الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

الهدف العام من تجربة السقوط هو إدخال الجزيئات الكبيرة إلى الخلايا المستهدفة دون استخدام ناقلات عن طريق التفكيك الميكانيكي. ويتحقق ذلك أولاً بوضع نوع الخلايا المستهدفة في معلق مع مادة التوصيل المطلوبة، ثم تحميلها في خزان جهاز مائعي دقيق مصمم خصيصاً لهذا الغرض. وفي الخطوة الثانية، يتم رفع الضغط في الجهاز المائعي الدقيق، وتُدفع الخلايا عبر مجموعة من القنوات المائعية الدقيقة التي تضغط الخلايا لتسهيل التفكيك المؤقت للغشاء.

بعد ذلك، تُترك الخلايا لتحضن في وجود مادة التوصيل المستهدفة لتسهيل النقل الانتشاري للمادة إلى سيتوبلازم الخلية، بينما يتم إصلاح غشاء الخلية. ويتم الحصول على نتائج تُظهر توصيلاً فعالاً للجزيئات الكبيرة باستخدام قياس التدفق الخلوي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل ation و lipo perfection في قدرتها على التعامل مع أنواع الخلايا والمواد الصعبة التي لا يمكن توصيلها بفعالية بواسطة الطرق الأخرى. ويمكن لهذه الطريقة الإجابة على أسئلة جوهرية في المجال البيولوجي، مثل كيفية تحسين إعادة برمجة الخلايا. وتمتد تطبيقات هذه التقنية لتشمل علاج السرطان وتشخيصه، لأن النظام يتيح التحكم في الخلايا المناعية لتعزيز فعاليتها المضادة للأورام.

للبدء، قم بتصنيع أو شراء الجهاز الموائع الدقيقة، وحامل الجهاز، وخزانات السوائل البلاستيكية، والحلقات المانعة للتسرب (O-rings) الموضحة هنا والمذكورة بتفصيل في البروتوكول النصي المرفق، ثم املأ ثلاثة حاويات قابلة للإغلاق جزئياً بـ 70%ethanol. ضع الأجهزة في الحاوية الأولى، والخزانات والحلقات المانعة للتسرب في الحاوية الثانية، والحوامل في الحاوية الثالثة. بعد ذلك، املأ الحاويات بالكامل بـ 70%ethanol.

بعد ذلك، ضع الحاوية التي تحتوي على الخزانات والحلقات الدائرية (O-rings)، وكذلك الحاوية التي تحتوي على الحوامل، في حمام موجات فوق صوتية لمدة تتراوح من 5 إلى 10 دقائق قبل الاستخدام. سيساعد ذلك في إزالة أي جزيئات ملوثة من التجارب السابقة؛ وأثناء عملية السونيكة للمكونات، قم بمسح مساحة العمل داخل كبينة السلامة البيولوجية باستخدام ethanol بتركيز 70%. ثم قم بتعقيم جميع المواد المطلوبة، بما في ذلك الحاويات الثلاث وزوج من الملاقط، عن طريق مسحها باستخدام ethanol بتركيز 70%، وضعها داخل كبينة السلامة البيولوجية لبدء عملية التجميع.

أولاً، ضع من منديلين إلى ثلاثة من المناديل منخفضة الوبر في منطقة العمل. بعد ذلك، قم بإزالة الخزانات البلاستيكية من حاوية الإيثانول باستخدام الملاقط وضعها على المناديل لتسهيل عملية السحب والتبخير للإيثانول من سطحها الداخلي. قم بالنقر بخفة على الخزانات للمساعدة في إزالة محلول الإيثانول.

إذا لزم الأمر، استخدم غازاً مضغوطاً لتفريغ الخزان تماماً. وبمجرد جفاف الخزانات، أدخل الحلقات المانعة للتسرب (O-rings) في الفتحات المناسبة في الخزانات. ثم استخدم الملاقط لوضع الشريحة بحيث يكون وجهها للأعلى في حامل الجهاز.

تأكد من استواء الشريحة في الحامل وقم بتعديل وضعيتها إذا لزم الأمر باستخدام الملاقط. إذا لم يثبت الجهاز بشكل صحيح في الحامل، فهناك خطر تعرضه للكسر خلال الخطوات اللاحقة. بعد ذلك، ضع الخزانات برفق على الحامل وقم بمحاذاتها مع المشابك.

تأكد من عدم سقوط الحلقات الدائرية (O-rings) من فتحاتها. خلال هذه العملية، اضغط بلطف على الخزانات حتى تستقر في مكانها وتسمع صوت نقرة. تأكد من إحكام تثبيت كلا جانبي الخزانات ومن أن الشريحة تبدو في الموضع الصحيح.

تجنب الضغط بقوة مفرطة على الخزانات، لأن الضغط قد يؤدي إلى كسر الرقاقات المخصصة للخلايا الأولية أو الخلايا الملتصقة. بالنسبة للخطوط الخلوية، قم بزراعة الخلايا قبل يوم أو يومين من التجربة بحيث لا تتجاوز نسبة التلاقي 80%.

في يوم التجربة. مباشرة قبل بدء التجربة، يتم حصاد الخلايا وإعادة تعليقها في الوسط الغذائي أو أي محلول منظم آخر بتركيز يتراوح بين مليون و10 ملايين خلية لكل مليلتر. ثم يتم تمرير معلق الخلايا بعناية عبر مصفاة خلايا ذات مسام بحجم 40 ميكرون لمنع تكتلات الخلايا والمادة الخلالية من سد الجهاز.

