تحسين ثقافة خلايا الورم الدبقي عالية الجودة من العينات الجراحية لاستخدامها في النماذج الحيوانية ذات الصلة سريريا والكيمياء المناعية ثلاثية الأبعاد

الهدف العام من هذا الإجراء هو تطوير المجال العصبي الروتيني ، وزراعة الأورام النجمية عالية الجودة والتوسع على نطاق واسع للخلايا السرطانية للدراسات قبل السريرية. يتم تحقيق ذلك عن طريق فصل عينات الورم الطازجة أولا بشكل حاد وفصل الخلايا المفردة عن خلايا الدم الحمراء والحطام. في الخطوة الثانية ، يتم زراعة الخلايا السرطانية في مجال الخلايا العصبية ، وهي متوسطة مكملة بعوامل النمو حتى يتم ملاحظة المجالات العصبية.

يمكن استزراع المجالات العصبية للتجارب في الجسم الحي والتوصيف الجزيئي أو رسمية وثابتة ومدمجة في البارافين للتوصيف المناعي. في النهاية ، يمكن تقييم تكوين الورم التقويمي ذاتي التجديد على المدى الطويل والتنميط الجزيئي لثقافات المجال العصبي. الميزة الرئيسية على الطرق الحالية مثل مزارع مصل FBS طويلة الأمد 10٪ هي أن هذه التقنية تحافظ على الخصائص الجزيئية والوراثية للورم الأصلي.

تتيح هذه الطريقة إنشاء بنك أورام حي لتوليد مزارع خلايا الورم الأرومي الدبقي الخاصة بالمريض والنماذج الحيوانية للأبحاث ذات الصلة سريريا. الآثار المترتبة على هذا النموذج على الاختبارات العلاجية للمرضى الذين يعانون من الورم الدبقي الخبيث واضحة. يمثل النموذج عن كثب الورم الأساسي ويسمح بالاختبار العلاجي في بيئة ما قبل السريرية.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للأورام الدبقية عالية الدرجة ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على الأورام البشرية والحيوانية الأخرى. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأنها تتطلب تقنيات ورعاية معقمة مناسبة وخطوات متعددة لصالح بقاء الخلية على المدى الطويل. خطرت لنا لأول مرة فكرة طريقة الأنسجة ثلاثية الأبعاد بسبب التوطين الفائق للبروتينات المصنفة والأقسام فيما يتعلق بالطرق الأكثر شيوعا لوضع العلامات وتصوير المجالات العصبية بأكملها أو فصل الخلايا.

يعد العرض المرئي لطريقة الأنسجة هذه أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات التثبيت والمسح والمعالجة والتضمين. هناك حاجة إلى عناية للتأكد من أن جميع المجالات العصبية تتعرض بشكل كاف للكواشف ومعالجتها بالتساوي ، مما يعطي أفضل حبيبات متاحة للمورفولوجيا والكيمياء المناعية. بدءا من 200 إلى 500 ملليغرام من عينة الورم، استخدم شفرة مشرط لفرم الأنسجة.

انقل القطع إلى أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 10 مل من الوسط ، ثم اقلب التعليق عدة مرات لخلط محلول الأنسجة. دع قطع الورم تترسب بالجاذبية ثم قم بإزالة الوسط. استمر في غسل الحطام من قطع الورم حتى يختفي الوسط من التورة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الوسيط. أضف ملليلترين من محلول تفكك الأنسجة الأنزيمية لكل 0.5 جرام من عينة الورم المختلطة واخلط المحلول برفق عن طريق الانعكاس. احتضان محلول الأنسجة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة تحت الدوران.

بعد 30 دقيقة ، قم بتصنيف التعليق ثلاثي باستخدام ماصة ملليلتر. عندما يتم هضم الورم إلى معلق خلية واحدة في الغالب، أوقف الإنزيمات بحجمين من محلول التوقف واخلط معلق الخلية بماصة مصلية سعة خمسة ملليلتر. الآن قم بتصفية أي مادة غير مهضومة من خلال مصفاة خلية 40 ميكرومتر وحبيبات الخلايا لمدة خمس دقائق عند 800 مرة G ودرجة حرارة الغرفة.

