليغرام لكل مليلتر. لباخ محمية ثنائي فينيل ألانين. استخدم ماصة لخلط المحلول برفق.

بعد 24 ساعة من الحضانة في درجة حرارة الغرفة ، ضع قطرة 10 ميكرولتر من محلول الببتيد على زلة غطاء زجاجي واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة. قم بتغطية العينة على زلة الغطاء الزجاجي بطبقة رقيقة من الذهب باستخدام كوتر الرش لمدة 90 ثانية. عند الانتهاء ، قم بتصوير التجميعات باستخدام SEM التي تعمل من 10 إلى 20 كيلو فولت.

لتحليل TEM ، ضع قطرة 10 ميكرولتر من محلول الببتيد على شبكة نحاسية 200 شبكة مغطاة بالكربون ومثبتة بواسطة دعامة فيلم بوليمر. بعد دقيقة واحدة ، قم بإزالة السوائل الزائدة باستخدام ورق الترشيح. بعد ذلك ، انقل محلول أسيتات المبولة بنسبة 2٪ إلى حقنة وقم بتصفيتها باستخدام وحدة تصفية 22 ميكرومتر من نقطة الصفر.

للبقاء في العينة ، ضع قطرة 10 ميكرولتر من محلول أسيتات المبولة على الشبكة. بعد 30 ثانية ، قم بإزالة السوائل الزائدة باستخدام صورة ورق الترشيح للعينة على الشبكة بواسطة TEM التي تعمل عند 120 كيلو فولت. لتحليل FTIR ، ضع قطرة 30 ميكرولتر من محلول الببتيد على نافذة فلوريد الكالسيوم.

اترك المحلول يجف في درجة حرارة الغرفة من أجل قمع إشارة الماء في طيف FTIR. ضع قطرة من أكسيد الديوتيريوم على عينة الببتيد الجافة. بعد تجفيف العينة في مادة مجففة تحت الفراغ ، كرر الخطوات السابقة مرتين لضمان أقصى تبادل للهيدروجين إلى الديوتيريوم.

أخيرا ، سجل أطياف FTIR باستخدام كاشف كبريتات الدهون الثلاثية المنزوع. حدد القيم الدنيا للنفاذية باستخدام البرنامج المرفق مع الأداة لإثبات تكوين الهياكل المرتبة عن طريق التجميع الذاتي للببتيدات. تم تحضير التجميع المشترك لاثنين من الببتيدات العطرية البسيطة وتمييزها باستخدام تحليل SEM و TEM.

شكلت الببتيدات المخلوطة بنية من التجمعات الكروية بقطر عدة ميكرونات متصلة بهياكل ممدودة يبلغ قطرها بضع مئات من النانومترات بسبب التشابه الكبير في علم التشكل للتغلب على أوتارها. تسمى هذه الهياكل بالقلائد الجزيئية. يوضح تحليل FM لهذه الهياكل بوضوح ترتيبها ثلاثي الأبعاد.

بالإضافة إلى ذلك ، يشير تحليل SEM لمناطق مختلفة من العينات المختلفة إلى أن هذه العملية حدثت بإنتاجية عالية. يوفر تحليل FTIR معلومات عن التركيب الثانوي لتجميعات الببتيدات. الطيف الماص للأميد.

أظهر شريط واحد من التجميعات الكروية التي شكلتها ببتيد ثنائي فينيل ألانين المحمي من باخ في الإيثانول ذروة أميد واحدة عند 1،657 سنتيمترا متبادلة مما يشير إلى تأكيد حلزون ألفا. أظهرت الهياكل الأنبوبية التي شكلها ببتيد ثنائي الفينيل ألانين في الإيثانول قمتين مميزتين عند 1 ، 613 سنتيمترا متبادلة و 1 ، 682 سنتيمترا متبادلة ، والتي ترتبط ببنية ثانوية لصفائح بيتا. تم تأجيل طيف FTIR للقلادات الجزيئية الحيوية التي شكلتها التجميع المشترك للببتيدين من مهمة الذروة لكل ببتيد فردي.

تتوافق الذروة الأولى عند 1،653 سنتيمترا مقلوبة مع بنية حلزونية ألفا والذروة الثانية عند 1،684 سنتيمترا متبادلة تتعلق بتأكيد دوران بيتا. يشير الاختلاف بين الأطياف المختلفة إلى بنية فريدة من نوعها للقلادات الجزيئية الحيوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء التجميع القائم على الببتيد بواسطة صبغة الببتيد.

يمكن تطبيق هذه الطريقة على الجزيئات الحيوية الأخرى بسهولة من أجل تكوين بنية معقدة. لا تنس أن المشي بالمذيبات العضوية يمكن أن يكون خطيرا للغاية. القفازات. يجب دائما ارتداء معطف المختبر ونظارات السلامة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.