الضغط خلية باعتبارها قوية، ميكروفلويديك بين الخلايا توصيل منصة

الهدف العام من التجربة المتساقطة هو توصيل الجزيئات الكبيرة مجانا إلى الخلايا المستهدفة باستخدام الاضطراب الميكانيكي. يتم تحقيق ذلك عن طريق وضع نوع الخلية المستهدفة أولا في حالة تعليق مع مادة التوصيل المطلوبة وتحميلها في خزان جهاز ميكروفيليديك مصمم خصيصا. كخطوة ثانية ، يتم ضغط جهاز الموائع الدقيقة ويتم دفع الخلايا من خلال مجموعة من قنوات الموائع الدقيقة التي تضغط على الخلايا لتسهيل تعطيل الغشاء العابر.

بعد ذلك ، يسمح للخلايا بالتحتضن في وجود مادة التوصيل المستهدفة لتسهيل النقل المنتشر للمادة إلى سيتوبلازم الخلية. أثناء إصلاح غشاء الخلية. يتم الحصول على النتائج التي تظهر التوصيل الفعال للجزيئات الكبيرة من خلال استخدام قياس التدفق الخلوي.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل إتقان الدهون ، هي أنها قادرة على معالجة أنواع الخلايا والمواد الصعبة التي لا يمكن توصيلها بشكل فعال بطرق أخرى. يمكن لهذه الطريقة الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال البيولوجي ، مثل كيفية تحسين إعادة برمجة الخلايا. تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى علاج وتشخيص السرطان لأن النظام يتيح التلاعب بالخلايا المناعية لتعزيز فعاليتها المضادة للورم.

للبدء ، قم بتصنيع أو شراء جهاز الموائع الدقيقة وحامل الجهاز وخزانات السوائل البلاستيكية والحلقات O الموضحة هنا والمدرجة بالتفاصيل في بروتوكول النص المصاحب ، ثم املأ ثلاث حاويات قابلة للغلق جزئيا بنسبة 70٪ من الإيثانول. ضع الأجهزة في الحاوية الأولى ، والخزانات والحلقات O في الحاوية الثانية والحوامل في الحاوية الثالثة. ثم املأ الحاويات بقية الطريق بنسبة 70٪ من الإيثانول.

في المرتبة التالية ، الحاوية التي تحتوي على الخزانات والحلقات O بالإضافة إلى الحاوية التي تحتوي على الحوامل في حمام الموجات فوق الصوتية لمدة خمس إلى 10 دقائق قبل الاستخدام. سيساعد ذلك على إزالة أي جزيئات ملوثة من التجارب السابقة بينما يقوم المكون بالصوتنة بمسح مساحة العمل في خزانة السلامة الحيوية بنسبة 70٪ من الإيثانول. ثم قم بتعقيم جميع المواد المطلوبة بما في ذلك الحاويات الثلاث وزوج من الملقط عن طريق مسحها بنسبة 70٪ من الإيثانول ووضعها داخل خزانة السلامة الحيوية لبدء التجميع.

أولا ، ضع مناديل إلى ثلاث مناديل منخفضة الوبر في منطقة العمل. ثم قم بإزالة الخزانات البلاستيكية من حاوية الإيثانول بالملاقط وضعها على المناديل لتسهيل فتل وتبخر الإيثانول من سطحه الداخلي. اضغط برفق على الخزانات للمساعدة في إزالة محلول الإيثانول.

إذا لزم الأمر ، استخدم الغاز المضغوط لتطهير الخزان بالكامل. بمجرد أن تجف الخزانات ، أدخل الحلقات O في الفتحات المناسبة على الخزانات. ثم استخدم الملقط لوضع الشريحة ووجهها لأعلى في حامل الجهاز.

تأكد من أن الشريحة مسطحة في الحامل واضبطها إذا لزم الأمر باستخدام الملقط. إذا لم يكن الجهاز مناسبا بشكل صحيح لحامله ، فهناك خطر من انكسابه أثناء الخطوات اللاحقة. بعد ذلك ، ضع الخزانات برفق على الحامل وقم بمحاذاة المشابك.

تأكد من أن الحلقات O لا تسقط من فتحاتها. خلال هذه العملية ، اضغط برفق على الخزانات حتى تستقر في مكانها. تأكد من أن كلا جانبي الخزانات آمنان وأن الرقاقة تبدو في الموضع الصحيح.

لا تضغط على الخزانات بقوة مفرطة. حيث يمكن أن يكسر الضغط الرقائق للابتدائية أو الالتزام. خطوط الخلايا ، تضع الخلايا قبل يوم إلى يومين من التجربة بحيث لا تزيد عن 80٪ ملتقية.

في يوم التجربة. قبل التجربة مباشرة ، قم بحصاد الخلايا وإعادة التركيب ، وتعليقها في الوسائط أو أي مخزن مؤقت آخر مرغوب فيه بين واحد و 10 ملايين خلية لكل مليلتر. ثم قم بتمرير تعليق الخلية بعناية من خلال شبكة مصفاة خلية 40 ميكرون لمنع كتل الخلايا والمصفوفة من انسداد الجهاز.

