طريقة لدراسة تأثير كيميائيا التي يسببها الفشل المبيض على القدرة على ممارسة الرياضة والقلب التكيف في الفئران

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسريع العملية الطبيعية لرتق الجريبات في المبيضين، مما يؤدي بالتالي إلى فشل المبيض، ونضوب الإستروجين، وتوقف الدورة النزوية لدى الأنثى، وهي حالة تحاكي بشكل وثيق مرحلة سن اليأس. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إعطاء المادة الكيميائية المهنية vinyl cycline dioxide أو VCD لمدة تتراوح من 15 إلى 20 يوماً متتالية، والتي ثبت أنها تستهدف وتدمر تحديداً الجريبات المبيضية الأولية والبدائية الصغيرة عن طريق تسريع عملية الرتق الطبيعية الخاصة بها. وتتمثل الخطوة الثانية في تحديد الدورة الإستروجينية ودورية المبيض عن طريق علم الخلايا المهبلي، وذلك بدءاً من حوالي ستة أسابيع بعد بدء حقن VCD.

يجب ملاحظة وجود حالة من الثبات في مرحلة الديسترس (dste) أو عدم حدوث الدورة النزوية لمدة تتراوح بين 15 إلى 20 يوماً عن طريق علم الخلايا المهبلي للتأكد من فقدان الدورة النزوية وفشل المبيض. وتتمثل الخطوة النهائية في تنفيذ تدخل قد يتأثر بانقطاع الطمث أو المرحلة الانتقالية إليه، مثل التمرين الطوعي على عجلة القفص، والتكيف القلبي. وفي نهاية المطاف، يُستخدم النشاط الطوعي على عجلة القفص والتكيف القلبي لتبيان ما إذا كان انقطاع الطمث يؤدي إلى تقليل النشاط على عجلة القفص.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل استئصال المبيض، في أن الاستئصال هو إجراء جراحي يؤدي إلى نضوب مفاجئ في الإستروجين، وهو ما يختلف عن الفقدان التدريجي الطبيعي للإستروجين الذي يحدث أثناء الانتقال من مرحلة ما قبل انقطاع الطمث إلى ما بعد انقطاع الطمث. وتمتد آثار هذه التقنية إلى علاج الأمراض الأيضية وأمراض القلب والأوعية الدموية لدى النساء في مرحلة ما بعد انقطاع الطمث، لأن النساء في هذه المرحلة يكنّ أكثر عرضة للمتلازمة الأيضية والمراضة المشتركة المرتبطة بها، بما في ذلك أمراض القلب والأوعية الدموية، مقارنة بالنساء في مرحلة ما قبل انقطاع الطمث. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً حاسماً لأن خطوات علم الخلايا المهبلية صعبة التعلم، حيث يجب توخي الحذر لتنفيذ تقنية المسحة الصحيحة وتحديد دورة EST.

رابعاً، يُخزن ثنائي أكسيد الفينيل سيكلين (VCD) عند درجة حرارة -20 °C. لتحضير VCD لبروتوكول الحقن، أضف 0.587 milliliters من VCD إلى قارورة معايرة نظيفة، وأكمل الحجم النهائي إلى 10 milliliters باستخدام زيت السمسم، ثم غطِّ القارورة وأغلقها بإحكام بـ param وامزج المحلول عن طريق القلب بلطف. يُخزن عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى سبعة أيام.

لبدء بروتوكول حقن VCD، يتم وزن فأرين في عمر شهرين لمدة 20 يوماً متتالية، وتُعطى حقن يومية داخل الصفاق من VCD بدرجة حرارة الغرفة بجرعة 160 milligrams per kilogram، باستخدام إبرة قياس 27 خلال فترة الحقن. يُراعى التناوب بين مواقع الحقن لتقليل فرص حدوث عدوى موضعية بطريقة مماثلة. أما الفئران الضابطة، فتُحقن بمحلول الناقل زيت السمسم بحجم 2.5 milliliters per kilogram بعد اكتمال فترة الحقن.

