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Highly Resolved Intravital Striped-illumination Microscopy of Germinal Centers

Monitoring cellular communication by intravital deep-tissue multi-photon microscopy is the key for understanding the fate of immune cells within thick ...

Lavision Biotec Gmbh

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Two-photon microscopy is indispensable for deep tissue and intravital imaging. However, current technology based on single-beam point scanning has reached sensitivity and speed limits because higher performance requires higher laser power leading to sample degradation. We utilize a multifocal scanhead splitting a laser beam into a line of 64 foci, allowing sample illumination in real time at full laser power. This technology requires charge-coupled device field detection in contrast to conventional detection by photomultipliers. A comparison of the optical performance of both setups shows functional equivalence in every measurable parameter down to penetration depths of 200 microm, where most actual experiments are executed. The advantage of photomultiplier detection materializes at imaging depths >300 microm because of their better signal/noise ratio, whereas only charge-coupled devices allow real-time detection of rapid processes (here blood flow). We also find that the point-spread function of both devices strongly depends on tissue constitution and penetration depth. However, employment of a depth-corrected point-spread function allows three-dimensional deconvolution of deep-tissue data up to an image quality resembling surface detection.

The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging.

Microscopie &#xE0; deux photons est indispensable pour des tissus en profondeur et de l&#x26;#39;imagerie intravitale. Cependant, la technologie actuelle bas&#xE9;e sur le balayage point de faisceau unique a atteint les limites de sensibilit&#xE9; et de vitesse, car des performances sup&#xE9;rieures n&#xE9;cessite une alimentation plus &#xE9;lev&#xE9;e au laser menant &#xE0; la d&#xE9;gradation de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon. Nous utilisons un fractionnement t&#xEA;te de balayage multifocale un faisceau laser dans une ligne de 64 foyers, ce qui permet &#xE9;clairage de l&#x26;#39;&#xE9;chantillon en temps r&#xE9;el &#xE0; la puissance du laser complet. Cette technologie n&#xE9;cessite &#xE0; couplage de charge dispositif de d&#xE9;tection sur le terrain, contrairement &#xE0; la d&#xE9;tection conventionnelle par des photomultiplicateurs. Une comparaison de la performance optique des deux configurations montre l&#x26;#39;&#xE9;quivalence fonctionnelle dans tous les param&#xE8;tre mesurable jusqu&#x26;#39;&#xE0; des profondeurs de p&#xE9;n&#xE9;tration de 200 microm, o&#xF9; la plupart des exp&#xE9;riences r&#xE9;elles sont ex&#xE9;cut&#xE9;es. L&#x26;#39;avantage de la d&#xE9;tection photomultiplicateur mat&#xE9;rialise &#xE0; des profondeurs sup&#xE9;rieures &#xE0; 300 Microm imagerie en raison de mieux leur rapport signal / bruit, alors que seulement &#xE0; couplage de charge dispositifs permettent en temps r&#xE9;el de d&#xE9;tection des processus rapides (ici le flux sanguin). Nous constatons &#xE9;galement que la fonction de point de propagation de ces deux dispositifs d&#xE9;pend fortement de la constitution des tissus et la profondeur de p&#xE9;n&#xE9;tration. Cependant, l&#x26;#39;emploi d&#x26;#39;une profondeur corrig&#xE9;e point propagation fonction permet en trois dimensions de la d&#xE9;convolution des tissus profonds de donn&#xE9;es jusqu&#x26;#39;&#xE0; une d&#xE9;tection d&#x26;#39;image de qualit&#xE9; de surface ressemblant.

Le pouvoir de la simple et multifaisceaux microscopie &#xE0; deux photons &#xE0; haute r&#xE9;solution et haute vitesse Deep Tissue et imagerie intravitale

Zwei-Photonen-Mikroskopie ist unverzichtbar f&uuml;r tiefes Gewebe und intravital Bildgebung. Jedoch hat aktuelle Technologie basierend auf Einstrahl-Punkt Scannen Empfindlichkeit und Geschwindigkeitsbegrenzungen erreicht weil h&ouml;herer Leistung erfordert h&ouml;here Laserleistung f&uuml;hrt zu einer Verringerung der Probe. Wir nutzen eine multifokale Scanhead Aufteilung eines Laserstrahls in eine Reihe von 64 Herde, so dass Beispiel Beleuchtung in Echtzeit mit voller Laserleistung. Diese Technologie erfordert Charge - Coupled Device Feld Erkennung im Gegensatz zu konventionellen Erkennung durch Photomultiplier. Ein Vergleich der optischen Leistung der beiden Setups zeigt funktionale &Auml;quivalenz in jede messbare Parameter bis auf Durchdringung Tiefen von 200 Microm, wo die meisten tats&auml;chlichen Experimente ausgef&uuml;hrt werden. Der Vorteil der Photomultiplier Erkennung materialisiert Imaging tiefen &gt; 300 Microm wegen ihrer besseren Signal/Rausch-Verh&auml;ltnis, nur kostenlos &ndash; Coupled Devices Echtzeiterkennung von schnelle Prozesse erm&ouml;glichen (hier blood Flow). Wir finden auch, dass die Point-Spread-Funktion beider Ger&auml;te Verfassung und Penetration Tiefe Gewebe stark abh&auml;ngig. Besch&auml;ftigung einer Tiefe korrigierte Point-Spread-Funktion kann jedoch dreidimensionale Entwindung der tiefen Gewebe Daten bis eine Bildqualit&auml;t, die &auml;hnlich der Oberfl&auml;che erkennen.

Die Macht des einzelnen und Mehrstrahl-zwei-Photonen-Mikroskopie f&uuml;r hochaufl&ouml;sende und Hochgeschwindigkeits-Tiefe Gewebe und intravital Bildgebung.