بمجرد تصفيته ، قم بخلط 300 ميكرولتر من تعليق الخلية مع التركيز المطلوب لمادة التوصيل في أنبوب منفصل. لهذا العرض التوضيحي ، لترين ميكرولترين من الدكسترين بمعدل خمسة ملليغرام لكل مليلتر وميكرولترين من Alexa. 4 88 يتم إضافة الأجسام المضادة للتحكم في النظائر لكل 50 ميكرولتر من تعليق الخلية.

بعد ذلك ، امزج 100 ميكرولتر من الخلايا برفق عن طريق سحب العينات. ثم باستخدام أطراف تحميل الهلام، قم بتوصيل الخلايا ومواد التوصيل في أي من الخزانات، وقم بتوصيل أنابيب الضغط بالخزان المملوء وشد العقدة بالإصبع لضمان السقف المناسب. ثم اضبط ضغط الهواء على 70 رطل لكل بوصة مربعة على المنظم للتحكم في السرعة التي تنتقل بها الخلايا عبر الجهاز.

يجب تحسين الضغط لمجموعة الخلية المحددة ورقاقة الموائع الدقيقة المستخدمة في كل تجربة. مع تحضير كل شيء ، ارفع الجهاز إلى مستوى العين ووجهه بحيث يمكن رؤية السائل الموجود في الخزان بسهولة. ثم اضغط على صمام زر الضغط للضغط على الخزان وبدء تدفق الخلية.

راقب السرعة التي يتدفق بها السائل من الخزان. إذا تباطأ السائل بشكل كبير بالنسبة لمعدل التدفق الأولي ، فمن المحتمل أن يكون الجهاز المركب مسدودا ويحتاج إلى التبادل. سيؤدي القص المتزايد الناجم عن الانسداد إلى موت خلايا أكبر من الطبيعي.

عندما يكون مستوى السائل على بعد ملليمترين تقريبا من قاع الخزان ، قم بتحويل المنظم بسرعة إلى صفر PSI لإيقاف التدفق. من المهم إيقاف تدفق الهواء قبل إفراغ الخزان ، وإلا فقد يتم إخراج العينة من خزان التجميع. ثم اجمع الخلايا المعالجة من خزان التدفق ووضعها في أنبوب طرد مركزي صغير.

في درجة حرارة الغرفة ، ستستمر الخلايا المقدرة في امتصاص المواد لمدة تصل إلى 10 دقائق. بعد 10 دقائق ، قم بطلاء الخلايا بوسائط إضافية أو استمر في استخدام الخلايا وفقا للاحتياجات التجريبية. كرر هذه الخطوات لجمع أكبر عدد ممكن من الخلايا المعالجة حسب الحاجة وتبادل الرقائق حسب الحاجة إذا كانت تسد وتخلص من الأجهزة المسدودة C لكل عينة لاحقة.

قم بتغيير اتجاه التدفق لتقليل تأثيرات الانسداد. عند الانتهاء من تجميع الخلايا ، افصل الخزانات برفق عن الحامل الرئيسي عن طريق دفع أذرع المقطع جانبا. ثم ضع كل جزء لإعادة استخدامه في حاوية التخزين المناسبة واملأه بالإيثانول الطازج بنسبة 70٪.

أخيرا ، ضع جميع الرقائق المستخدمة في وعاء منفصل للتخلص منها بشكل صحيح. تم قياس كفاءة التوصيل وقابلية الخلية لخلايا hela. بعد سلسلة من التجارب ، تم اختبار ثلاث رقائق مختلفة من الموائع الدقيقة في مجموعة من السرعات تصل إلى 600 ملم في الثانية.

أظهرت هذه الاختبارات أن زيادة سرعات التدفق حسنت توصيل دكسترين مترافق بالفلورسنت ، ثلاثة كيلو دالتون إلى الخلايا لكل شريحة من الرقائق التي تم اختبارها. بالإضافة إلى ذلك ، تسببت السرعات المتزايدة أيضا في انخفاض صلاحية الخلية بحوالي 20٪ في الأجهزة التي تم اختبارها. هذا المقدار من موت الخلايا منخفض نسبيا وغالبا ما يكون أعلى بكثير في الأجهزة المصممة بشكل غير مناسب.

إن امتصاص الدكسترين المترافق الأزرق في المحيط الهادئ في مجموعة الخلايا الضابطة الموضحة على اليسار هو نتيجة لارتباط السطح المحدود والتأثيرات الداخلية للخلايا الداخلية. حيث تتعرض الخلايا لمواد التوصيل لنفس القدر الزمني مثل الخلايا المعالجة. على اليمين يوجد عدد الخلايا الحية التي تمر عبر جهاز الموائع الدقيقة أثناء تعرضها لنفس تركيز الدكسترين مثل خلايا التحكم.

تعتبر الخلايا الموجودة في المنطقة المظللة غير مسلمة ، ويتم تعريف الخلايا الموجودة على يمين الخط على أنها تم تسليمها. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في أقل من ساعة واحدة إذا تم إجراؤها بشكل صحيح. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق أخرى ، وقياس البصريات بعد الحياة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل كفاءة التسليم ووظائف المواد بعد تطويرها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال الطب التجديدي لاستكشاف برمجة الخلايا في الخلايا الأولية البالغة باستخدام توصيل البروتين المباشر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد وتشغيل نظام الضغط الذاتي للتطبيق الذي تريده.