راقب دورة الشبق يومياً عن طريق أخذ مسحات مهبلية. يُعد الحصول على مسحات مهبلية عالية الجودة لتحديد الخصائص الخلوية أحد العوامل الحاسمة لنجاح هذه الدراسة. قم بتقييد الفئران باستخدام طريقة الإمساك من منطقة الرقبة من الناحية الظهرية.

أدخل قطارة تحتوي على 0.2 milliliters من المحلول الملحي المعقم في فتحة المهبل حتى عمق 0.5 centimeters. قم بخلط المحلول الملحي المحقون ثلاث مرات باستخدام القطارة، ثم ضع قطرة واحدة على شريحة فارغة. قم بتقييم كل عينة فوراً تحت المجهر باستخدام مجهر ضوئي قياسي بقوة تكبير 100 x للتحقق من حدوث فشل المبيض.

بعد ذلك، تُستخدم الفئران التي أحدث لها VCD سن يأس في تجارب التمارين الرياضية. يتكون جهاز عجلة القفص من عجلة بقطر 11.5 centimeter مع سطح جري بعرض خمسة centimeter ومزودة بعداد مغناطيسي رقمي يتم تفعيله بواسطة دوران العجلة. قبل كل عملية جري على العجلة، يتم معايرة عجلة القفص وفقًا لإرشادات الشركة المصنعة.

قم بقياس القطر الداخلي لعجلة الجري. احسب المحيط وأدخل هذه القيمة في العداد الرقمي كحجم للعجلة؛ لتركيب العجلة في القفص، قم بتمرير حامل العجلة عبر الأسلاك العلوية لقفص الحيوان.

ثبّت حامل العجلة بأسلاك القفص باستخدام مشابك الورق. يجب أن تكون المشابك في الجزء العلوي من الأسلاك بعيداً عن الحيوان. مرر الجزء الخاص بالكمبيوتر وأي كابلات إضافية عبر أسلاك القفص.

ضع كابل الكمبيوتر الزائد بعيداً عن متناول الحيوان. يمكن تحقيق ذلك بوضع طبق وزن بلاستيكي متوسط الحجم فوق أسلاك القفص لتثبيت كابل الكمبيوتر الزائد. بعد ذلك، قم بتثبيت جزء الكمبيوتر من العداد المغناطيسي الرقمي بحامل العجلة.

باستخدام شريط لاصق، قم بتثبيت المغناطيس الحر للمعداد المغناطيسي الرقمي على القضيب المركزي في نفس جانب كابل المغناطيس المتصل بجهاز الكمبيوتر. ومرة أخرى، استخدم كمية كافية من الشريط اللاصق لحماية المغناطيس من التلف الناتج عن القرض. يجب وضع المغناطيس بحيث يتم تسجيل كل دورة للعجلة بواسطة الكمبيوتر دون أي تداخل أو مقاومة تعيق الدوران الكامل للعجلة.

قم بتثبيت عجلة الجري في العجلة. قم بتركيب حامل العجلة عن طريق إدخال قوائم الحامل في فتحات التثبيت الموجودة على القضبان المركزية للعجلة. تأكد من قدرة العجلة على الدوران بحرية.

يجب مراقبة التجهيزات يومياً للتأكد من عدم وجود تلف ناتج عن القرض، وإصلاحها حسب الضرورة. بالنسبة للتجربة، يتم توزيع إناث الفئران من سلالة C 57, black six و B six C3 F1 ذات السبعة أشهر من بطن واحدة عشوائياً إما على نظام التمارين الرياضية أو مجموعة التحكم الخاملة. تُسكن الحيوانات التجريبية بشكل فردي في أقفاص بأبعاد 47 × 26 × 14.5 سنتيمتر، مع إتاحة الوصول غير المقيد إلى عجلة الجري لمدة 28 يوماً، بينما تُسكن حيوانات مجموعة التحكم معاً في قفص بدون عجلة.