بمجرد التصفية، اخلط 300 µL من معلق الخلايا مع التركيز المطلوب من مادة التوصيل في أنبوب منفصل. في هذا العرض التوضيحي، يتم إضافة 2 µL من الديكسترين بتركيز 5 mg/mL و 2 µL من الأجسام المضادة الضابطة للنظير Alexa 488 لكل 50 µL من معلق الخلايا.

بعد ذلك، اخلط 100 µL من الخلايا برفق باستخدام الماصة. ثم، وباستخدام رؤوس تحميل الهلام، انقل الخلايا ومادة التوصيل إلى أحد الخزانات، وقم بتوصيل أنابيب الضغط بالخزان المملوء وأحكم ربط العقدة يدويًا لضمان الإحكام التام. ثم اضبط ضغط الهواء على 70 PSI في المنظم للتحكم في السرعة التي تنتقل بها الخلايا عبر الجهاز.

يجب تحسين الضغط بما يتناسب مع المزيج المحدد من الخلايا وشريحة الموائع الدقيقة المستخدمة في كل تجربة. بعد تحضير كل شيء، ارفع الجهاز إلى مستوى العين ووجهه بحيث يكون السائل الموجود في الخزان مرئيًا بوضوح. ثم اضغط على صمام الزر الضاغط لضغط الخزان وبدء تدفق الخلايا.

راقب السرعة التي يتدفق بها السائل من الخزان. إذا تباطأ تدفق السائل بشكل ملحوظ مقارنة بمعدل تدفقه الأولي، فمن المرجح أن الجهاز المثبت مسدود ويحتاج إلى الاستبدال. حيث سيؤدي زيادة إجهاد القص الناتج عن الانسداد إلى موت الخلايا بمعدل أكبر من الطبيعي.

عندما يصبح مستوى السائل على بعد حوالي 2 mm من قاع الخزان، قم بتدوير المنظم بسرعة إلى 0 PSI لإيقاف التدفق. من المهم إيقاف تدفق الهواء قبل أن يفرغ الخزان، وإلا فقد تندفع العينة خارج خزان التجميع. بعد ذلك، قم بجمع الخلايا المعالجة من خزان التدفق الخارجي وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق.

عند درجة حرارة الغرفة، ستستمر الخلايا المعبأة في امتصاص المواد لمدة تصل إلى 10 دقائق. بعد مرور 10 دقائق، يتم وضع الخلايا في أطباق مع وسط غذائي إضافي أو الاستمرار في استخدام الخلايا وفقاً لمتطلبات التجربة. كرر هذه الخطوات لجمع العدد المطلوب من الخلايا المعالجة، واستبدل الرقاقات عند الحاجة في حال انسدادها، مع التخلص من الأجهزة المسدودة لكل عينة لاحقة.

قم بتغيير اتجاه التدفق لتقليل آثار الانسداد. عند الانتهاء من جمع الخلايا، افصل الخزانات برفق عن الحامل الرئيسي عن طريق دفع أذرع المشبك جانباً. ثم ضع كل جزء سيُعاد استخدامه في حاوية التخزين المناسبة واملأها بـ 70%ethanol طازج.

أخيرًا، ضع جميع الرقاقات المستخدمة في حاوية منفصلة للتخلص منها بشكل صحيح. تم قياس كفاءة التوصيل وحيوية خلايا hela. وبناءً على سلسلة من التجارب، تم اختبار ثلاث رقاقات مائعية دقيقة مختلفة ضمن نطاق سرعات يصل إلى 600 millimeters per second.

أظهرت هذه الاختبارات أن زيادة سرعات التدفق أدت إلى تحسين إيصال الدكسترين المتقارن فلورياً، بوزن ثلاثة كيلودالتون، إلى الخلايا في كل رقاقة من الرقاقات التي تم اختبارها. بالإضافة إلى ذلك، تسببت السرعات المرتفعة أيضاً في انخفاض حيوية الخلايا بنسبة 20% تقريباً في الأجهزة المختبرة. وتعتبر كمية موت الخلايا هذه منخفضة نسبياً، وغالباً ما تكون أعلى بكثير في الأجهزة المصممة بشكل غير ملائم.

إن امتصاص الديكسترين المقترن بالصبغة الزرقاء الهادئة (Pacific blue) في مجموعة الخلايا الضابطة الموضحة على اليسار هو نتيجة لارتباط سطحي محدود وتأثيرات خلويّة بلعمية. حيث تعرضت هذه الخلايا لمادة التوصيل لنفس المدة الزمنية التي تعرضت لها الخلايا المعالجة. وتظهر على اليمين مجموعة من الخلايا الحية التي تمر عبر جهاز الموائع الدقيقة أثناء تعرضها لنفس تركيز الديكسترين المستخدم مع الخلايا الضابطة.

تُعتبر الخلايا الموجودة في المنطقة المظللة غير مُوصلة، بينما تُعرَّف الخلايا الموجودة على يمين الخط بأنها مُوصلة. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن إتمامها في أقل من ساعة واحدة إذا نُفذت بشكل صحيح. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق أخرى، مثل دراسة ما بعد القياسات البصرية، للإجابة على أسئلة إضافية مثل كفاءة التوصيل ووظيفية المواد بعد تطويرها.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب التجديدي لاستكشاف برمجة الخلايا في الخلايا الأولية البالغة باستخدام التوصيل المباشر للبروتين. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكتسب فهماً جيداً لكيفية إعداد وتشغيل نظام العصر الذاتي للتطبيق المطلوب.