Microscopia del due-fotone &egrave; indispensabile per il tessuto profondo e imaging intravital. Tuttavia, l&#39;attuale tecnologia basata sul punto di singolo fascio di scansione ha raggiunto sensibilit&agrave; e limiti di velocit&agrave; perch&eacute; prestazioni superiori richiede maggiore potenza del laser che porta alla degradazione del campione. Utilizziamo un scanhead multifocale spaccare un fascio laser in una linea di 64 foci, permettendo l&#39;illuminazione del campione in tempo reale a piena potenza. Questa tecnologia richiede rilevazione campo charge - coupled device in contrasto con rilevazione convenzionali di fotomoltiplicatori. Un confronto tra le prestazioni ottiche dei due configurazioni Mostra equivalenza funzionale in ogni parametro misurabile fino a profondit&agrave; di penetrazione di 200 microm, dove vengono eseguiti molti esperimenti reali. Il vantaggio del fotomoltiplicatore rilevazione si materializza a profondit&agrave; di imaging &amp;gt; 300 microm a causa della loro migliore rapporto segnale/rumore, considerando che solo carica &ndash; coupled dispositivi consentono la rilevazione in tempo reale dei processi rapidi (qui il flusso di sangue). Troviamo anche che la funzione di punto di diffusione di entrambi i dispositivi dipende fortemente dalla profondit&agrave; di costituzione e la penetrazione dei tessuti. Tuttavia, occupazione di una funzione di punto di diffusione corretta profondit&agrave; permette di deconvoluzione tridimensionale dei tessuti profondi dati fino a una qualit&agrave; d&#39;immagine simile a rilevamento di superficie.

Il potere della microscopia due-fotone singolo e multi-fascio per imaging intravital e profondo del tessuto ad alta risoluzione e ad alta velocit&agrave;.

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&#xB450; &#xAD11;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; intravital &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xAE4A;&#xC740; &#xC870;&#xC9C1;&#xC774; &#xBD88;&#xAC00;&#xACB0; &#xC774;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xD604;&#xC7AC; &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBE54; &#xD3EC;&#xC778;&#xD2B8; &#xAC80;&#xC0C9; &#xAE30;&#xBC18; &#xACE0;&#xC131;&#xB2A5; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC800;&#xD558;&#xB85C; &#xC774;&#xC5B4;&#xC9C0;&#xB294; &#xB192;&#xC740; &#xB808;&#xC774;&#xC800; &#xD30C;&#xC6CC;&#xB97C; &#xC694;&#xAD6C; &#xD558;&#xAE30; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; &#xAC10;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xC18D;&#xB3C4; &#xC81C;&#xD55C; &#xB3C4;&#xB2EC; &#xD588;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB2E4; &#xCD08;&#xC810; scanhead 64 foci&#xC758; &#xB77C;&#xC778;&#xC5D0; &#xB808;&#xC774;&#xC800; &#xBE54;&#xC744; &#xBD84;&#xD560; &#xC804;&#xCCB4; &#xB808;&#xC774;&#xC800; &#xC804;&#xB825;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0D8;&#xD50C; &#xC870;&#xBA85; &#xC218; &#xC788;&#xB3C4;&#xB85D; &#xD65C;&#xC6A9;. &#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC740; photomultipliers&#xC5D0; &#xC758;&#xD574; &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xD0D0;&#xC9C0;&#xB294; &#xB2EC;&#xB9AC; &#xC804; &#xD558; &#xACB0;&#xD569; &#xC18C;&#xC790; &#xD544;&#xB4DC; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC744; &#xD544;&#xC694;&#xB85C;&#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB450; &#xC124;&#xC815;&#xC758; &#xAD11;&#xD559; &#xC131;&#xB2A5; &#xBE44;&#xAD50; &#xCE21;&#xC815; &#xAC00;&#xB2A5;&#xD55C; &#xBAA8;&#xB4E0; &#xB9E4;&#xAC1C; &#xBCC0;&#xC218;&#xB294; &#xB300;&#xBD80;&#xBD84;&#xC758; &#xC2E4;&#xC81C; &#xC2E4;&#xD5D8; &#xC2E4;&#xD589; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4; 200 microm&#xC758; &#xCE68;&#xD22C; &#xAE4A;&#xC774; &#xB0B4;&#xB824; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC801; &#xB3D9;&#xB4F1;&#xC131;&#xC744; &#xBCF4;&#xC5EC;&#xC90D;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xB3C4;&#xCFC4; &#xAC10;&#xC9C0;&#xC758; &#xC7A5;&#xC810;&#xC740; &#xAE4A;&#xC774; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xAD6C;&#xCCB4;&#xD654; &amp;gt; &#xADF8;&#xB4E4;&#xC758; &#xB354; &#xB098;&#xC740; &#xC2E0;&#xD638;/&#xC7A1;&#xC74C; &#xBE44;&#xC728; &#xB54C;&#xBB38;&#xC5D0; 300 microm&#xB9CC; &#xCDA9;&#xC804;-&#xACB0;&#xD569; &#xC18C;&#xC790; &#xC218; &#xC2E0;&#xC18D; &#xD558; &#xAC8C; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04; &#xD0D0;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xBC18;&#xBA74; (&#xC5EC;&#xAE30; &#xD608;&#xC561; &#xD750;&#xB984;). &#xB450; &#xC18C;&#xC790;&#xB294; &#xBAA8;&#xB450; &#xD3EC;&#xC778;&#xD2B8; &#xD655;&#xC0B0; &#xAE30;&#xB2A5; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xAC8C; &#xC870;&#xC9C1; &#xD5CC;&#xBC95;&#xACFC; &#xCE68;&#xD22C; &#xAE4A;&#xC774;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xB2E4;&#xB985;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xD558;&#xB294; &#xAC83;&#xC774; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xADF8;&#xB7EC;&#xB098;, &#xAE4A;&#xC774; &#xC218;&#xC815; &#xD3EC;&#xC778;&#xD2B8; &#xD655;&#xC0B0; &#xD568;&#xC218;&#xC758; &#xACE0;&#xC6A9; &#xD45C;&#xBA74; &#xD0D0;&#xC9C0;&#xB97C; &#xB2EE;&#xC740; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xD488;&#xC9C8;&#xAE4C;&#xC9C0; &#xAE4A;&#xC740; &#xC870;&#xC9C1; &#xB370;&#xC774;&#xD130;&#xC758; 3 &#xCC28;&#xC6D0; deconvolution&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Intravital &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xACE0;&#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xBC0F; &#xACE0;&#xC18D; &#xAE4A;&#xC740; &#xC870;&#xC9C1; &#xC2F1;&#xAE00;&#xACFC; multibeam &#xB450; &#xAD11;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;&#xC758; &#xD798;.

