حل غاية intravital المجهري مخطط في الإضاءة مراكز جرمينال

الهدف العام من هذا الإجراء هو تجهيز مجهر فوتوني ثنائي القياس القياسي للتصوير عالي الدقة داخل الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال محاذاة المجهر، والتي تتضمن ضبط أشعة الليزر. بعد ذلك، يتم محاذاة مضاعف الإرسال (beam multiplexer) لتحقيق الشكل المثالي للحزمة وترتيب إضاءة الحزمة.

في حالة المسح متعدد الحزم، يتم الحصول على الصور الخام عن طريق مسح العينة بنمط إضاءة مخطط. وأخيرًا، يُطبق خوارزمية لحساب الصورة النهائية عالية الدقة. وفي نهاية المطاف، يُستخدم مجهر الإضاءة المخططة لإظهار تفاصيل سلوك الجهاز المناعي داخل المراكز الإنتاشية في العقد الليمفاوية للفئران، والتي لم يكن من الممكن الوصول إليها سابقًا باستخدام المجهر الحي.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل الإضاءة المهيكلة أو مجهر التموضع في إمكانية تطبيقها على أعماق كبيرة من الأنسجة في العينات الحية. وهي لا تتطلب أي تعديل في شكل شعاع الليزر، مما يجعل الطريقة بسيطة للغاية وسهلة التنفيذ في أي مجهر متعدد الفوتونات. يظهر هنا الإعداد المستخدم في مجهر الإضاءة المخططة ثنائي الفوتون متعدد الأشعة لتحقيق دقة مثالية وجودة تباين مع أدنى مستوى من التبييض الضوئي وأسرع عملية استحواذ.

ضع في اعتبارك إجراء تعديلات على الإعداد كما هو موضح في البروتوكول النصي. بعد إجراء التعديلات، تحقق من عودة الشعاع إلى المرآة الموجودة مباشرة فوق مرآة الدخول عند نهاية ضاغط النبضات القائم على المنشور. بمجرد ضبط مسار الضوء من هذه النقطة، ينعكس الشعاع إلى مضاعف الأشعة.

في حال إجراء إضاءة مخططة متعددة الحزم، يتم استخدام المجهر متعدد الفوتونات مع إيقاف تشغيل الماسح الضوئي. قم بمحاذاة المرايا في مضاعف الحزم عن طريق وضع عينة ذات فلورة متجانسة على المنصة وتركيز شعاع الليزر داخل العينة، ولكن بالقرب من السطح العلوي، وبجوار العدسة الأمامية للشيئية.

اضبط المجهر على وضع الشعاع المتعدد (multi-beam mode) واختر عدد الأشعة والاستقطاب. على سبيل المثال، للعثور على شعاع الليزر P عن طريق تصوير الشريحة الفلورية، افتح غالق P وقم بتشغيل كاميرا CCD باستمرار أثناء تركيز الشعاع، مع التأكد من وجوده في الموضع المركزي. عند محاذاة الشعاع P، قم بتحويل المفتاح إلى وضع 64 شعاعاً وافتح الغالق المقابل.

تحقق من موضع الشعاع. قم بضبط مرايا مضاعف الشعاع من الأولى إلى الخامسة، مع التأكد من أن بقع الشعاع متباعدة بمسافات متساوية. وبما أن خوارزميات الإضاءة المخططة تعتمد على هذا الافتراض، استبدل العينة ذات الفلورة المنتظمة بعينة ذات بنية غير متجانسة.

على سبيل المثال، يتم أخذ عينة من منطقة جذر Conval ومسح صورة متعددة الحزم. تحقق من أن الصورة تظهر حادة ومنتظمة ومستقيمة. استبدل العينة غير المتجانسة بالعينة المتجانسة.

قم بتشغيل ماسح XY للتحكم في عملية المسح. ولتوليد نمط تحفيز الصورة المخططة للمسح متعدد الحزم، حرك مرآة ماسح Y بشكل عمودي على خط شعاع الإضاءة.

كرر النمط الناتج هنا، والمحدد بعدد الكتل، عن طريق تحريك مرآة الماسح X (والتي تسمى هنا إزاحة الكتلة) لإنشاء صورة مخططة مستطيلة. أعد وضع العينة غير المتجانسة واستخدم الماسح كمشغل رئيسي. قم بمزامنة الكاميرا مع الماسح لالتقاط صورة مخططة وحفظها تلقائياً، وذلك من أجل التقاط صور مخططة بشكل متكرر.

قم بتحريك مرآة ماسح المحور X إلى مواضع مختلفة عن طريق اختيار عدد كافٍ من خطوات التكرار هنا، وعدد الإزاحات وطول الخطوة المناسب هنا. يجب أن تكون خطوة الإزاحة بين صورتين مخططتين متتاليتين كافية لتغطية المسافة بين عرضي شعاعين متتاليين. اضبط إزاحة X على قيمة أقل من حد الدقة الجانبية عند طول الموجة المثير المحدد.

على سبيل المثال، يؤدي استخدام 10 خطوات لمرآة الماسح X لكل إزاحة و12 أو 13 إزاحة إلى تحقيق أفضل دقة مكانية. يتم استخلاص النتائج باستخدام شريحة جذر المنطقة الملتئمة لتحسين هاتين القيمتين حتى تصبح صورة المنطقة الملتئمة أكثر وضوحاً. استخدم أداة المخطط الخطي (line profile tool) على صور CCD التقليدية وصور الإضاءة المخططة المحسوبة.

