عزل وتوصيف البروتينات التعبير عن مدينة Chimeric الإنسان باستخدام البروتين A غشاء Adsorbers وسير عمل مبسطة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل وتوصيف البروتينات البشرية الخيمرية التي تعبر عن FC بكفاءة وفاعلية باستخدام بروتين A، وممتصات غشائية، وسير عمل مبسط. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تصفية الطافي الخاص بمزرعة الخلايا باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. وتتمثل الخطوة الثانية في تجميع نظام التدفق وبدء تروية الطافي الخاص بمزرعة الخلايا عبر الممتص الغشائي لبروتين A.

بعد ذلك، يتم استخلاص البروتين المعبر عنه بـ FC البشري من ممتص الغشاء، مع تركيز EIT الناتج عبر الترشيح الفائق، يليه تبادل المنظم عن طريق الديلزة. وتتمثل الخطوات النهائية في استخدام قياس التدفق الخلوي واللطخة الغربية لتحديد جودة وكمية البروتين المركز. وفي النهاية، أظهرت ممتصات غشاء البروتين A، إلى جانب سير عمل مبسط، انخفاضاً في وقت المعالجة وزيادة محتملة في حصيلة البروتين مقارنة بكروماتوغرافيا الألفة التقليدية باستخدام أعمدة البروتين A المعبأة بنظام aro speed.

لذا، فإن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل كروماتوغرافيا الألفة بالأعمدة هي أن الممتص الغشائي يسمح بالحصول على عوائد أعلى من البروتين مع تقليل وقت المعالجة. كما يمكن لاختيار طرق التوصيف المناسبة أن يقلل من وقت المعالجة أيضاً. قم بتجهيز الممتص الغشائي وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، مع التأكد من أن جميع المحاليل المارة تكون في درجة حرارة الغرفة ومفلترة مسبقاً عبر مرشح بمقاس 0.22 micron. للبدء، املأ محقنة سعة 10 milliliter بمحلول PBS أو DPBS المفلتر عبر مرشح بمقاس 0.22 micron وقم بتفريغ أي فقاعات هوائية.

لضمان عدم دخول الهواء مطلقاً إلى ممتص الغشاء، قم بتعطير ممتص الغشاء بمحلول DPBS لإزالة محلول التخزين وموازنته مباشرة قبل الاستخدام. قم بترشيح الرائق الناتج عن زراعة الخلايا مباشرة قبل تعطيره عبر ممتص الغشاء باستخدام وحدة ترشيح معقمة بمسامية 0.22 ميكرون تعمل بالشفري لتعبئة ممتص غشاء البروتين A، ثم اسحب الرائق الناتج عن زراعة الخلايا في حقنة ذات قفل لور (lure lock)، وأفرغ أي فقاعات هوائية لتجميع المواد والمعدات. أولاً، قم بتوصيل الحقنة بمدخل ممتص الغشاء.

قم بتوصيل أنبوب مرن بمخرج الممتص الغشائي إذا لزم الأمر. ضع مرشح سرنجة بمسامية 0.22 micron بين السرنجة والممتص الغشائي. استخدم دورقاً أو زجاجة لتجميع السائل المتدفق من الممتص.

اضبط مضخة الحقنة على معدل التدفق الحجمي المطلوب، مع مراعاة عدم تجاوز معدل التدفق الموصى به من قبل الشركة المصنعة. قم بتروية الرائق الخاص بمزرعة الخلايا عبر الممتص الغشائي مع تجميع التدفق النافذ. أعد ملء الحقنة بالرائق عند الحاجة.

إذا رُغب في ذلك، يمكن اختبار السائل المار للكشف عن وجود البروتين باستخدام قياس التدفق الخلوي (flow cytometry)، أو لطخة ويسترن (western blotting)، أو مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) بناءً على تفضيلات المختبر؛ وعادةً ما يكون من غير الضروري إعادة تدوير السائل المار لاسترداد البروتين من ممتص الغشاء. أولاً، يتم غسل ممتص الغشاء بـ 10 milliliters من DPBS لإزالة أي بروتين غير مرتبط. ثم يُستخلص البروتين من ممتص الغشاء بمعدل التدفق المطلوب.

استخدم 10 إلى 15 milliliters من محلول الشطف. اجمع EIT في أنبوب يحتوي على محلول معادلة بنسبة 10% من حجم الشطف. بعد شطف البروتين، قم بتجديد الغشاء الممتص وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة.

املأ ممتص الغشاء بـ 20% ethanol في DPBS للتخزين طويل الأمد عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. ضع جميع EIT في وحدة ترشيح طاردة مركزية بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10 kilodalton.

اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإجراء عملية الديلزة بالمركز الفراغي. يتم استبقاء المادة المحتجزة في وحدة ديلزة ذات حجم صغير بحد قطع للوزن الجزيئي يبلغ 10 kilodalton مقابل المنظم المختار، وقد يلزم إضافة المنظم إلى المادة التي خضعت للديلزة.