Microscopio de dos fotones es indispensable para los tejidos profundos y la imagen intravital. Sin embargo, la tecnolog&#xED;a actual, basado en la exploraci&#xF3;n del punto de una viga ha llegado a los l&#xED;mites de sensibilidad y la velocidad debido a un mayor rendimiento requiere una mayor potencia del l&#xE1;ser que lleva a la degradaci&#xF3;n de la muestra. Utilizamos una divisi&#xF3;n de cabeza de exploraci&#xF3;n multifocal un rayo l&#xE1;ser en una l&#xED;nea de 64 focos, lo que permite la iluminaci&#xF3;n de la muestra en tiempo real a toda la potencia del l&#xE1;ser. Esta tecnolog&#xED;a requiere de acoplamiento de carga de detecci&#xF3;n de dispositivos de campo en contraste con la detecci&#xF3;n convencional por fotomultiplicadores. Una comparaci&#xF3;n del rendimiento &#xF3;ptico de ambas configuraciones muestra equivalencia funcional en cada par&#xE1;metro medible a profundidades de penetraci&#xF3;n de 200 micras, en donde la mayor&#xED;a de los experimentos reales son ejecutados. La ventaja de la detecci&#xF3;n de fotomultiplicador se materializa en las profundidades de im&#xE1;genes&#x26;gt; 300 Microm por su mejor relaci&#xF3;n se&#xF1;al / ruido, mientras que s&#xF3;lo dispositivos acoplados de carga en tiempo real permiten la detecci&#xF3;n de procesos r&#xE1;pidos (en este caso el flujo de sangre). Tambi&#xE9;n encontramos que la funci&#xF3;n de punto de margen tanto de los dispositivos depende en gran medida la constituci&#xF3;n del tejido y la profundidad de penetraci&#xF3;n. Sin embargo, el empleo de una profundidad corregida punto propagaci&#xF3;n funci&#xF3;n permite tres dimensiones deconvoluci&#xF3;n de tejidos profundos de datos de hasta una detecci&#xF3;n de calidad de la imagen se asemeja a la superficie.

El poder de la &#xFA;nica y multihaz de dos fotones microscop&#xED;a de alta resoluci&#xF3;n y alta velocidad de tejido profundo e Imagen intravital

We have developed a new descanned parallel (32-fold) pinhole and photomultiplier detection array for multifocal multiphoton microscopy that effectively reduces the blurring effect originating from scattered fluorescence photons in strongly scattering biological media. With this method, we achieve a fourfold improvement in photon statistics for detecting ballistic photons and an increase in spatial resolution by 21% in the lateral and 35% in the axial direction compared to single-beam non-descanned multiphoton microscopy. The new detection concept has been applied to plant leaves and pollen grains to verify the improvements in imaging quality.

Scattering suppression and confocal detection in multifocal multiphoton microscopy.

&#x53CC;&#x5149;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x6700;&#x521D;&#x4E3B;&#x8981;&#x662F;&#x5728;&#x795E;&#x7ECF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x4E2D;&#x4F7F;&#x7528;&#xFF0C;&#x5DF2;&#x6210;&#x4E3A;&#x514D;&#x75AB;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x7684;&#x5206;&#x6790;&#x7684;&#x6709;&#x529B;&#x5DE5;&#x5177;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x5177;&#x6709;&#x7126;&#x70B9;&#x7684;&#x5F53;&#x524D;&#x53EF;&#x7528;&#x7684;&#x53CC;&#x5149;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x6280;&#x672F;&#x4E0A;&#x65B0;&#x9896;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x4F7F;&#x5176;&#x5F88;&#x9AD8;&#x7684;&#x56FE;&#x50CF;&#x91C7;&#x96C6;&#x7387;&#x76F8;&#x6BD4;&#x6700;&#x5148;&#x8FDB;&#x7684;&#x7CFB;&#x7EDF;&#x3002;&#x8FD9;&#x79CD;&#x6539;&#x8FDB;&#x901A;&#x8FC7;&#x5E76;&#x884C;&#x5316;&#x6FC0;&#x53D1;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x5B9E;&#x73B0;&#x7684;&#xFF1A; &#x591A;&#x4E2A;&#x5149;&#x675F;&#x540C;&#x65F6;&#xFF0C;&#x626B;&#x63CF;&#x6837;&#x54C1;&#x548C;&#x8367;&#x5149;&#x6536;&#x96C6;&#x4E0E;&#x654F;&#x611F;&#x7535;&#x8377;&#x8026;&#x5408;&#x5668;&#x4EF6; &#xFF08;CCD&#xFF09;-&#x57FA;&#x4E8E;&#x884C;&#x6216;&#x5B57;&#x6BB5;&#x7684;&#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x3002;&#x65B0;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x6027;&#x80FD;&#x4E0E;&#x4F20;&#x7EDF;&#x5355;&#x5149;&#x675F;&#x6FC0;&#x5149;&#x626B;&#x63CF;&#x7CFB;&#x7EDF;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x500D;&#x589E;&#x68C0;&#x6D4B;&#x4FE1;&#x53F7;&#x8FDB;&#x884C;&#x6BD4;&#x8F83;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x8FD8;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x4E86;&#x4F7F;&#x7528;&#x65F6;&#x95F4;&#x548C;&#x504F;&#x632F;&#x5206;&#x8FA8;&#x8367;&#x5149;&#x68C0;&#x6D4B;&#xFF0C;&#x5C24;&#x5176;&#x662F;&#x8367;&#x5149;&#x5BFF;&#x547D;&#x6210;&#x50CF; (FLIM)&#xFF0C;&#x8FDC;&#x8FDC;&#x8D85;&#x51FA;&#x7B80;&#x5355;&#x7684;&#x68C0;&#x6D4B;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5141;&#x8BB8;&#x7EC6;&#x80DE;&#x751F;&#x7406;&#x5B66;&#x7684;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x4E13;&#x6CE8;&#x7684; NAD (P) H &#x7B49;&#x5185;&#x6E90;&#x6027;&#x8367;&#x5149;&#x5206;&#x6790;&#x4F5C;&#x4E3A;&#x4E00;&#x79CD;&#x5206;&#x6790;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4E0E;&#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51B3;&#x8BAE;&#x4E2D;&#x7684;&#x6C27;&#x5316;&#x8FD8;&#x539F;&#x72B6;&#x6001;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3002;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#xFF0C;&#x4E0E;&#x65B0;&#x9896;&#x7684;&#x65B9;&#x5F0F;&#xFF0C;&#x6570;&#x636E;&#x5206;&#x6790;&#x76F8;&#x7ED3;&#x5408;&#x7684;&#x9AD8;&#x901F;&#x5F71;&#x50CF;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x5141;&#x8BB8;&#x4E86;&#x80F6;&#x7247;&#x6570;&#x636E;&#x96C6;&#x751F;&#x6210;&#x51E0;&#x4E4E;&#x5B9E;&#x65F6;&#x3002;&#x8BA8;&#x8BBA;&#x6B64;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5E94;&#x548C;&#x5176;&#x4ED6;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x8FC7;&#x7A0B;&#x5206;&#x6790;&#x6280;&#x672F;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;

