نخاع العظام المستمدة من بلعم الإنتاج

الهدف العام من هذا الإجراء هو توليد البلاعم من البول ومزارع الخلايا المشتقة من نخاع العظام. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق استخراج نخاع العظم من الساقين الخلفية للفأر. في الخطوة الثانية ، تتم إزالة الضامة الموجودة في نخاع العظم ، ثم يتم زراعة خلايا نخاع العظم في ظل ظروف تمايز البلاعم.

ثم عندما تتمايز خلايا نخاع العظم إلى ضامة ، يمكن جمعها للتحليل التجريبي. في النهاية ، يمكن استخدام الفحص المجهري متحد البؤر لإثبات توطين LPS البكتيري داخل البلاعم المشتق من نخاع العظام ، والمقصورات الحمضية النهائية. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل زراعة البلاعم وخطوط الخلايا هي العدد الكبير ، لذلك يمكن الحصول على البلاعم الأولية.

العرض المرئي للطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات الإنتاج الذاتي وتتطلب ممارسة ، ولتحقيق النجاح ، قم بتطهير جلد الفأر القتل الرحيم بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق في الجزء العلوي من كل ساق خلفية واسحب الجلد لأسفل باتجاه القدم لفضح العضلات. بعد ذلك ، قم بقطع الأرجل الخلفية واستخدم مقصا معقما وملقطا.

لإزالة الجلد ، ضع الساقين في طبق بتري معقم مقاس 35 ملم يحتوي على خمسة ملليلتر من الثلج المعقم. برنامج تلفزيوني بارد. قم بإزالة أي جلد وعضلات متصلة بالعظام ، ثم انقل العظام إلى طبق بتري معقم جديد يحتوي على خمسة ملليلتر من الثلج.

بارد ، معقم PBS. اغسل العظام مرتين بخمسة ملليلتر أخرى من PBS ثم انقلها إلى ملاط معقم يحتوي على خمسة ملليلتر من الثلج. بارد ، معقم PBS.

الآن قم بقص الساق من عظم الفخذ عند المفصل واستخدم مدقة لتحطيم العظام برفق. اجمع المادة الطافية في أنابيب مثلجة باردة سعة 15 ملليلتر ثلاث مرات. ثم قم بتصفية تعليق الأنسجة من خلال مصفاة خلايا نايلون 70 ميكرون.

لإزالة الشظايا الصلبة ، قم بتدوير المرشح وتخلص برفق من المادة الطافية. فصل الحبيبات مع المخزن المؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء, إضافة 20 مل من الجليد الباردة كاملة DMEM بعد 30 ثانية لوقف التفاعل بعد الطرد المركزي للخلايا, نقوم بتعليق الحبيبات في 20 مل من 37 درجة مئوية, كاملة DMEM, ثم تقسيم تعليق الخلية بين اثنين 100 ملليمتر بتري صحين. احتضان الأطباق لمدة أربع ساعات عند 37 درجة مئوية ، ثم اجمع المواد الطافية في أنابيب سعة 50 مليلتر في درجة حرارة الغرفة.

بعد تدوير المواد الطافية ، أعد تعليق الحبيبات في 10 ملليلتر من DMEM الكامل المكملة بالمادة الطافية L 9 29 المعدة مسبقا ، ثم قم بتصفية الخلايا من خلال مصفاة خلايا نايلون 40 ميكرون. أضف المرشح إلى 140 مل من وسائط خلية DMEM و L 9 29 كاملة ، ثم وزع 10 مل من تعليق الخلية لكل طبق في أطباق بتري 15 100 ملم. بعد احتضان الخلايا لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون عند 10 ملليلتر من DMEM الكامل بالإضافة إلى L 9 29 طافي واحتضان الخلايا لمدة أربعة أيام إضافية.

مراقبة نمو الخلية بشكل دوري باستخدام مجهر مقلوب لحصاد البلاعم المشتقة من نخاع العظام ، وتستنشق أولا وتتخلص من المادة الطافية. ثم اغسل أطباق بتري مرتين باستخدام DMEM كامل. بعد ذلك ، أضف خمسة ملليلتر من 37 درجة مئوية كاملة DMEM واستخدم شرطيا مطاطيا لفصل الخلايا برفق ، وجمع الضامة المشتقة من نخاع العظام في أنابيب 50 مليلتر ، ثم قم بتدوير الخلايا.

تعليق الكريات في 20 مل من DMEM الكامل. أخيرا ، عد الخلايا عن طريق استبعاد التريام الأزرق. باستخدام هذه الطريقة ، يمكن الحصول على أعداد كبيرة من البلاعم في غضون أيام قليلة بعد عزل وطلاء خلايا نخاع العظم المستديرة غير الملتصقة مطروحا منها الضامة المقيمة في نخاع العظم كما هو موضح للتو.

تم تحضين خلايا السلائف التمثيلية BMDM باستخدام G-M-C-S-F. بعد ثلاثة أيام ، بدأت الخلايا في الالتصاق والتمايز إلى ضامة. بعد سبعة أيام ، لوحظ وجود طبقة أحادية ملتصقة من البلاعم المشتقة من نخاع العظام.

كشف تحليل التدفق الخلوي ل F four 80 و H-L-A-D-R أن البلاعم المشتقة من نخاع العظم عبرت عن كلتا العلامتين مما يؤكد تمايز خلايا نخاع العظم إلى ضامة. لتقييم القدرات الحمضية PHA للضامة المشتقة من نخاع العظام. تمت مراقبة قدرة الخلايا على استيعاب سرعات اللاتكس كما هو متوقع.

تم تحديد زيادة عدد الخرزات لكل خلية بمرور الوقت لتقييم إمكاناتها الداخلية للخلية. كما تم استزراع الضامة المشتقة من نخاع العظم مع Coxiella. لوحظ أن LPS العين Burnett باللون الأحمر موضعية في حجرة تحتوي على بروتين غشاء مرتبط بالليزوزومات باللون الأزرق ، ولكن ليس القسطيبسين D باللون الأخضر ، مما يدل على أن LPS كان موجودا في الجسيمات الداخلية المتأخرة ، والتي لا تستطيع الاندماج مع الجسيمات الحالة كما هو متوقع من البلاعم المشتقة من نخاع العظم.

تم تحليل تفاعلات مسببات الأمراض البكتيرية بشكل أكبر من خلال إصابتها بعين TMA Wiley. كما هو متوقع ، لم تكن البكتيريا ذات اللون الأحمر موضعية في المقصورة التي تؤوي KPS و D ، والتي تظهر مرة أخرى باللون الأخضر. في هذه اللطخة المناعية التمثيلية ، تم تقييم مسارات نقل إشارة البلاعم المشتقة من نخاع العظم مما يدل على أن البلاعم المشتقة من نخاع العظام مثل الأنسجة ، والبلاعم المعزولة تنظم مستويات كيناز P 38 خريطة ألفا الفسفرة استجابة لتحفيز ESIA coli LPS.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على المهام الرئيسية في مجال علم الأحياء الدقيقة الخلوية ، مثل المقصورة داخل الخلايا المترجمة الدقيقة.