عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة
January 8th, 2014
بالمقارنة مع الكروماتوغرافيا تقارب التقليدية باستخدام البروتين Agarose حبة معبأة الأعمدة، البروتين A غشاء الممتزات يمكن أن تسرع بشكل كبير العزل المختبرية على نطاق الأجسام المضادة وغيرها من البروتينات Fc التعبير عن جزء. ويمكن أن تزيد أساليب التحليل والتقدير الكمي المناسبة من تسريع معالجة البروتين، مما يسمح بإكمال العزل/التوصيف في يوم عمل واحد، بدلا من 20 ساعة عمل.
الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوصيف البروتينات التي تعبر عن البروتينات البشرية الوهمية بكفاءة وفعالية باستخدام البروتين وامتصاص الغشاء وسير العمل المبسط. يتم تحقيق ذلك عن طريق توضيح المادة الطافية لزراعة الخلايا أولا بمرشح 0.22 ميكرون. الخطوة الثانية هي تجميع نظام التدفق والبدء في نضح ثقافة الخلية الطافية من خلال امتصاص غشاء البروتين A.
بعد ذلك ، يتم التلميح إلى البروتين الذي يعبر عن FC البشري من امتصاص الغشاء مع تركيز EIT الناتج من خلال الترشيح الفائق ، متبوعا بالتبادل المؤقت من خلال غسيل الكلى. تتمثل الخطوات النهائية في استخدام قياس التدفق الخلوي والنشاف الغربي لتحديد جودة وكمية البروتين المركز. في النهاية ، تظهر ممتصات غشاء البروتين A ، جنبا إلى جنب مع سير العمل المبسط ، انخفاضا في وقت المعالجة وزيادة محتملة في إنتاجية البروتين مقارنة بكروماتوغرافيا التقارب التقليدية مع الأعمدة المعبأة بالبروتين A aro.
لذا فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الطرق الحالية مثل كروماتوغرافيا تقارب العمود هي أن ممتص الغشاء يسمح بعوائد أعلى محتملة من البروتين مع وقت معالجة أقل. يمكن أن يؤدي اختيار طرق التوصيف المناسبة أيضا إلى تقليل وقت المعالجة ، وإعداد ممتص الغشاء باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، والتأكد من أن جميع المحاليل التي يتم تغليفها في درجة حرارة الغرفة ويتم ترشيحها مسبقا من خلال مرشح 0.22 ميكرون. للبدء ، املأ حقنة سعة 10 مليلتر بمحلول ملحي مخزن بفوسفات KO أو DPBS مفلتر بمقدار 0.22 ميكرون وقم بتفريغ أي فقاعات هواء.
التأكد من عدم دخول الهواء أبدا إلى ممتص الغشاء ، مما يؤدي إلى استخدام DPBS لإزالة محلول التخزين وتوازن ممتص الغشاء مباشرة قبل الاستخدام. قم بتصفية المادة الطافية لثقافة الخلية مباشرة قبل التكاثر من خلال ممتص الغشاء باستخدام وحدة ترشيح معقمة تعمل بالفراغ 0.22 ميكرون لتحميل ممتص غشاء البروتين A ، وشفط المادة الطافية لثقافة الخلية في حقنة قفل إغراء ، وتفريغ أي فقاعات هواء لتجميع المواد والمعدات. أولا ، قم بتوصيل المحقنة بمدخل ممتص الغشاء.
قم بتوصيل أنبوب مرن بمخرج امتصاص الغشاء إذا رغبت في ذلك. ضع مرشح حقنة 0.22 ميكرون بين المحقنة وممتص الغشاء. استخدم قارورة أو زجاجة للقبض عليها من الممتص.
اضبط مضخة الحقنة على معدل التدفق الحجمي المطلوب ، ولكن لا تتجاوز معدل التدفق الموصى به من قبل الشركة المصنعة. Perfu ثقافة الخلية طافية من خلال امتصاص الغشاء تجمع التدفق من خلال. أعد تحميل المحقنة بمادة طافية حسب الحاجة.