يتم توفير الماء وعلف القوارض القياسي الصلب لجميع الحيوانات. يتم إضافة lido وتسجيل القيم اليومية يدوياً للمسافة المقطوعة وإجمالي الوقت المستغرق في الجري كما يحددها العداد المغناطيسي؛ مع تسجيل قيم المسافة والوقت ضمن الإطار الزمني نفسه (ساعة واحدة) يومياً لضمان الحصول على قيم دقيقة ومتسقة طوال فترة التمرين التي تستمر لمدة 28 يوماً. وبعد الانتهاء من التسجيل اليومي، يتم تصفير العداد المغناطيسي لضمان دقة القراءات في اليوم التالي.

في نهاية فترة التمرين المحددة، يتم تسجيل أوزان الجسم للحيوانات التي تم قتلها رحيمًا قبل جمع الأنسجة. لاستخراج القلب، قم بعمل شق إنسي في الجانب البطني، وافتح الحجاب الحاجز لمعاينة القلب بسرعة. استأصل القلب من القاعدة وضعه في محلول ملحي منظم بالفوسفات البارد لغسل الدم المتبقي في البطين بشكل كافٍ. قم بتقليم الأنسجة الزائدة من القلب، وزِن القلب كاملاً، ثم قم بتجميده السريع في النيتروجين السائل إذا لزم الأمر.

اجمع أنسجة إضافية من الاستئصال واغسلها بمحلول ملحي منظم بالفوسفات معدل ومبرد بالثلج، ثم قم بالتجميد السريع في مادة isop pentane المبردة بالنيتروجين السائل. في هذه الدراسة، تم تحفيز فشل المبيض عن طريق المعالجة بـ VCD وتم تأكيده من خلال الفحص المجهري لمسحات مهبلية. يتم تحديد المرحلة في الدورة الاستروسية بناءً على نسبة الخلايا الظهارية، والخلايا الظهارية المكممة وكريات الدم البيضاء؛ وفي مرحلة PROEs تسود الخلايا الظهارية ذات النواة.

تشير الأسهم هنا إلى الخلايا المنواة خلال مرحلة الشبق، بينما تكون الخلايا في الغالب خلايا طلائية حرشفية غير منواة وتم قياسها كمياً. تتميز مرحلة ما بعد الشبق بمزيج من أنواع الخلايا مع غلبة الكريات البيضاء. أما مرحلة الشكّ فتهيمن عليها الكريات البيضاء.

عادة ما تستمر دورة الشبق في الفئران لمدة أربعة أيام قبل حقن VCD. وتعتبر الحيوانات غير دورية بعد 15 يوماً من حالة الشباك المستمرة. يوضح هذا الشكل متوسط طول دورة الشبق بالأيام في المجموعات التي حُقنت بالمادة الحاملة وتلك التي حُقنت بـ VCD.

تُقاس الدورة الواحدة من اليوم الأول في مرحلة الشبق (ES) حتى اليوم الأول من الدورة التالية. بدأت دراسة السيتولوجيا المهبلية في مرحلة الشبق بعد ستة أسابيع تقريبًا من بدء الحقن. ولوحظ أن دورات الشبق لدى الحيوانات المحقونة بـ VCD أصبحت غير منتظمة مقارنة بالحيوانات المحقونة بالمادة الحاملة، وبعد 12 دورة شبق، لم تعد السيتولوجيا لجميع الحيوانات المحقونة بـ VCD تشير إلى حدوث دورات عند اكتمال بروتوكول حقن VCD، كما كشف صبغ H and e للمقاطع العرضية لأنسجة المبيض عن ضمور ملحوظ في أنسجة المبيض المعالجة بـ VCD مقارنة بمجموعات الضبط.