&#x6D3B;&#x4F53;&#x53CC;&#x5149;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#xFF1A; &#x6CE8;&#x91CD;&#x901F;&#x5EA6;&#x548C;&#x65F6;&#x95F4;&#x89E3;&#x6790;&#x7684;&#x5F71;&#x50CF;&#x3002;

Initially used mainly in the neurosciences, two-photon microscopy has become a powerful tool for the analysis of immunological processes. Here, we describe currently available two-photon microscopy techniques with a focus on novel approaches that allow very high image acquisition rates compared with state-of-the-art systems. This improvement is achieved through a parallelization of the excitation process: multiple beams scan the sample simultaneously, and the fluorescence is collected with sensitive charge-coupled device (CCD)-based line or field detectors. The new technique's performance is compared with conventional single beam laser-scanning systems that detect signals by means of photomultipliers. We also discuss the use of time- and polarization-resolved fluorescence detection, especially fluorescence lifetime imaging (FLIM), which goes beyond simple detection of cells and tissue structures and allows insight into cellular physiology. We focus on the analysis of endogenous fluorophores such as NAD(P)H as a way to analyze the redox status in cells with subcellular resolution. Here, high-speed imaging setups in combination with novel ways of data analysis allow the generation of FLIM data sets almost in real time. The implications of this technology for the analysis of immune reactions and other cellular processes are discussed.

Intravital two-photon microscopy: focus on speed and time resolved imaging modalities.

Initialement utilis&#xE9; principalement dans le domaine des neurosciences, microscopie &#xE0; deux photons est devenue un outil puissant pour l&#x26;#39;analyse des processus immunologiques. Ici, nous d&#xE9;crivons actuellement disponibles des techniques de microscopie &#xE0; deux photons avec un accent sur de nouvelles approches qui permettent des taux tr&#xE8;s &#xE9;lev&#xE9;s d&#x26;#39;acquisition d&#x26;#39;image par rapport &#xE0; l&#x26;#39;&#xE9;tat de l&#x26;#39;art-syst&#xE8;mes. Cette am&#xE9;lioration est obtenue gr&#xE2;ce &#xE0; une parall&#xE9;lisation du processus d&#x26;#39;excitation: de multiples faisceaux balayer l&#x26;#39;&#xE9;chantillon simultan&#xE9;ment, et la fluorescence est collect&#xE9;e par sensibles charge-coupled device (CCD) &#xE0; base de ligne ou des d&#xE9;tecteurs de champ. La performance de la nouvelle technique est compar&#xE9;e &#xE0; faisceau unique conventionnelles balayage laser des syst&#xE8;mes qui d&#xE9;tectent des signaux par le biais de photomultiplicateurs. Nous discutons &#xE9;galement de l&#x26;#39;utilisation du temps et de polarisation r&#xE9;solu d&#xE9;tection par fluorescence, l&#x26;#39;imagerie de fluorescence en particulier la dur&#xE9;e de vie (FLIM), qui va au-del&#xE0; la simple d&#xE9;tection des cellules et des structures tissulaires et permet un aper&#xE7;u de la physiologie cellulaire. Nous nous concentrons sur l&#x26;#39;analyse de fluorophores endog&#xE8;nes telles que le NAD (P) H comme un moyen d&#x26;#39;analyser l&#x26;#39;&#xE9;tat d&#x26;#39;oxydo-r&#xE9;duction dans les cellules avec une r&#xE9;solution subcellulaire. Ici, les configurations d&#x26;#39;imagerie &#xE0; grande vitesse, en combinaison avec de nouvelles fa&#xE7;ons d&#x26;#39;analyse de donn&#xE9;es permettent la g&#xE9;n&#xE9;ration de donn&#xE9;es FLIM d&#xE9;finit presque en temps r&#xE9;el. Les implications de cette technologie pour l&#x26;#39;analyse des r&#xE9;actions immunitaires et d&#x26;#39;autres processus cellulaires sont discut&#xE9;s.

Intravitale microscopie &#xE0; deux photons: Focus sur la vitesse et en temps r&#xE9;solu modalit&#xE9;s d&#x26;#39;imagerie

Anfangs vor allem in den Neurowissenschaften verwendet, ist zwei-Photonen-Mikroskopie ein leistungsf&auml;higes Werkzeug f&uuml;r die Analyse der immunologische Prozesse geworden. Hier beschreiben wir derzeit zwei-Photonen-Mikroskopie-Techniken mit Fokus auf neue Ans&auml;tze, die sehr hohe Bild-Erfassungsraten gegen&uuml;ber den Staat-of-the-Art-Systemen zu erm&ouml;glichen. Diese Verbesserung wird erreicht durch eine Parallelisierung des Prozesses Erregung: mehrere Balken scan Probe gleichzeitig, und die Fluoreszenz ist mit sensiblen Charge - Coupled Device (CCD)-Linie oder Feld Detektoren basiert. Die neue Technik Leistung wird mit herk&ouml;mmlichen Einzelstrahl Laserscanning Systemen verglichen, die Signale mittels Photomultiplier zu erkennen. Wir diskutieren auch die Verwendung von Zeit und Polarisation gel&ouml;st Fluoreszenzdetektion, insbesondere Fluoreszenz Lifetime imaging (FLIM), die geht &uuml;ber einfache Erkennung von Zellen und Gewebe-Strukturen und erm&ouml;glicht einen Einblick in die zellul&auml;re Physiologie. Wir setzen auf die Analyse der endogenen Fluorophore wie NAD (P) H als eine M&ouml;glichkeit, den Redox-Status in den Zellen mit subzellulare Aufl&ouml;sung zu analysieren. Hier erm&ouml;glichen Hochgeschwindigkeits-Bildverarbeitung-Setups in Kombination mit neuartigen Methoden der Datenanalyse die Generation von FLIM-Datens&auml;tzen fast in Echtzeit. Die Auswirkungen dieser Technologie f&uuml;r die Analyse von Immunreaktionen und andere zellul&auml;re Prozesse werden diskutiert.

