ثقافة الأنسجة نموذج ثلاثي الأبعاد لدراسة الابتدائية نخاع العظم الإنسان والأورام الخبيثة في

الهدف العام من هذا الإجراء هو إنشاء نظام استزراع يلخص عن كثب البيئة الدقيقة الخلوية وداخل الخلايا لنخاع العظام البشري. أولا ، سطح بئر زراعة الأنسجة مغطى بالمصفوفة الصناعية. ثم يتم خلط الخلايا أحادية النواة في نخاع العظم أو الخلايا الأخرى ذات الأهمية مع مصفوفة نخاع العظام.

في وقت لاحق ، تتم إزالة المصفوفة الصناعية ويضاف خليط مصفوفة الخلية إلى البئر. بمجرد أن تتأرجح المصفوفة ، يتم تغطيتها بوسط النمو. في النهاية ، يمكن تصور الخلايا مباشرة في المصفوفة أو يمكن عزلها لتحليلات المصب مقارنة بالطرق الحالية لزراعة الخلايا.

على سبيل المثال ، طرق زراعة الأنسجة القياسية أو نماذج الزراعة المشتركة التي تزرع فيها الخلايا على البلاستيك. تتمثل الفائدة الرئيسية لاستخدام طريقة الثقافة ثلاثية الأبعاد في أن الخلايا تنمو داخل البيئة الفسيولوجية الدقيقة ، وبالتالي فهي تسمح لك بدراسة الخلايا ضمن الظروف الأصلية للأنسجة. قم بإعداد صفيحة 48 بئر يتم فيها طلاء الخلايا.

عن طريق إضافة 65 ميكرولترا من محلول الطلاء الصناعي أولا إلى كل منها ، قم بتوزيع المحلول جيدا بالتساوي لتغطية سطح البئر بالكامل. هذه الطريقة قابلة للتطوير على الأسطح الأخرى أيضا. اترك الأطباق تحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة على الأقل.

في غضون ذلك ، قم بإعداد تعليق الخلية المكون من 50،000 خلية لكل ميكرولتر من PBS. قم بإعداد ما يكفي لإضافة 10 ميكرولتر إلى كل بئر ثم في أنبوب einor ، امزج تعليق الخلية مع 100 ميكرولتر من مصفوفة العظام المعاد بناؤها لكل من. اخلطي جيدا بلطف وتجنب إدخال الفقاعات.

احتفظ بالخليط على الثلج حتى لا تتحول المصفوفة إلى الهلام عند انتهاء اللوحة. احتضان وإزالة كل محلول الطلاء السائل والنقطي عن طريق الشفط. ثم أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية المختلطة جيدا مع مصفوفة لكل منها.

حسنا ، قم بإمالة اللوحة بسرعة باستخدام ماصة لتغطية سطح البئر بالكامل بالتساوي. استمر في خلط المعلق بين حشوات الآبار حيث ستتكتل الخلايا بمجرد تحميلها بالكامل. احتضان اللوحة لمدة 30 إلى 60 دقيقة دون تحريض حتى تصلب المصفوفة.

بعد ذلك ، قم بتسخين وسط نمو نخاع العظم مسبقا في حمام مائي مضبوطة على 37 درجة مئوية. بعد 30 دقيقة من الحضانة ، تحقق لمعرفة أن المصفوفة قد تم ضبطها بشكل صحيح. تشكل المصفوفة الجيدة طبقة ناعمة تشبه الهلام لا تتحرك عند إمالة اللوحة.

عندما تكون المصفوفة جاهزة ، قم بتراكبها برفق بمليلتر من المتوسط بالتنقيط باستخدام ماصة مصلية. ثم أعد ثقافة مصفوفة العظام المعاد بناؤها المجمعة إلى الحاضنة لمدة تصل إلى 30 يوما دون أي تغييرات متوسطة. إذا كان هناك حاجة إلى تغيير متوسط ، فقم بتغيير نصف الوسيط مرة واحدة فقط.

قم بإزالة الوسط برفق دون إزعاج طبقة المصفوفة. اقلب الطبق وصفي الوسط برفق باستخدام ماصة. لا تشنشق الوسائط فوق المصفوفة لاحقا.