إذا كان هناك قلق بشأن ترسيب البروتين، فقم بفصل البروتين المنقى ومعايير FC على الهلام المختار بواسطة تقنية SDS page في ظروف مختزلة أو غير مختزلة حسب الرغبة. استخدم هلاماً صغيراً (mini gel) بدلاً من هلام كبير لتقليل وقت التشغيل؛ وقم بتحميل كميات متعددة من عينات البروتين المنقى، بما في ذلك العينات المخففة بـ DPBS، لضمان وقوع إشارات حزم البروتين المنقى ضمن النطاق الخطي لإشارات معايير FC. وفي تحليل الصور بعد الفصل على الهلام، انقل البروتينات من الهلام إلى غشاء poly olaine fluoride في نظام درئة غير مستمر باستخدام جهاز لطخة شبه جاف (semi-dry blotter) وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة؛ وعادة ما يستغرق وقت النقل من 5 إلى 10 دقائق.

يتم صبغ الهلام بصبغة كوماسي (Kumasi) بعد عملية النقل للتحقق من كفاءة النقل. يتم إجراء لطخة مناعية باستخدام أجسام مضادة لـ FC أو أجسام مضادة لـ IgG مقترنة بالفوسفاتاز القلوي أو بيروكسيداز الفجل باستخدام نظام كشف البروتين بمساعدة الفراغ. وعادة ما يكون وقت اللطخة المناعية أقل من ساعة واحدة.

قم بتطوير لطخة المناعة (immuno blot) باستخدام الركيزة والطريقة المختارة. قم بتقدير كمية البروتين المنقى عن طريق تحليل الصور. أجِر تحليل انحدار خطي على إشارات النطاقات من معايير FC.

إذا كانت قيمة R squared أكبر من 0.90، فاستخدم معادلة الخط المستقيم لحساب كمية البروتين من إشارة النطاق الخاص به مع مراعاة تخفيف العينة إذا لزم الأمر. وبما أن تقدير كمية البروتين يتم على أساس fc، فقم بتعديل القيمة وفقاً للاختلافات في الوزن الجزيئي بين البروتين و fc. أما إذا كانت قيمة R squared أقل من 0.90، فيجب تكرار إجراء لطخة وسترن السريعة.

أخيراً، قم بالتحقق من صحة البروتين باستخدام مقايسات وظيفية أو طرق للكشف عن FC عبر قياس التدفق الخلوي. استُخدم لطخة ويسترن أو قياس التدفق الخلوي بتقنية EISA لاختبار وجود GAL one HFC وظيفي في السائل الطافي للمزرعة الخلوية الأولية، كما يشير المدرج التكراري الأزرق؛ حيث استُخدم وسط المزرعة الخلوية الطازج، الموضح هنا باللون الأحمر، كعنصر تحكم سلبي، ويتداخل معه باللون الأخضر المدرج التكراري لتدفق السوائل (flow through)، مما يشير إلى أن الممتص الغشائي قد التقط GAL one HFC واحتجزها بكفاءة. تم استخلاص gal one HFC من الممتص الغشائي بزيادات قدرها 1 mL وبمعدل 1 mL/min باستخدام محلول منظم حمضي قائم على الأمين، واختُبرت أجزاء الاستخلاص المعاد تعادلها لاحقاً للكشف عن وجود GG one HFC وظيفي باستخدام قياس التدفق الخلوي. زادت إشارة GL one HFC تدريجياً من جزء الاستخلاص الأول (elucian 1)، الذي كان مساوياً تقريباً لعنصر التحكم السلبي، وصولاً إلى الحد الأقصى عند EEU 3، ثم انخفضت إلى مستوى ثابت تقريباً عند جزئي الاستخلاص التاسع والعاشر.

لم تصل قيمة EEU 10 النهائية إلى مستوى التكافؤ مع إشارة الضابط السلبي بسبب بعض الاحتفاظ بالممتز في ads، وتم إجراء تقدير كمي وتوصيف لـ GL one HFC المُنقى من خلال إجراء لطخة ويسترن تم تسريعه بواسطة النقل شبه الجاف واللطخ المناعي بمساعدة الفراغ. ومن خلال مقارنة إشارة GA one HFC بمعايير التقدير الكمي لـ HFC، تم تحديد كل من كمية وجودة المادة المُنقاة.

كانت إشارات GAL one HFC وإشارات GAL one HFC المتدهورة ضمن نطاق المعايير. وكانت كثافة إشارات نطاقات HFC المعيارية مرتبطة خطياً بكمية HFC الموجودة. وتم تحديد تركيز GAL one HFC المنقى بناءً على HFC ليكون 450 micrograms per milliliter من خلال معالجة الصور.

التعديل وفقاً للوزن الجزيئي لـ G one HFC. كان تركيز المادة المنقاة 720 µg/mL. وفي المقابل، تم تحميل كمية زائدة من GAL one HFC المنقى في المسارين السادس والسابع من لطخة ويسترن الموضحة هنا، مما أدى إلى توليد إشارات تشبعت أو تجاوزت نطاق معايير HFC، وهو ما حال دون إمكانية التحديد الكمي.

يمكن أن يعمل صبغ الهلام بصبغة كوماسي كبديل لتقنية لطخة ويسترن كطريقة سريعة لمراقبة الجودة و/أو للتقدير الكمي. لاحظ وجود حزمة عند 10 kilodaltons تقريباً بالإضافة إلى حزم عند 25 kilodaltons و 40 kilodaltons تقريباً في عينة GAL one HFC المتحللة. تمثل هذه الحزمة بروتين GAL one HFC متحللاً لم يتفاعل مع الجسم المضاد الكاشف المستخدم في لطخات ويسترن.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل البروتينات البشرية الخيمرية التي تعبر عن FC باستخدام ممتصات غشائية، وكيفية توصيف تلك البروتينات في غضون أربع ساعات فقط.