إذا رغبت في ذلك ، اختبر التدفق بحثا عن وجود البروتين باستخدام قياس التدفق الخلوي أو النشاف الغربي أو eisa بناء على تفضيل المختبر ، فعادة ما يكون من غير الضروري إعادة تدفق البروتين من ممتص الغشاء. أولا ، اغسل ممتص الغشاء ب 10 مل من DPBS لإزالة أي بروتين غير مرتبط. بروتين التصلب من ممتص الغشاء بمعدل التدفق المطلوب.
باستخدام 10 إلى 15 مل من محلول الشطف. أمسك EIT في أنبوب يحتوي على مخزن مؤقت محايد بنسبة 10٪ من حجم elucian. بعد التهرب من البروتين ، قم بتجديد ممتص الغشاء وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
املأ ممتص الغشاء بنسبة 20٪ من الإيثانول في DPBS للتخزين طويل الأجل عند أربع درجات مئوية. قم بإيداع جميع EIT. في وحدة مرشح الطرد المركزي للوزن الجزيئي 10 كيلودالتون.
اتبع تعليمات الشركة المصنعة لغسيل الكلى بالطرد المركزي. ريتن تيت. في وحدة غسيل الكلى صغيرة الحجم مع قطع الوزن الجزيئي 10 كيلودالتون مقابل المخزن المؤقت للاختيار قد تحتاج إلى إضافة إلى المادة التي تم تحليلها.
إذا كان ترسيب البروتين مصدر قلق ، فقم بحل معايير البروتين المنقى و FC على الجل المفضل بواسطة صفحة SDS تحت ظروف التقليل أو عدم التقليل حسب الرغبة. استخدم هلام صغير بدلا من هلام صغير لتقليل وقت التشغيل لكميات عينة متعددة من البروتين المنقى ، بما في ذلك العينات المخففة باستخدام DPBS للتأكد من أن إشارات نطاق البروتين المنقى ضمن نطاق الإشارة الخطية لمعايير FC. في تحليل الصور بعد الفصل على بروتينات نقل الجل من الجل إلى غشاء فلوريد بولي أولين في نظام عازلة متقطع باستخدام نشاف شبه جاف باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، عادة ما يكون وقت النقل من خمس إلى 10 دقائق.
Kumasi تلطخ الجل بعد النقل للتحقق من كفاءة النقل. قم بإجراء النشاف المناعي باستخدام مضاد FC أو مضاد IgG مترافق مع الفوسفاتيز القلوي أو بيروكسيداز الفجل الحار باستخدام الكشف عن البروتين بمساعدة الفراغ. عادة ما يكون وقت النشاف المناعي أقل من ساعة واحدة.
تطوير اللطخة المناعية باستخدام الركيزة والطريقة المختارة. حدد كمية البروتين المنقى عن طريق تحليل الصور. قم بإجراء انحدار خطي على إشارات النطاق من معايير FC.
إذا كان R تربيع أكبر من 0.90 ، فاستخدم معادلة الخط لحساب كمية البروتين من إشارة النطاق الخاصة به مع مراعاة تخفيف العينة إذا لزم الأمر. نظرا لأن القياس الكمي للبروتين يتم إجراؤه على أساس fc ، اضبط قيمة اختلافات الوزن الجزيئي بين البروتين و fc. إذا كان R تربيع أقل من 0.90 ، كرر إجراء النشاف الغربي المعجل.
أخيرا ، تحقق من صحة البروتين باستخدام المقايسات الوظيفية أو طرق للكشف عن FC عن طريق قياس التدفق الخلوي. تم استخدام النشاف الغربي أو قياس التدفق الخلوي EISA لاختبار وجود GAL الوظيفي واحد HFC في الطاف لثقافة الخلية الأولية كما هو موضح في وسط زراعة الخلايا الطازجة للرسم البياني الأزرق ، والذي يظهر هنا باللون الأحمر ، حيث كان التحكم السلبي المتداخل مع هذا الرسم البياني باللون الأخضر هو التدفق من خلال الإشارة إلى أن ممتص الغشاء التقط بكفاءة واحتفظ به GAL واحد من مركبات الكربون الهيدروفلورية جالون واحد من HFC تم التلميح إليه من ممتص الغشاء بزيادات مليلتر واحدة بمعدل واحد مليلتر في الدقيقة باستخدام عازلة حمضية قائمة على الأمين وكسور شطف محايدة تم اختبارها لاحقا لوجود GG واحد HFC وظيفي باستخدام قياس التدفق الخلوي. زادت إشارة GL واحدة HFC بالتتابع من elucian واحد يساوي تقريبا التحكم السلبي إلى الحد الأقصى في EEU ثلاثة ، ثم انخفضت إلى مستوى ثابت تقريبا عند الإيلوسيان التسعة و 10.