ثم بعد ثلاث غسلات في 10 ملليلتر من الوسائط ، قم بتعليق بيليه الخلية النهائية في خمسة ملليلتر من الوسائط. ضع طبقة ببطء من تعليق الخلية هذا على خمسة ملليلتر من الضوء الليمفاوي M ، ثم افصل مجموعات الخلايا لمدة 20 دقيقة عند 1300 مرة جم ودرجة حرارة الغرفة. الآن اجمع طبقة الواجهة التي تحتوي على الخلايا المنواة في أنبوب سعة 15 مليلتر يحتوي على 10 ملليلتر من الوسائط.

ثم أعد تعليق الخلايا في وسط المجال العصبي المكملة بعوامل النمو ، وقم بصفيحتها في أقل من مرة واحدة في 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر. في قارورة زراعة الأنسجة T 25 غير المنتظمة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة.

انقل المجالات العصبية العائمة التي تتشكل على مدى أسبوع إلى ثلاثة أسابيع إلى قارورة جديدة لفصلها عن الخلايا والحطام المرفقة. لتحليل المجالات العصبية عن طريق كيمياء الهيستو المناعية أولا بيليه المجالات العصبية, ثم الحرص على عدم إزعاج الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية وأضف 10 مل من DPBS إلى الأنبوب.

ثم قم بإزالة DPBS ، وأعد تعليق الحبيبات في فورمين مخزن محايد بنسبة 10٪ واحتضان الخلايا لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد تكوير المنشطات مرة أخرى, إعادة تعليقها في سلسلة من حضانات الإيثانول. بعد حضانة الإيثانول الثانية بنسبة 95٪ ، قم بتعليق PHE بالإيثانول المطلق حتى تصبح الخلايا مشرقة وبيضاء ومكثفة.

بعد ذلك ، اصنع مخروطا صغيرا من ورق العدسة. ضعه في قمع صغير داخل دورق وبلل ورق العدسة بالكحول المطلق. قم بفك الحبيبات قليلا باستخدام الإيثانول الطازج بنسبة 100٪ ثم اسكب الكحول الزائد.

صب الكرات من خلال مخروط ورق العدسة ، وتأكد من ذهابها إلى الحافة وشطف الأنبوب بالإيثانول المطلق الإضافي. صب أي الستيرويد المتبقي من خلال مخروط ورقة العدسة ثم إزالة المخروط من القمع. ثم قم بطي ورق العدسة في مربع ، وتأكد من أن المنشطات مغلقة بشكل آمن قدر الإمكان ، وقم بنقل المجالات العصبية للحزمة إلى شريط كاسيت.

الآن ضع الكاسيت في معالج مناديل أوتوماتيكي وقم بتشغيل المعالج. ثم قم بإزالة الكاسيت وضعه على الجزء الساخن من نظام تضمين البارافين. بعد التأكد من خلو السطح من الشظايا أو الغبار أو الحطام الآخر ، قم بسحب كل البارافين من الملقط في آبار الاحترار.

ثم قم بتسخين زوج نظيف من الملقط الخالي من البارافين وأضف كمية صغيرة من البارافين إلى قالب قاعدة دافئ. الآن قم بإزالة العبوة من الكاسيت وضعها على الجزء الساخن من نظام التضمين. افتح الورقة بحذر حتى تظهر الشفقة.

استخدم الملقط الدافئ لجمع أكبر قدر ممكن من المواد ، ثم انقل الكرويات إلى البارافين السائل في القالب الأساسي. بعناية تفكيك أي كتل ونقل الستيرويد بعيدا عن الزوايا إلى طبقة مركزية موحدة. نقل القالب قاعدة إلى منطقة التبريد لتأمين الستيرويد في مكانه.