عند تلطيخ الخلايا. استخدم هذه التقنية لتغيير المحلول. لإزالة الوسائط من آبار ثقافة ثلاثية الأبعاد ، من الأهمية بمكان إزالتها من جانب البئر.

خلاف ذلك ، سيتم إزعاج المصفوفة وقد تفقد الخلايا التمسك بنفس التقنية. اغسل الخلايا مرتين بمعقم XPBS. ثم أضف نصف مل من محلول استعادة الخلايا الباردة المثلجة لكل منها.

حسنا ، قم بإزالة طبقة المصفوفة بأكملها مع الخلايا عن طريق سحب العينات بقوة لأعلى ولأسفل. لكل منها ، قم بنقل المجموعة جيدا إلى أنبوب طرد مركزي صغير وضعه على الجليد. ثم أضف نصف مليلتر إضافي من محلول الاسترداد إلى نفس البئر واجمع كل المواد المتبقية.

دوامة جميع المجموعات ، واحتضانها لمدة ساعة على الجليد. خلال الساعة ، قم بتدوير الأنابيب كل 15 دقيقة لتسهيل إطلاق الخلية من المصفوفة. بعد ساعة ، افحص الخليط بحثا عن كتل مصفوفة مرئية.

لا ينبغي أن يكون أي منها موجودا ، ولكن إذا كان هناك ، انقل الخليط إلى أنبوب أكبر وأضف ملليلترين إلى خمسة ملليلترات إضافية من محلول استعادة الخلايا. ثم احتضان الخلايا لمدة 30 إلى 60 دقيقة أخرى. الدوامة بشكل دوري ، وتحقق مرة أخرى من عدم وجود كتل مصفوفة.

عندما لا تكون المصفوفة متكتلة. الطرد المركزي المزيج عند 1000 دورة في الدقيقة لمدة خمس إلى 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم إزالة المادة طافية وإعادة تعليق الخلية بيليه في مليلتر من بارد واحد XPBS.

كرر الطرد المركزي. استبدل المادة الطافية ب PBS الطازجة وكرر الغسيل. مرة ثالثة.

بعد غسل PBS الثالث ، استرجع الخلايا في الحل المناسب للإجراء التالي. نمت خلايا نخاع العظم في مصفوفة عظمية معاد بناؤها لمدة 30 يوما وتم تصويرها بشكل دوري بواسطة الفحص المجهري الضوئي بتكبير 200 مرة. تم اكتشاف العناصر اللحمية لأول مرة في اليوم الخامس ، لكنها كانت واضحة بوضوح بحلول اليوم الرابع عشر.

على مدار فترة الاستزراع ، هاجرت الخلايا عبر المصفوفة وتجمعت في مجموعات متميزة. توسعت كتل الخلايا الخبيثة بمرور الوقت لتقييم تكوين المكونات اللحمية التي تتفوق في RBM. تم تقييم مورفولوجيا الخلايا عند الانتقال بين RBM والطلاء الصناعي.

تم تلطيخ الخلايا من أجل الفيبرونكتين والأكتين والنوى. تبين أن خلايا التصور ذات التشكل اللحمي هي بانيات عظم مع مستويات عالية من نشاط الفوسفاتيز القلوي. كانوا قادرين على تمعدن الكالسيوم على النحو الذي حددته الزارين الأحمر ، تم تحديد الخلايا ذات الوجود المرئي لقطرات الدهون على أنها خلايا شحمية بناء على تلطيخ إيجابي بالزيت.

تم التعرف على الخلايا الحمراء ذات النوى المتعددة العرضية على أنها ناقضات عظمية سابقة وكانت إيجابية لفوسفاتيز حمض الطرطرات. بعد عزل الخلايا من ثقافة ثلاثية الأبعاد ، يمكنك القيام بمجموعة متنوعة من الأشياء. على سبيل المثال ، يمكنك دراسة الأنماط الظاهرية الخلوية للخلايا المختلفة المزروعة في البيئة المكروية.

يمكنك دراسة التعبير الجيني والبروتيني ويمكنك حتى تحديد نوع الجزيئات التي تفرزها هذه الخلايا في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد.