جسيمات PLGA النانوية المكونة من مستحلب أحادي أو مزدوج مع فيتامين E-TPGS

الهدف العام من هذا الإجراء هو تكوين جسيمات نانوية بوليمرية ذات حجم قابل للضبط. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إذابة البوليمر في مذيب عضوي وإضافة الدواء أو مادة تغليف فلورية. والخطوة الثانية هي استحلاب البوليمر مع طور مائي يحتوي على عامل الاستحلاب، ثم السماح للجزيئات بالتصلب في حجم مائي أكبر مع تبخر المذيب.

بعد ذلك، يتم غسل الجسيمات وجمعها عن طريق الطرد المركزي ثم تجفيفها بالتجميد للتخزين طويل الأمد. وتتمثل الخطوة النهائية في توصيف حجم الجسيمات النانوية ومورفولوجيا السطح باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح أو تصوير SEM. وفي النهاية، يُستخدم SEM لإظهار إمكانية التحكم في حجم الجسيمات النانوية عن طريق تغيير تركيز المستحلب.

تمتد آثار هذه التقنية لتشمل علاج مجموعة متنوعة من الأمراض البشرية، حيث يمكن تخصيص الجسيمات لتغليف وإيصال نطاق واسع من العوامل العلاجية لضمان مفعول مستدام في الأنسجة المستهدفة. ويُعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية.

تعد خطوات الاستحلاب صعبة التعلم لأن الجوانب الدقيقة لكيفية تكوين المستحلب يمكن أن تؤثر بشكل كبير على خصائص الجسيمات الناتجة. لبدء تحضير الجسيمات النانوية، ضع حوالي 100 مليجرام من حمض البولي لاكتيك كوجليكوليك، المعروف أيضاً باسم PLGA، في أنبوب اختبار بحجم 13 × 100 مليمتر. بعد ذلك، وباستخدام ماصة مصلية زجاجية، انقل 1 مليليتر من خلات الإيثيل إلى العينة، ثم غطِّ الجزء العلوي من الأنبوب برقائق الألومنيوم، ثم أحكم إغلاق الرقائق باستخدام شريط Parafilm.

تأكد من لف غشاء البارافيلم (Parafilm) بإحكام حول الحافة العلوية للقارورة والحافة السفلية لرقاقة القصدير لمنع تبخر المذيب. حدد مستوى المذيب على أنبوب الاختبار واترك البوليمر يذوب طوال الليل. وفي اليوم التالي، أضف مزيداً من المذيب في حال حدوث أي تبخر.

قم بتجهيز المعدات والمواد التالية داخل خزانة استخلاص الغازات بالقرب من جهاز الموجات فوق الصوتية: جهاز مزج دوامي، وأنبوبين صغيرين من الماصات الزجاجية (pasture pipettes) مع بصيلات مطاطية، ولوح تحريك مغناطيسي. بالإضافة إلى ذلك، ضع كأساً زجاجياً كبيراً مملوءاً بماء ومكعبات ثلج على حامل أسفل جهاز الموجات فوق الصوتية.

بعد ذلك، أضف 45 milliliters من 0.3%weight per volume من vitamin E-T-P-G-S إلى beaker زجاجي سعة 200 milliliter، ثم اضبط سرعة التقليب على 360 RPM. بعد ذلك، أضف two milliliters من 0.3%weight per volume من vitamin E-T-P-G-S إلى أنبوب اختبار زجاجي بحجم 13 by 100 millimeter. ومن أجل خلط العوامل الكارهة للماء، أضف المادة المغلفة مباشرة إلى محلول البوليمر، مع الحرص على تجنب جدران أنبوب الاختبار، وقم برج الأنبوب باستخدام جهاز Vortex حتى يتوزع المغلف بشكل متجانس.

بالنسبة للعوامل المحبة للماء، قم باستحلاب المادة المغلفة مع محلول البوليمر. أضف ما يصل إلى 50 µL من الدواء في المحلول المنظم إلى سطح محلول البوليمر. عرّض الخليط للموجات فوق الصوتية فوق الثلج لمدة 10 ثوانٍ تقريبًا أو حتى يصبح المحلول معتمًا ومتجانسًا.

بعد ذلك، قم برج أنبوب الاختبار الذي يحتوي على vitamin E-T-P-G-S باستخدام جهاز المرج (vortex) على سرعة عالية مع إمساك الأنبوب بشكل رأسي. حافظ على وضع ماصة باستور الزجاجية على ارتفاع سنتيمتر واحد إلى سنتيمترين فوق فوهة أنبوب الرج، وأضف محلول البوليمر ببطء على شكل قطرات فوق سطح السائل الذي يتم رجه. احرص على ألا تلمس الماصة جوانب الأنبوب حتى يتم إضافة محلول البوليمر بالكامل.

استمر في رج المحلول باستخدام جهاز الرج الميكانيكي (vortex). الآن يتم تكوين مستحلب لمدة 15 ثانية. انقل البوليمر المستحلب على الفور إلى جهاز الموجات فوق الصوتية (ultrasonicator).

حافظ على غمر أنبوبة الاختبار في ماء مثلج، ثم قم بمعالجة المستحلب باستخدام جهاز السونيكيشن في ثلاث نبضات مدة كل منها عشر ثوانٍ. حرك المستحلب للأعلى وللأسفل حول المسبار لضمان تجانس عملية السونيكيشن، وتجنب ملامسة المسبار لجوانب أنبوبة الاختبار أو قعرها. توقف لمدة تتراوح بين 5 إلى 10 ثوانٍ بين كل نبضة سونيكيشن مدتها عشر ثوانٍ للسماح للمحلول بالتبريد قبل المتابعة.

ثم أضف من واحد إلى اثنين مللي لتر من 0.3%vitamin E-T-P-G-S من محلول التقليب إلى المستحلب. سيؤدي ذلك إلى تقليل لزوجة البوليمر المستحلب، مما يسهل صبه، ثم أفرغ المستحلب في محلول التقليب. اغسل أي محلول متبقٍ في أنبوب الاختبار وأضفه إلى محلول التقليب.

اترك الجسيمات النانوية لتتصلب عن طريق التقليب لمدة ثلاث ساعات. إذا كانت المادة المغلفة حساسة للضوء، فقم بتغطية الكأس بورق الألومنيوم مع ترك الجزء العلوي مفتوحاً لتسهيل تبخر المذيب. لجمع الجسيمات النانوية، ابدأ بتقسيم الجسيمات النانوية إلى أنبوبي طرد مركزي من نوع Oak Ridge بسعة اسمية تبلغ 30 ملليلتر، مع موازنة كل منهما بفرق لا يتجاوز 0.1 جرام. بعد ذلك، قم بإجراء عملية الطرد المركزي للجسيمات النانوية باستخدام دوار ثابت الزاوية لمدة 15 دقيقة بسرعة 17,000.

أو تكرار عملية الطرد المركزي. ستؤدي أوقات الطرد المركزي الأطول إلى جمع جزء أكبر من الجسيمات النانوية الأصغر حجماً. تخلص من السائل الطافي مع الحرص على عدم تعكير راصب الجسيمات النانوية.

أضف خمسة ملليلترات من الماء المقطر، واستخدم حماماً مائياً ومحركاً ومجانسًا دواميًا لتعليق الجسيمات النانوية تماماً. ادمج محتويات أنبوبي الطرد المركزي في أنبوب واحد وأضف 20 ملليلتر من الماء المقطر ليصل الحجم الإجمالي إلى 30 ملليلتر. ثم كرر خطوات الطرد المركزي والغسيل مرتين إضافيتين، ليصبح إجمالي عدد مرات الغسيل ثلاث مرات.

يجب أن يكون حجم السائل في معلق إعادة تعليق الراسبة الأخيرة ما بين أربعة إلى خمسة ملليلترات. جمد كمية صغيرة من الجسيمات النانوية الخالية من telos للتصوير بالمجهر الإلكتروني الماسح (SEM) وبقية المعلق. أضف نسبة وزنية من TLO إلى البوليمر تتراوح بين واحد إلى اثنين كمادة واقية من التجميد لضمان إعادة تعليق منتظمة وكاملة للجسيمات النانوية من PLGA.