Intravital zwei-Photonen-Mikroskopie: Fokus auf Geschwindigkeit und Zeit aufgel&ouml;ste Bildgebungsverfahren.

Inizialmente utilizzata principalmente nelle neuroscienze, microscopia del due-fotone &egrave; diventato un potente strumento per l&#39;analisi dei processi immunologici. Qui, descriviamo tecniche attualmente disponibili microscopia del due-fotone con un focus su nuovi approcci che consentono tassi di acquisizione immagine molto alta rispetto ai sistemi di stato-of-the-art. Questo miglioramento &egrave; ottenuto attraverso un parallelizzazione del processo di eccitazione: raggi multipli di scansione del campione simultaneamente, e la fluorescenza &egrave; raccolto con sensibili charge coupled device (CCD)-basato su rivelatori di riga o un campo. Le prestazioni della nuova tecnica viene confrontata con i sistemi convenzionali a singolo raggio laser scanning di rilevare segnali mediante fotomoltiplicatori. Discutiamo anche l&#39;uso di rilevazione a fluorescenza risolta da tempo e polarizzazione, soprattutto vita di fluorescenza (FLIM), di imaging che va oltre il semplice rilevamento di cellule e tessuti delle strutture e permette l&#39;analisi approfondita della fisiologia cellulare. Ci concentriamo sull&#39;analisi di fluorofori endogeni quali NAD (P) H come un modo per analizzare lo stato redox in cellule con risoluzione sottocellulari. Qui, configurazioni di imaging ad alta velocit&agrave; in combinazione con nuovi modi di analisi dei dati consentono la generazione di FLIM insiemi di dati quasi in tempo reale. Vengono discusse le implicazioni di questa tecnologia per l&#39;analisi delle reazioni immunitarie e altri processi cellulari.

Intravital microscopia del due-fotone: concentrarsi sulla velocit&agrave; e tempo risolta modalit&agrave; di imaging.

&#x5F53;&#x521D;&#x306F;&#x795E;&#x7D4C;&#x79D1;&#x5B66;&#x3067;&#x4E3B;&#x306B;&#x4F7F;&#x7528;&#x3001;2&#x5149;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306F;&#x3001;&#x514D;&#x75AB;&#x5B66;&#x7684;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x5F37;&#x529B;&#x306A;&#x30C4;&#x30FC;&#x30EB;&#x3068;&#x306A;&#x3063;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x6700;&#x5148;&#x7AEF;&#x306E;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3068;&#x6BD4;&#x3079;&#x3066;&#x975E;&#x5E38;&#x306B;&#x9AD8;&#x3044;&#x753B;&#x50CF;&#x53D6;&#x5F97;&#x30EC;&#x30FC;&#x30C8;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x65B0;&#x305F;&#x306A;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x3066;&#x3001;&#x73FE;&#x5728;&#x5165;&#x624B;&#x53EF;&#x80FD;&#x306A;&#x4E8C;&#x5149;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x6280;&#x8853;&#x3092;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x306E;&#x6539;&#x5584;&#x306F;&#x3001;&#x52B1;&#x8D77;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x4E26;&#x5217;&#x5316;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x5B9F;&#x73FE;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x8907;&#x6570;&#x306E;&#x30D3;&#x30FC;&#x30E0;&#x3092;&#x540C;&#x6642;&#x306B;&#x30B5;&#x30F3;&#x30D7;&#x30EB;&#x3092;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x3057;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x304C;&#x654F;&#x611F;&#x306A;&#x96FB;&#x8377;&#x7D50;&#x5408;&#x7D20;&#x5B50;&#xFF08;CCD&#xFF09;&#x30D9;&#x30FC;&#x30B9;&#x30E9;&#x30A4;&#x30F3;&#x307E;&#x305F;&#x306F;&#x30D5;&#x30A3;&#x30FC;&#x30EB;&#x30C9;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x5668;&#x3067;&#x53CE;&#x96C6;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x6280;&#x8853;&#x306E;&#x6027;&#x80FD;&#x306F;&#x3001;&#x5149;&#x96FB;&#x5B50;&#x5897;&#x500D;&#x7BA1;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x4FE1;&#x53F7;&#x3092;&#x691C;&#x51FA;&#x3059;&#x308B;&#x5F93;&#x6765;&#x306E;&#x30B7;&#x30F3;&#x30B0;&#x30EB;&#x30D3;&#x30FC;&#x30E0;&#x30EC;&#x30FC;&#x30B6;&#x30FC;&#x30B9;&#x30AD;&#x30E3;&#x30F3;&#x30B7;&#x30B9;&#x30C6;&#x30E0;&#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3055;&#x308C;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x307E;&#x305F;&#x3001;&#x6642;&#x9593;&#x3068;&#x504F;&#x5149;&#x5206;&#x89E3;&#x86CD;&#x5149;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x3084;&#x7D44;&#x7E54;&#x69CB;&#x9020;&#x306E;&#x7C21;&#x4FBF;&#x306A;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x8D85;&#x3048;&#x3066;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x306E;&#x751F;&#x7406;&#x6A5F;&#x80FD;&#x3078;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x304C;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x306A;&#x308A;&#x3001;&#x7279;&#x306B;&#x86CD;&#x5149;&#x5BFF;&#x547D;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#xFF08;FLIM&#xFF09;&#x3001;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005;&#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x306E;&#x5206;&#x89E3;&#x80FD;&#x3092;&#x6301;&#x3064;&#x7D30;&#x80DE;&#x3067;&#x306F;&#x9178;&#x5316;&#x9084;&#x5143;&#x72B6;&#x614B;&#x3092;&#x5206;&#x6790;&#x3059;&#x308B;&#x65B9;&#x6CD5;&#x306A;&#x3069;&#x3001;NAD&#xFF08;P&#xFF09;H&#x306A;&#x3069;&#x306E;&#x5185;&#x56E0;&#x6027;&#x86CD;&#x5149;&#x7269;&#x8CEA;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306B;&#x7126;&#x70B9;&#x3092;&#x5F53;&#x3066;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x3001;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x89E3;&#x6790;&#x306E;&#x65B0;&#x3057;&#x3044;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3068;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3067;&#x9AD8;&#x901F;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x304C;FLIM&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x306E;&#x751F;&#x6210;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x306B;&#x3059;&#x308B;&#x307B;&#x307C;&#x30EA;&#x30A2;&#x30EB;&#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x3067;&#x8A2D;&#x5B9A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x514D;&#x75AB;&#x53CD;&#x5FDC;&#x3068;&#x4ED6;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x30D7;&#x30ED;&#x30BB;&#x30B9;&#x306E;&#x5206;&#x6790;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x3053;&#x306E;&#x6280;&#x8853;&#x306E;&#x542B;&#x610F;&#x304C;&#x8B70;&#x8AD6;&#x3055;&#x308C;&#x3066;&#x3044;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

