تصور من قبل المناعية المشبك المزدوج اللون التوقيت بوابات-الانبعاث المستحث استنفاد (STED) Nanoscopy

الهدف العام من هذا الإجراء هو تصور هياكل مثل F actin في المشبك اللايتي للخلية NK باستخدام الفحص المجهري TED. يتم تحقيق ذلك عن طريق تلخيص المشبك أولا على الزجاج باستخدام تنشيط الجسم المضاد. الخطوة الثانية من الإجراء هي إصلاح التجعيد وتلطيخ الخلايا للهياكل ذات الأهمية.

بعد ذلك ، يتم تصوير الشرائح عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر للمسح بالليزر ، متبوعا بتطبيق الاستنفاد الثابت لزيادة دقة الصورة. الخطوة الأخيرة هي معالجة الصور باستخدام خوارزمية الالتفاف. في النهاية ، يمكن أن تظهر النتائج دقة أقل من 100 نانومتر للهياكل الخلوية بفضل اللون المزدوج والتنظير الداخلي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال بيولوجيا الخلية ، مثل العلاقة بين الهيكل الخلوي وإفراز الخلايا. في حالتنا ، نحن مهتمون بإفراز الجسيمات الحالة المتخصصة التي تسمى الحبيبات اللايتية بواسطة الخلايا القاتلة الطبيعية. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة لأن هناك العديد من المتغيرات التي يمكن تعديلها في تطبيق ليزر استنفاد TED.

سيؤدي التطبيق غير المناسب لحزمة النضوب إلى تفاقم الدقة بدلا من تحسينها في التحضير ، قم بتسخين 30 مل من وسائط RPMI مع 10٪ FCS وبشكل منفصل. مليلتر واحد من BD CY تأثيرات cyop perm على حد سواء إلى 37 درجة مئوية. ثم ابدأ عملية طلاء زلات الغطاء بالأجسام المضادة.

خذ زلات الغطاء رقم 1.5 واستخدم قلم PAP. اصنع مربعات بحجم عشرة سنتات على زلات الغطاء. قم بإعداد مربع واحد لكل حالة تم اختبارها.

قم بتحميل كل دائرة ب 200 ميكرولتر من الجسم المضاد بمعدل خمسة ميكروغرام لكل مليلتر في PBS. لتنشيط الخلايا NK 92 ، استخدم الأجسام المضادة ل CD 18 والأجسام المضادة ل NK P 30. احتضان زلات الغطاء المحملة عند 37 درجة مئوية لمدة نصف ساعة ، ثم اغسلها بالغمس في درجة حرارة الغرفة PBS على الفور مع إضافة الخلايا لكل حالة تم اختبارها ، يجب أن تكون 500 ، 000 خلية جاهزة للاستخدام.

اغسل الخلايا في 10 مل من وسائط التدفئة ثم أعد تعليقها في نفس الوسائط الدافئة. عند 2.5 مليون خلية لكل مليلتر مع تعليق الخلايا بالكامل ، قم بصب 200 ميكرولتر في كل مربع جسم مضاد على الغطاء ، تحتضن زلات الغطاء مع الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في هذه الحالة. 20 دقيقة هي وقت كاف لاستقطاب الحبيبات في خلايا NK بعد غسل الحضانة ، ينزلق الغطاء برفق في PBS في درجة حرارة الغرفة.

ابدأ بإضافة ميكرولتر من TRITTON X 100 إلى مليلتر من محلول cyto perm الدافئ لتأثيرات BD CY. ثم دوامة. ضع 200 ميكرولتر من هذا المحلول على كل مربع شرط على زلات الغطاء.

ثم ضع الخلايا في الظلام في درجة حرارة الغرفة وانتظر 10 دقائق. عند الانتهاء من الحضانة ، اغسل الغطاء برفق في عازلة تلطيخ. ثم جفف حواف المناطق المحيطة بقطعة قطن.

بعد ذلك ، أضف 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الأساسي في مخزن تلطيخ إلى المناطق المحيطة ، واترك الغطاء ينزلق في الظلام لمدة نصف ساعة. تشمل بعض الأجسام المضادة الثانوية الجيدة للتصوير الثابت Alexa floor 4 و 88 Pacific orange و Horizon V 500. كل من هذه تعمل بشكل جيد عند تخفيف واحد إلى 200.

بعد غسل الحضانة ، ينزلق الغطاء في تلطيخ ، ومخزن مؤقت ، ويجف. كما كان من قبل ، ضع 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي على كل مربع حالة. ثم دعهم يجلسون في الظلام لمدة 30 دقيقة أخرى.

في هذه المرحلة ، من الممكن إضافة أجسام مضادة إضافية بعد الغسيل الإضافي. على سبيل المثال ، يمكن تطبيق Phin عند واحد إلى 200 للكشف عن f actin. بالنسبة لوسيط التركيب ، اختر إطالة الدرع المتجه ، وهو غير متوافق مع الوضع.