أخيرا ، أضيفي الكاسيت واملأه ببطء بالبارافين. بمجرد أن يبرد الكاسيت تماما ، يمكن تقسيم كتلة البارافين في المجال العصبي للكيمياء المناعية كما هو موضح في الجدول. كانت كفاءة هذا البروتوكول في إنشاء ثقافات المجال العصبي طويلة الأمد من 88 ورما تم تشخيصه حديثا و 37 ورما متكررا 41.6٪ مماثلة لكل من الأورام المشخصة حديثا والأورام المتكررة.

بالنسبة لبعض عينات الورم الأرومي الدبقي ، تشكلت المجالات العصبية خلال الأيام القليلة الأولى بينما كانت هناك حاجة إلى وقت أطول للاستزراع بالنسبة للآخرين. لم تعتمد كفاءة تكوين كرة الخلايا العصبية حصريا على مستوى النخر في الأنسجة كما يتضح من نتائج الورم الذي تم تشخيصه حديثا بكثافة خلوية عالية وورم متكرر ونخر تمت معالجته كما هو موضح للتو وينتج عنه مجالات عصبية تختبر الإمكانات السرطانية لكل مجال عصبي. تعد الثقافة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة تأكيدا حاسما على هذا النهج لإثراء الخلايا الجذعية السرطانية.

في هذه التجربة ، تم زرع ثقافتين مختلفتين من الخلايا العصبية للورم الأرومي الدبقي في أدمغة الفئران التي تعاني من نقص المناعة. قدمت أورام الطعم الخارجي خصائص مورفولوجية للأورام الأرومية الدبقية مثل غزو الدماغ والحمة والنخر. هذا في هذه التجربة ، تم استزراع الخلايا التي لم تشكل المجالات العصبية في وسط المجال العصبي المكمل بنسبة 2٪ FBS ، وهو تكوين الورم لهذه الخلايا الوسائط البديلة.

بالمقارنة مع الورم الأرومي الدبقي ، تم تقييم مزارع المجالات العصبية في متلقي الفئران العراة. لا توجد فروق في البقاء على قيد الحياة. لوحظت ديناميكيات نمو الورم أو مورفولوجيا بين طريقتي الاستزراع قبل الزراعة.

في حين أن علامات الخلايا الجذعية العصبية ، بما في ذلك SOX two يتم تنظيمها في معظم خلايا الورم الأرومي الدبقي الأولية المزروعة في خلايا الورم الأرومي الدبقي FBS بنسبة 10٪ المزروعة في وسط الغلاف العصبي ، مع استكمالها بنسبة 2٪ FBS تحتفظ بتعبير SOX الثاني بعد المعالجة كما هو موضح للتو. وفي هذه التجربة ، تم تصنيف المجالات العصبية بالجسم المضاد h و e antiox لإثبات التوطين النووي والجسم المضاد لعامل نمو البشرة لتوضيح توطين غشاء الخلية. كما توضح الصور الناتجة ، تعمل الطريقة الموضحة على تحسين تحليل التعبير عن البروتين والتعديلات اللاحقة للترجمة مع الحفاظ على البنية ثلاثية الأبعاد للمجالات العصبية بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء تقنية تفكك الأنسجة هذه في غضون ساعتين تقريبا إذا تم إجراؤها بشكل صحيح أثناء محاولة الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الفاصل الزمني بين الجراحة والارتباط ، بالإضافة إلى التركيب الجزيئي غير المتجانس للأورام الدبقية عالية الدرجة يمكن أن يؤثر على النتيجة بعد هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الزرع داخل الجمجمة من أجل تلخيص الورم الأصلي في النماذج الحيوانية. تحدث هذه التقنية ثورة في علم الأورام العصبية ، مما يسمح بالاختبار قبل السريري في بيئة ذات صلة سريريا. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير المجالات العصبية طويلة المدى والحفاظ عليها ، وكذلك كيفية إنتاج المجالات العصبية المدمجة في البارافين الرسمية والثابتة للتحليل الجزيئي.

لا تنس أن العمل مع الأنسجة البشرية يمكن أن يكون خطيرا للغاية ، ويجب دائما استخدام الاحتياطات مثل الحماية الشخصية والعوامل المتوافقة والتي يحتمل أن تكون خطرة أثناء تنفيذ هذا الإجراء.