عند الفحص بتكبير 20x ثم بتكبير 200x، لوحظ استنفاد كامل للجريبات الأولية والبدائية في الأنسجة المعالجة بـ VCD. وبخلاف الأنسجة المعالجة بالمادة الحاملة، تم اختبار تأثير الفشل المبيضي الناجم عن VCD على الأداء البدني في فئران تبلغ من العمر سبعة أشهر من سلالتين، عولجت بـ VCD أو بالمادة الحاملة؛ حيث سُجلت قيم تمرين عجلة القفص اليومية من حيث الوقت والمسافة لكل حيوان ممارس للتمرين طوال فترة تمرين استمرت أربعة أسابيع. يوضح هذا الشكل المتوسطات الأسبوعية لقيم الجري اليومية للمسافة، والوقت، والسرعة.

بالنسبة للفئران من سلالة C 57, black six التي عولجت إما بالمركبة (vehicle) أو بـ VCD، لم تُلاحظ فروق ذات دلالة إحصائية في أداء التمارين الرياضية المقاس بمتوسط مسافة الجري اليومية والوقت الذي تقضيه الفئران على العجلة بين المجموعات المعالجة بـ VCD والمجموعات المعالجة بالمركبة، سواء في سلالة C 57, black six أو سلالة B six C3 F1 mouse. يشير هذا إلى أن تأثير فشل المبيض الناجم عن VCD على التمارين التطوعية باستخدام عجلة القفص يتجاوز سلالتين من الفئران على الأقل بعد انتهاء مدة بروتوكول التمارين التطوعية في القفص. تم تسجيل القياسات المورفومترية للجسم، كما تم استئصال القلوب بسرعة ووزنها بما يتفق مع الملاحظات السابقة.

لُوحظ تضخم في القلب استجابةً لتمرين عجلة القفص، والذي تم قياسه من خلال وزن القلب المطلق ووزن القلب المعياري بالنسبة لطول عظمة الظنبوب. وعلى الرغم من أن كتلة القلب المطلقة ونسبة وزن القلب إلى طول عظمة الظنبوب كانت أكبر بشكل ملحوظ في الفئران المعالجة بالمركبة و VCD مقارنة بنظيراتها الخاملة، إلا أنه لم تكن هناك فروق ملموسة في تضخم القلب بين مجموعة الضبط ومجموعة الفشل المبيضي المستحث بواسطة VCD. وفي الختام، خضعت الفئران التي مارست تمرين عجلة القفص الطوعي، من المجموعات المعالجة بـ VCD والمركبة، للجري القسري على جهاز المشي لتحديد قدرات التمرين ذات الكثافة العالية والمنخفضة.

في بروتوكول الكثافة العالية، تمت زيادة متوسط سرعة الحزام تدريجياً كل 10 دقائق حتى تظهر على الفئران علامات الإجهاد. وبلغ متوسط السرعة القصوى للفئران التي عولجت بالمادة الحاملة 26.7 ± 0.95 متراً في الدقيقة، بينما بلغت السرعة القصوى للفئران التي عولجت بـ VCD نحو 28 ± 1.4 متراً في الدقيقة قبل حدوث الإجهاد. واستُخدم الجري بكثافة منخفضة عند سرعة 20 متراً في الدقيقة لتقييم قدرة التحمل.

بلغ متوسط الوقت الأقصى للفئران المعاملة بالمركبة الحاملة 28.3 ± 1.3 دقيقة، بينما بلغ الوقت الأقصى للفئران المعاملة بـ VCD نحو 29.7 ± 1.4 دقيقة قبل حدوث الإنهاك. ولم يتم العثور على فروق ذات دلالة إحصائية في القدرة على ممارسة التمرين بكثافة عالية أو منخفضة بين المجموعات المعاملة بالمركبة الحاملة وتلك المعاملة بـ VCD، مما يشير إلى أن الفشل المبيضي المستحث بواسطة VCD لم يكن له تأثير على القدرة التمرينيه للفئران. وبعد تطويرها، مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات العلوم الخلوية والجزيئية والفيزيولوجية لاستكشاف دور سن اليأس في القوارض.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء حقن VCD بشكل صحيح، وتنفيذ الفحص الخلوي المهبلي، وتطبيق التدخل الفسيولوجي.