إذا تم استخدام تلطيخ الفين ، فتجنب استخدام اثنين من الإيثانول الثيو بينما لا بأس به ، قم الآن بتطبيق 10 إلى 20 ميكرولترا من وسط التركيب على شريحة. مع انزلاق الغطاء مقلوب ، قم بخفضه برفق إلى الوسط ، وتجنب فقاعات الهواء. ثم احتضان الشريحة لمدة 24 ساعة.

باستخدام الغطاء ، انزلق في اليوم التالي ، وأغلق زلة الغطاء بطلاء الأظافر واستمر في التصوير. ابدأ تشغيل الليزر والبرامج. يجب أن يسخن ليزر النضوب الثابت بقوة 100٪ وأن يتم محاذاته.

باستخدام العدسة ، ركز على العينة ، ثم انتقل إلى البرنامج. افحص القناة الأولى ، القناة ذات الطول الموجي الأطول. الطابق الرابع ، قم بتحسين قوة الليزر ، وموضع شعاع الإثارة ، ونطاق الكاشف.

تجنب الإعداد فوق 100. بعد ذلك ، التقط صورة متحدة البؤر وتحقق من البكسل. سيعمل كل من التشبع والخط والإطار على تحسين دقة البكسل.

الهدف هو أن تكون أقل من 30 نانومتر لكل بكسل. بعض التشبع مقبول للمكان. بعد ذلك ، قم بتطبيق شعاع النضوب الثابت بنسبة 50٪ من الطاقة والتقط صورة.

إذا تحسنت الدقة ، فيمكن تطبيق المزيد من الطاقة. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي ضبط طاقة ليزر الإثارة أو متوسط الخط أو الكسب أيضا إلى تحسين الدقة. لتقليل الخلفية ، قم بتطبيق 0.3 نانو ثانية من بوابات الوقت واضبطها لأعلى.

وينبغي تقدير الدقة الجديدة باستخدام حساب الحد الأقصى للعرض بنصف الكامل. بمجرد الرضا ، كرر هذه الخطوات مع القناة الثانية عند تعديل جميع القنوات. تحقق من التداخل الطيفي عن طريق تصوير عناصر التحكم في البقع الفردية مع جميع تسلسلات المسح.

يمكن تصحيح التداخل الخفيف من خلال فك الخلط الطيفي بواسطة البرنامج ولكن من الأفضل تجنبه أو إبقائه عند الحد الأدنى. الآن ، احصل على صور للتصوير الكمي. احصل على ما لا يقل عن 20 صورة لكل حالة وفقا للظروف التجريبية.

لتفويض الصور المحفوظة ، افتح الملفات في البرنامج المناسب. تحقق من معلمات كل قناة ، وتحديدا أطياف الإثارة والقبول ، وانبعاث النضوب الثابت ، واتجاه التصوير. ثم قم بتطبيق حسابات الالتفاف الخاصة بالبرنامج.

عادة ما تكون الإعدادات الافتراضية كافية ، لكن الإشارة إلى الضوضاء ستختلف بين قوة الأرضية ، بحيث يجب تعيين هذه المعلمة يدويا للتجربة. هناك عدد قليل من المزالق الشائعة التي قد تؤدي إلى حل دون المستوى الأمثل بدلا من ذلك. واحد قيد أخذ العينات.

هذا يؤدي إلى التحبب وفقدان معلومات البكسل كما هو الحال في خيوط الأكتين هذه. غالبا ما تؤدي زيادة متوسط الخط أو الإطار إلى معالجة هذه المشكلة. مشكلة أخرى هي التبييض أو الإفراط في أخذ العينات الناجم عن طول البكسل.

قد يكون وقت المكوث عادة بسبب متوسط الخط المفرط على المسح الضوئي قبل الحصول على الصور هو السبب أيضا ويمكن تصحيحه باستخدام مسح أصغر قبل الحصول على الصور أو باستخدام سرعة مسح أعلى. يمكن أن يساعد تقليل طاقة الليزر أيضا في عمل كل شيء. ستتحسن الصورة بشكل كبير.

سيؤدي Deconvolution إلى تحسين الصورة. من الناحيتين الكمية والنوعية. يجب الحصول على دقة أقل من 100 نانومتر بشكل روتيني أثناء محاولة هذا الإجراء.

من المهم أن تتذكر إجراء محاذاة الحزمة الثابتة قبل كل تجربة ومرة واحدة في الساعة تقريبا بعد ذلك باتباع هذا الإجراء. يمكن إجراء طرق أخرى مثل التحليل الكمي من أجل الإجابة على أسئلة إضافية تتعلق بالتموضع والتوطين تحت الخلوي والتفاعلات الجزيئية.