لم يصل EEU 10 النهائي إلى التكافؤ لإشارة التحكم السلبية بسبب احتفاظ بعض الاعلانات بامتصاص GL واحد تم إجراء القياس الكمي وتوصيف GL المنقى ، تم إجراء HFC في إجراء نشاف غربي تم تسريعه عن طريق النقل شبه الجاف والنشاف المناعي بمساعدة الفراغ. من خلال مقارنة GA إشارة HFC واحدة بمعايير القياس الكمي لمركبات الكربون الهيدروفلورية. تم تحديد كمية ونوعية المواد النقية.
كانت إشارات GAL HFC واحدة وإشارات GAL واحدة HFC المتدهورة ضمن نطاق المعايير. وكانت شدة الإشارة للنطاقات القياسية لمركبات الكربون الهيدروفلورية مرتبطة خطيا بكمية مركبات الكربون الهيدروفلورية الموجودة. تم تحديد تركيز GAL المنقى واحد HFC على أساس مركبات الكربون الهيدروفلورية ليكون 450 ميكروغرام لكل مليلتر عن طريق معالجة الصور.
ضبط الوزن الجزيئي ل G واحد HFC. كان تركيز المادة النقية 720 ميكروغرام لكل ملليلتر. في المقابل ، تم تحميل الكثير من GAL المنقى HFC في الممر السادس والسابع من اللطخة الغربية الموضحة هنا ، مما أدى إلى إنشاء إشارات تشبع أو تجاوزت نطاق معايير مركبات الكربون الهيدروفلورية ، مما يمنع القياس الكمي.
بديل للنشاف الغربي ، يمكن أن يكون تلطيخ هلام كوماسي بمثابة فحص سريع لمراقبة الجودة و / أو طريقة القياس الكمي. لاحظ أن نطاقا يبلغ حوالي 10 كيلوڈالتون بالإضافة إلى نطاقات عند حوالي 25 كيلوڈالتون و 40 كيلودالتون كان موجودا في عينة GAL المتدهورة من مركبات الكربون الهيدروفلورية الواحدة. هذا النطاق متدهور GAL واحد HFC الذي كان غير متفاعل مع الجسم المضاد للكشف المستخدم في البقع الغربية.
بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل البروتينات التي تعبر عن البروتينات البشرية الخيمرية باستخدام امتصاص الغشاء وكيفية توصيف تلك البروتينات في أقل من أربع ساعات.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
المراجعة
تناقش هذه المقالة طريقة فعالة لعزل وتوصيف البروتينات البشرية المهجنة التي تعبر عن Fc باستخدام ماصّات غشاء بروتين A. يقلل هذا النهج بشكل كبير من وقت المعالجة مقارنة بالطرق التقليدية، مما يسمح بعزل بروتين فعال خلال يوم عمل واحد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- تنقيّة البروتين
- التكنولوجيا الحيوية
- توصيف الأجسام المضادة
الخلفية
- يمكن أن يكون الكروماتوغرافيا بالارتباط التقليدي مستغرقًا للوقت.
- تقدم ماصّات غشاء بروتين A بديلًا أسرع.
- تعتبر طرق العزل الفعالة ضرورية للبحث والتطوير.
- تعزز عمليات العمل المبسطة الإنتاجية في البيئات المختبرية.
غرض الدراسة
- لعزل البروتينات البشرية المهجنة التي تعبر عن Fc بشكل فعّال.