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Neurosciences&#xC5D0;&#xC11C; &#xC8FC;&#xB85C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xCC98;&#xC74C; &#xB450; &#xAD11;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xBA74;&#xC5ED; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xAC15;&#xB825;&#xD55C; &#xB3C4;&#xAD6C;&#xAC00; &#xB418;&#xACE0;&#xC788;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;, &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xCD5C;&#xC2E0;&#xC758; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C;&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xB9E4;&#xC6B0; &#xB192;&#xC740; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xC218;&#xC9D1; &#xC18D;&#xB3C4; &#xD5C8;&#xC6A9; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xC811;&#xADFC; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC5D0; &#xCD08;&#xC810;&#xC744; &#xB9DE;&#xCD94;&#xACE0; &#xD604;&#xC7AC; &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xB294; &#xB450; &#xAD11;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAE30;&#xBC95; &#xC124;&#xBA85;. &#xC774; &#xAC1C;&#xC120; &#xC5EC;&#xAE30; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xBCD1;&#xB82C;&#xD654;&#xB97C; &#xD1B5;&#xD574; &#xC5BB;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xB2E4;: &#xB2E4;&#xC911; &#xBE54; &#xC2A4;&#xCE94; &#xC0D8;&#xD50C; &#xB3D9;&#xC2DC;&#xC5D0;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xD615;&#xAD11; &#xBBFC;&#xAC10;&#xD55C; &#xC804; &#xD558; &#xACB0;&#xD569; &#xC18C;&#xC790; (CCD)&#xC640; &#xC218;&#xC9D1;-&#xC120; &#xB610;&#xB294; &#xD544;&#xB4DC; &#xD0D0;&#xC9C0;&#xAE30;&#xB97C; &#xAE30;&#xBC18;&#xC73C;&#xB85C;. &#xAE30;&#xC874;&#xC758; &#xB2E8;&#xC77C; &#xBE54; &#xB808;&#xC774;&#xC800; &#xC2A4;&#xCE90;&#xB2DD; &#xC2DC;&#xC2A4;&#xD15C; photomultipliers&#xB97C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xC2E0;&#xD638;&#xB97C; &#xAC10;&#xC9C0; &#xD558;&#xB294; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xAE30;&#xBC95; &#xC131;&#xB2A5; &#xBE44;&#xAD50; &#xB429;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xB610;&#xD55C; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xC124;&#xBA85; &#xC2DC;&#xAC04; &#xBC0F; &#xC591;&#xADF9; &#xD654; &#xD574;&#xACB0; &#xD615;&#xAD11; &#xAC80;&#xCD9C;, &#xD2B9;&#xD788; &#xD615;&#xAD11; &#xC218;&#xBA85; (FLIM) &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5;&#xB294; &#xB118;&#xC5B4; &#xC140;&#xC758; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xAC80;&#xC0C9; &#xBC0F; &#xC870;&#xC9C1; &#xAD6C;&#xC870;&#xC640; &#xC138;&#xD3EC; &#xC0DD;&#xB9AC;&#xD559;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC140; subcellular &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC0B0;&#xD654; &#xC0C1;&#xD0DC;&#xB97C; &#xBD84;&#xC11D; &#xD558;&#xB294; &#xBC29;&#xBC95;&#xC73C;&#xB85C; NAD (P) H &#xB4F1; &#xC0DD; fluorophores&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xCD08;&#xC810;&#xC744;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0;&#xC11C;, &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xBD84;&#xC11D;&#xC758; &#xC0C8;&#xB85C;&#xC6B4; &#xBC29;&#xC2DD;&#xC73C;&#xB85C; &#xD568;&#xAED8; &#xACE0;&#xC18D; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xC124;&#xC815;&#xC744; &#xC2E4;&#xC2DC;&#xAC04;&#xC73C;&#xB85C; FLIM &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC9D1;&#xD569; &#xC0DD;&#xC131; &#xAC70;&#xC758; &#xD5C8;&#xC6A9;. &#xBA74;&#xC5ED; &#xBC18;&#xC751; &#xBC0F; &#xB2E4;&#xB978; &#xC138;&#xD3EC;&#xC9C8; &#xD504;&#xB85C;&#xC138;&#xC2A4;&#xC758; &#xBD84;&#xC11D;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C;&#xC774; &#xAE30;&#xC220;&#xC758; &#xC758;&#xBBF8;&#xB97C; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;.

Intravital &#xB450; &#xAD11;&#xC790; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;: &#xD655;&#xC778; &#xB41C; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; modalities &#xC2DC;&#xAC04;&#xACFC; &#xC18D;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xCD08;&#xC810;.