قارن عرض مقاطع الخطوط، والتي تمثل في هذا المثال الإشارة الفلورية لجدران الخلايا المتماثلة. قم بالتقاط كل صورة مخططة خام بالتزامن مع حركة الماسح الضوئي واحفظها بشكل منفصل، على سبيل المثال، في ملفات TIFF أو ملفات ثنائية. ولإنشاء مصفوفة ثنائية الأبعاد لصورة الإضاءة المخططة عالية الدقة، افتح مجموعة كاملة من الصور المخططة الخام كمصفوفات في روتين التقييم.

استخدم إما خوارزمية الحد الأدنى للأقصى (minimum maximum algorithm) أو خوارزمية قائمة على تحويل فوريه (Fourier transform)، كما تم وصفهما بالتفصيل سابقاً، لإجراء مجهرية فوتونية متعددة، متعددة الحزم، ذات إضاءة مخططة في الأنسجة العميقة. في الكائنات الحية، قم بالتقاط صور مخططة في أعماق أنسجة مختلفة بمرور الوقت وقم بتقييمها كما تم وصف ذلك سابقاً، لإنتاج فيلم ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للتفاعل الديناميكي بين المركز الإنتاشي، وخلايا B، والخلايا التغصنية الجريبية. وتتوافق أبعاد دالة انتشار النقطة الفعالة مع الدقة المكانية للمجهر.

قمنا بقياس هذه الدالة ثلاثية الأبعاد من خلال اكتساب إما إشارة توليد التوافقيات الثانية لألياف الكولاجين أو الإشارة الفلورية لخرزات البوليسترين بحجم 100 نانومتر التي تبعث عند 515 نانومتر في العقد اللمفاوية. وباستخدام نظام T-P-L-S-M ذو الإضاءة المخططة متعددة الأشعة مقارنةً بتقنيات المجهر المسحي بالليزر ثنائي الفوتون المعتمدة، مثل T-P-L-S-M ذو الكشف الميداني بواسطة كاميرات CCD وT-P-L-S-M ذو الكشف النقطي. ومن هذه القياسات، يتضح أنه عند سطح العينة، تتوافق كل من الدقتين الجانبية والمحورية مع القيم المتوقعة التي تنبأت بها نظرية الحيود.

ومع ذلك، ومع زيادة عمق التصوير، وبالتالي زيادة المسار البصري لكل من إشعاعات الاستثارة والانبعاث عبر وسط ذي معاملات انكسار متباينة بشدة، يتدهور الدقة المكانية بشكل كبير بغض النظر عن الإعداد المستخدم. وباستخدام M-B-S-I-T-P-L-S-M بشكل مستقل عن عمق التصوير، حققنا دقة جانبية أفضل بنسبة 20% تقريبًا ودقة محورية أفضل بنسبة 220%، وذلك مقارنةً بنهج T-P-L-S-M القياسية.

يُعد الاختيار النسيل للخلايا البائية خلال الاستجابة المناعية داخل الأعضاء اللمفاوية الثانوية للفئران البالغة الخطوة الأولى في طريق تمايزها إلى خلايا بائية ذاكرة أو خلايا بلازمية. ويُعتقد أن التفاعل الديناميكي للغاية بين الخلايا التغصنية الجريبية والخلايا البائية على مستوى هياكل المعقد المناعي داخل المراكز الإنباتية يلعب دوراً محورياً في هذه العملية. ولا يمكن تحليل هذا التواصل الخلوي وتأثيراته على الاستجابة المناعية -والتي تظهر هنا مميزة بواسطة anti CD 2135 FAB ATO five 90 على الخلايا التغصنية الجريبية- إلا باستخدام تقنية المجهر الحيوي عالي الدقة.

تتيح تقنية M-B-S-I-T-P-L-S-M لأول مرة إمكانية التصوير الحي والقياس الكمي لأبعاد تجمعات ترسبات المعقدات المناعية حتى عمق 120 micron في المراكز الإنتاشية للعقد الليمفاوية الورقية. تُظهر هذه الصور مقارنة مباشرة بين صور الفلورة ثلاثية الأبعاد لترسبات المعقدات المناعية في مركز إنتاشي، كما تم الحصول عليها بواسطة PMT التقليدي وبواسطة M-B-S-I-T-P-L-S-M. علاوة على ذلك، يمكن تمييز تفاعلات ترسبات المعقدات المناعية مع الخلايا البائية في المركز الإنتاشي بدقة عالية، ويمكن الآن استقصاؤها بالاشتراك مع مجسات وظيفية حية لقياس التكاثر، أو التمايز، أو الموت الخلوي المبرمج.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تضع في اعتبارك أنه في التقنية القائمة على الكشف بالكاميرا، تكون سرعة الاستحواذ أعلى بنحو ثماني مرات، بينما يكون الحد الأقصى لعمق التصوير أقل بنسبة 25% تقريبًا مقارنة بما يتم تحقيقه باستخدام المجهر متعدد الفوتونات القياسي القائم على المضاعف الضوئي. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداد المجهر متعدد الطيات للعمل بطريقة الإضاءة المخططة، بما في ذلك ضبط مسار الضوء في المجهر، ومحاذاة شريحة الشعاع، وحساب معاملات المسح، وطرق حساب الصورة النهائية عالية الدقة، وذلك للتجارب العميقة في الأنسجة الحية.