- لإظهار مزايا استخدام ماصّات غشاء بروتين A.
- لتقليل الوقت الإجمالي المطلوب لمعالجة البروتين.
الطرق المستخدمة
- توضيح مصل خلايا الثقافة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
- تصريف المصل من خلال ماصّات غشاء بروتين A.
- التخلص من البروتين البشري الذي يعبر عن Fc من الغشاء.
- تركيز البروتين المتحرر من خلال الترشيح الفائق وتبادل المخزن بواسطة الديلزة.
النتائج الرئيسية
- تنقص ماصّات غشاء بروتين A بشكل كبير من وقت المعالجة.
- زيادة محتملة في محصول البروتين مقارنة بالطرق التقليدية.
- تم تقييم جودة وكمية البروتين المتركز باستخدام القياس الخلوي وغربلة ويسترن.
- يعزز سير العمل المبسّط من كفاءة المختبر.
الخلاصات
- تعتبر ماصّات غشاء بروتين A فعّالة لعزل البروتين السريع.
- يمكن أن تحول عمليات العمل المبسطة ممارسات المختبر.
- قد تؤدي المزيد من الأبحاث إلى تحسين هذه الطرق لتطبيقات مختلفة.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Protein A membrane adsorbers enable rapid isolation of Fc-expressing proteins, reducing processing time from 20+ hours to under 9 hours. This streamlined workflow supports early discovery by providing timely access to purified biologics for functional assessment. The approach lowers resource barriers for labs lacking high-pressure systems or specialized personnel, enhancing throughput in target validation pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of chimeric Fc-fusion protein function through rapid isolation and quantification.
- Operational Value: Reduces hands-on time and equipment dependency, allowing limited-experience staff to perform isolations.
- Predictive Value: Supports hypothesis testing by delivering quality-controlled material for downstream assays within a single workday.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides purified Fc-fusion proteins suitable for binding and functional screening assays.
- Operational Value: Uses commercially available reagents and standard lab equipment (syringe pumps, dialysis units, flow cytometers).
- Scalability: Workflow adapts to various Fc-expressing proteins, including antibodies, for platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains protein integrity for characterization via flow cytometry and western blotting, supporting mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enables rapid transition from discovery to preclinical evaluation by minimizing purification bottlenecks.
- Translational Continuity: Purified material can be used in disease-relevant systems to assess target engagement and pathway modulation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, positioning purified Fc-fusion proteins for lead identification and preclinical validation by delivering quantifiable, functional material quickly.
- Discovery Biology: Supports target validation through rapid isolation and Fc-specific quantification using western blot standards.
- Screening: Delivers reproducible, quantifiable outputs via flow cytometry and western blot for compound or variant evaluation.
- Analytics: Enables linear regression-based quantification from Fc standards, adjusting for molecular weight differences to ensure accuracy.
- Translational Research: Purified Gal-1hFc retained functional activity, as shown by flow cytometry, supporting use in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Protocol is adaptable to other Fc-fusion proteins, promoting standardization across projects and teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through Fc-specific quantification and functional verification.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and reduced processing time increase lab throughput.
- Strategic Value: Faster go/no-go decisions by reducing biological de-risking timelines.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization by providing timely, quality-controlled material for assessment.
Implementation Considerations
- Technical staff training on membrane absorber assembly and flow rate control.
- Access to syringe pumps, ultrafiltration units, dialysis cassettes, flow cytometers, and western blot equipment.
- Requirement for Fc-specific detection reagents (antibodies) and standards for quantification.
- Adaptation considerations for different Fc-fusion proteins regarding elution buffer and molecular weight adjustments.
- Practical limitation: Saturation risk in western blot if protein load exceeds standard curve range, requiring dilution.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:39
Preparation and Loading of Protein A Membrane Adsorber
4:49
Quantify and Characterize Purified Product in an Expedited Western Blotting Procedure
7:00
Results: Characterization of Chimeric Murine Galectin-1 Fused to Human Fc (Gal-1hFc)
10:11
Conclusion
3:36
Eluting, Concentrating, and Dialyzing the Protein