Inicialmente se utiliza principalmente en las neurociencias, la microscopia de dos fotones se ha convertido en una poderosa herramienta para el an&#xE1;lisis de los procesos inmunol&#xF3;gicos. A continuaci&#xF3;n, describimos disponibles en la actualidad de dos fotones de t&#xE9;cnicas de microscop&#xED;a con un enfoque en nuevos enfoques que permitan a las tasas de adquisici&#xF3;n de imagen muy alta en comparaci&#xF3;n con los sistemas de estado-of-the-art. Esta mejora se consigue mediante una paralelizaci&#xF3;n del proceso de excitaci&#xF3;n: m&#xFA;ltiples haces analizar la muestra de forma simult&#xE1;nea, y la fluorescencia se recoge con sensibilidad dispositivo de carga acoplada (CCD)-basado en l&#xED;nea o detectores de campo. El rendimiento de la nueva t&#xE9;cnica se compara con un solo haz de exploraci&#xF3;n convencionales l&#xE1;ser sistemas que detectan las se&#xF1;ales por medio de fotomultiplicadores. Tambi&#xE9;n se discute el uso del tiempo-y la polarizaci&#xF3;n de resolverse la detecci&#xF3;n por fluorescencia, la imagen de por vida, especialmente de fluorescencia (Flim), que va m&#xE1;s all&#xE1; de la simple detecci&#xF3;n de las c&#xE9;lulas y las estructuras de los tejidos y permite comprender la fisiolog&#xED;a celular. Nos centramos en el an&#xE1;lisis de los fluor&#xF3;foros end&#xF3;genos como la NAD (P) H como una forma de analizar el estado redox en las c&#xE9;lulas con una resoluci&#xF3;n subcelular. Aqu&#xED;, las configuraciones de alta velocidad de im&#xE1;genes en combinaci&#xF3;n con nuevas formas de an&#xE1;lisis de datos permite la generaci&#xF3;n de datos Fli establece casi en tiempo real. Las implicaciones de esta tecnolog&#xED;a para el an&#xE1;lisis de las reacciones inmunes y otros procesos celulares se discuten.

Intravital microscop&#xED;a de dos fotones: centrarse en la velocidad y resuelta en tiempo las modalidades de imagen

&#x591A;&#x5149;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C; (MPM) &#x662F;&#x9009;&#x62E9;&#x7684;&#x8C03;&#x67E5;&#x4E2D;&#x8282;&#x6DF1;&#x90E8;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x548C;&#x5668;&#x5B98;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#x548C;&#x7EC6;&#x80DE;&#x7684;&#x65B9;&#x6CD5;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x5728;&#x8FD9;&#x91CC;&#x63D0;&#x51FA;&#x7684;&#x8BBE;&#x7F6E;&#x548C;&#x7EA2;&#x5916;-(IR) &#x8FDE;&#x8F67;&#x7BA1;&#x673A;&#x7684;&#x5E94;&#x7528;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x4F7F;&#x7528;&#x4EE5;&#x4E0A; 1080 nm &#x6FC0;&#x53D1;&#x6CE2;&#x957F;&#x3002;&#x7EA2;&#x5916; MPM &#x5141;&#x8BB8;&#x4F7F;&#x7528;&#x7684;&#x7EA2;&#x8272;&#x8367;&#x5149;&#x548C;&#x8367;&#x5149;&#x86CB;&#x767D;&#xFF0C;&#x53CC;&#x6253;&#x6210;&#x50CF;&#x6DF1;&#x5EA6;&#xFF0C;&#x63D0;&#x9AD8;&#x4E8C;&#x6B21;&#x8C10;&#x6CE2;&#x7684;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x7ED3;&#x6784;&#xFF0C;&#x5E76;&#x5F3A;&#x70C8;&#x964D;&#x4F4E;&#x5149;&#x6BD2;&#x6027;&#x548C;&#x5149;&#x6F02;&#x767D;&#xFF0C;&#x76F8;&#x6BD4;&#x4F20;&#x7EDF;&#x7684; MPM&#x3002;&#x6B64;&#x5916;&#xFF0C;&#x5B83;&#x4ECD;&#x7136;&#x63D0;&#x4F9B;&#x4E86;&#x5728;&#x51E0;&#x4E2A;&#x51E0;&#x767E;&#x5FAE;&#x7C73;&#x6DF1;&#x5EA6;&#x7684;&#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x51B3;&#x8BAE;&#xFF0C;&#x4ECE;&#x800C;&#x63D0;&#x9AD8;&#x957F;&#x671F;&#x6D3B;&#x7EC6;&#x80DE;&#x53CA;&#x6DF1;&#x90E8;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x3002;

&#x7EA2;&#x5916;&#x591A;&#x5149;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#xFF1A; &#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x89E3;&#x51B3;&#x6DF1;&#x5C42;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x6210;&#x50CF;&#x3002;

Multiphoton microscopy (MPM) is the method of choice for investigating cells and cellular functions in deep tissue sections and organs. Here we present the setup and applications of infrared-(IR-)MPM using excitation wavelengths above 1080 nm. IR-MPM enables the use of red fluorophores and fluorescent proteins, doubles imaging depth, improves second harmonic generation of tissue structures, and strongly reduces phototoxicity and photobleaching, compared with conventional MPM. Furthermore, it still provides subcellular resolution at depths of several hundred micrometers and thus will enhance long-term live cell and deep tissue microscopy.

Infrared multiphoton microscopy: subcellular-resolved deep tissue imaging.

La microscopie multiphoton (MPM) est la m&eacute;thode de choix pour &eacute;tudier les cellules et les fonctions cellulaires dans des sections de tissu profond et les organes. Nous pr&eacute;sentons ici la configuration et les applications de MPM infrarouge-(IR-) en utilisant les longueurs d&#39;onde d&#39;excitation au-dessus de 1080 nm. IR-MPM permet l&#39;utilisation de fluorophores rouges et am&eacute;liore la g&eacute;n&eacute;ration de seconde harmonique des structures tissulaires prot&eacute;ines fluorescentes, double profondeur, d&#39;imagerie et fortement r&eacute;duit la phototoxicit&eacute; et photobleaching, comparativement &agrave; MPM classique. En outre, il fournit toujours la r&eacute;solution subcellulaire &agrave; des profondeurs de plusieurs microm&egrave;tres de centaines et donc permettra d&#39;am&eacute;liorer &agrave; long terme de cellules vivantes et la microscopie des tissus profonds.

La microscopie multiphoton infrarouge : imagerie tissulaire profonde subcellulaire r&eacute;solue.

Multiphoton-Mikroskopie (MPM) ist die Methode der Wahl f&uuml;r die Untersuchung von Zellen und Zellfunktionen in Bereichen der tiefen Gewebe und Organe. Hier pr&auml;sentieren wir die Einrichtung und die Anwendungen der Infrarot-(IR-) MPM mit Erregung Wellenl&auml;ngen oberhalb 1080 nm. IR-MPM erm&ouml;glicht die Verwendung von roten Fluorophore und fluoreszierende Proteine, Doppel imaging Tiefe, verbessert die zweite harmonische Erzeugung von Gewebestrukturen und stark reduziert, Phototoxizit&auml;t und Photobleaching, verglichen mit konventionellen MPM. Dar&uuml;ber hinaus bietet noch subzellulare Aufl&ouml;sung bei tiefen von mehreren Hundert Mikrometern und somit verbessert langfristig Leben Zelle und Tiefe Gewebe-Mikroskopie.