سيمنع ذلك تكوّن بلورات الجليد التي قد تسبب تلف سطح الجسيمات وتحفز التكتل. انقل الجسيمات النانوية إلى أنبوب طرد مركزي سعة خمسة ملليلتر موزون مسبقاً، ثم جمده عند درجة حرارة -80 °C لمدة 30 دقيقة على الأقل. بعد ذلك، انزع غطاء الأنبوب وقم بتغطية الفتحة بتثبيت منديل مختبري فوق القمة باستخدام شريط مطاطي.

العمل بسرعة لمنع ذوبان المحتويات في حال حدوث أي انصهار. أعد التجميد قبل الوضع في جهاز التجفيف بالتجميد، ثم قم بتجفيف العينة التي حجمها 5 mL بالتجميد لمدة 72 ساعة. بعد ذلك، أعد وضع الغطاء وقم بلف الأنبوب وتخزين الجزيئات المجففة بالتجميد عند درجة حرارة -80 °C.

في يوم التصوير، ضع شريطاً من شريط الكربون مزدوج الوجه على قاعدة SEM. قم بتمييز الجزء المعدني من القاعدة باستخدام قلم تحديد دائم للرجوع إليه لاحقاً. استخدم ملعقة معدنية لجمع كمية صغيرة من الجسيمات النانوية المجففة بالتجميد، ووزعها برفق على سطح الشريط.

قم بمسح سطح القاعدة باستخدام منديل مختبري أو استخدم الهواء المضغوط لإزالة الجسيمات النانوية السائبة. قم بتصوير الجسيمات باستخدام مسافة عمل للحزمة تتراوح بين 5 إلى 15 مليمتر، وبجهد يتراوح بين 5 إلى 12 كيلوفولت، وحجم بقعة يتراوح من 1 إلى 3؛ حيث قد تؤدي شدة الحزمة الأعلى إلى تسخين موضعي للعينة، مما سيؤدي بدوره إلى تغيير المورفولوجيا السطحية للجسيمات. يتم رصد الجسيمات الدقيقة عند تكبير 100 مرة، بينما يمكن تمييز الجسيمات النانوية عند تكبير 3000 مرة.

تركيز التكبير على قمة الكرة لتحديد الجسيمات التي يمكن رؤيتها بسهولة باستخدام مجهر SEM، مع جمع ثلاث صور على الأقل لكل دفعة من أجل الحصول على عينة ممثلة لحجم الجسيمات ومورفولوجيتها. وباستخدام هذه الطريقة، يمكن تكوين جسيمات بواسطة انفعال واحد تظهر ككرات فردية غير ملتحمة ذات مورفولوجيا سطحية ملساء ونطاق واسع من الأحجام الموزعة في جميع أنحاء العينة. الجسيمات الدقيقة الموضحة هنا يبلغ متوسط قطرها 730 nanometers.

تظهر هنا جسيمات نانوية تم إنشاؤها بواسطة مستحلب واحد تقوم بتغليف عقار كامبين (campin) الكاره للماء. وقد انتهى الأمر بهذه الجسيمات لتكون أصغر حجماً بمتوسط قطر يبلغ 340 nanometers. وقد أنتجت التركيزات الأعلى من المستحلب جسيمات أصغر، حيث انخفض متوسط الأقطار من 2000 إلى 200 nanometers.

ومع زيادة تركيز المستحلب من 0.01 إلى 0.3% كما هو موضح في صور SEM هنا. ومع ذلك، عندما كان تركيز vitamin E-T-P-G-S مرتفعاً جداً، لم تتشكل جسيمات منفصلة عند استخدام 1% من vitamin E-T-P-G-S، بل وُجد اندماج شديد وهياكل تشبه الصفائح منتشرة في كامل البنية. صحيح. بمجرد تعلم كيفية تصنيع جسيمات PLG النانوية عن طريق الاستحلاب، يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل تعديل السطح لهندسة الجسيمات النانوية للتفاعل مع أنواع معينة من الخلايا أو مناطق محددة في الجسم.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تكوين جسيمات ذات حجم قابل للتكرار والضبط عن طريق الاستحلاب.