Infrarot multiphoton-Mikroskopie: tiefes Gewebe subzellulare aufgel&ouml;st Bildgebung.

Microscopia multifotonica (MPM) &egrave; il metodo di scelta per indagare le cellule e funzioni cellulari in sezioni di tessuto profondo e organi. Presentiamo qui il setup e applicazioni di MPM-infrarosso (IR-) utilizzando lunghezze d&#39;onda di eccitazione sopra 1080 nm. IR-MPM consente l&#39;utilizzo di fluorofori rosso e le proteine fluorescenti, doppio imaging profondit&agrave;, migliora la generazione di seconda armonica delle strutture dei tessuti e riduce fortemente la fototossicit&agrave; e photobleaching, rispetto ai convenzionali MPM. Inoltre, fornisce ancora sottocellulari risoluzione a profondit&agrave; di diverse centinaia di micrometri e migliorer&agrave; cos&igrave; a lungo termine delle cellule dal vivo e microscopia di tessuti profondi.

Microscopia infrarossa multifotonica: imaging tessuto profondo sottocellulari risolto.

&#x591A;&#x5149;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1; (MPM) &#x306F;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x6DF1;&#x3044;&#x30C6;&#x30A3;&#x30C3;&#x30B7;&#x30E5; &#x30BB;&#x30AF;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x5668;&#x5B98;&#x3092;&#x8ABF;&#x67FB;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x9078;&#x629E;&#x65B9;&#x5F0F;&#x3067;&#x3059;&#x3002;&#x3053;&#x3053;&#x3067;&#x306F;&#x30BB;&#x30C3;&#x30C8;&#x30A2;&#x30C3;&#x30D7;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x8D64;&#x5916;-(IR-) MPM &#x306E;&#x30A2;&#x30D7;&#x30EA;&#x30B1;&#x30FC;&#x30B7;&#x30E7;&#x30F3;&#x4E0A;&#x8A18; 1080 nm &#x52B1;&#x8D77;&#x6CE2;&#x9577;&#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3057;&#x3066;&#x63D0;&#x793A;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;IR MPM &#x8D64; fluorophores &#x3092;&#x4F7F;&#x7528;&#x3067;&#x304D;&#x308B;&#x3088;&#x3046;&#x306B;&#x3001;&#x86CD;&#x5149;&#x30BF;&#x30F3;&#x30D1;&#x30AF;&#x8CEA;&#x3001;&#x6DF1;&#x3055;&#x3001;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0; &#x30C0;&#x30D6;&#x30EB;&#x30B9;&#x7D44;&#x7E54;&#x69CB;&#x9020;&#x306E; shg &#x3092;&#x6539;&#x5584;&#x3057;&#x3001;&#x5149;&#x6BD2;&#x6027;&#x3068;&#x5F93;&#x6765;&#x306E; MPM &#x3068;&#x6BD4;&#x8F03;&#x3057;&#x3066;&#x30D5;&#x30A9;&#x30C8;&#x30D6;&#x30EA;&#x30FC;&#x30C1;&#x30F3;&#x30B0;&#x5F37;&#x304F;&#x6E1B;&#x308B;&#x3002;&#x3055;&#x3089;&#x306B;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x4E0B;&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x306E;&#x6570;&#x767E; &mu; m &#x306E;&#x6DF1;&#x3055;&#x3067;&#x306F;&#x307E;&#x3060;&#x63D0;&#x4F9B;&#x3057;&#x3001;&#x5F93;&#x3063;&#x3066;&#x9577;&#x671F;&#x751F;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x6DF1;&#x90E8;&#x7D44;&#x7E54;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3092;&#x5F37;&#x5316;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;

&#x8D64;&#x5916;&#x591A;&#x5149;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;: &#x7D30;&#x80DE;&#x5185;&#x5206;&#x89E3;&#x30C7;&#x30A3;&#x30FC;&#x30D7;&#x30C6;&#x30A3;&#x30B7;&#x30E5;&#x30FC; &#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x3002;

Multiphoton &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95; (MPM) &#xC870;&#xC0AC; &#xC138;&#xD3EC;&#xC640; &#xAE4A;&#xC740; &#xC870;&#xC9C1; &#xC139;&#xC158; &#xBC0F; &#xC7A5;&#xAE30;&#xC5D0;&#xC11C; &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xB2A5;&#xC5D0; &#xB300; &#xD55C; &#xC120;&#xD0DD;&#xC758; &#xBC29;&#xBC95;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC5EC;&#xAE30;&#xC5D0; &#xC6B0;&#xB9AC;&#xAC00; &#xD604;&#xC7AC; &#xC124;&#xCE58; &#xBC0F; &#xC801;&#xC678;&#xC120;-(IR-) MPM&#xC758; &#xC704;&#xC5D0; 1080 nm &#xC5EC;&#xAE30; &#xD30C;&#xC7A5;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC;. IR-MPM &#xBE68;&#xAC04; fluorophores &#xC0AC;&#xC6A9;&#xD560; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4; &#xBC0F; &#xD615;&#xAD11; &#xB2E8;&#xBC31;&#xC9C8;, &#xAE4A;&#xC774;, &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xBCF5;&#xC2DD; &#xC870;&#xC9C1; &#xAD6C;&#xC870;&#xC758; &#xB450; &#xBC88;&#xC9F8; &#xACE0;&#xC870;&#xD30C; &#xC0DD;&#xC131;&#xC744; &#xAC1C;&#xC120; &#xD558; &#xACE0; phototoxicity &#xBC0F; photobleaching, &#xAE30;&#xC874;&#xC758; MPM&#xC5D0; &#xBE44;&#xD574; &#xAC15;&#xB825; &#xD558; &#xAC8C; &#xAC10;&#xC18C;. &#xB610;&#xD55C;, &#xC544;&#xC9C1; &#xBA87; &#xBC31; &#xB9C8;&#xC774;&#xD06C;&#xB85C;&#xBBF8;&#xD130;&#xC758; &#xAE4A;&#xC774;&#xC5D0;&#xC11C; subcellular &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4; &#xC81C;&#xACF5; &#xD558; &#xACE0; &#xB530;&#xB77C;&#xC11C; &#xC7A5;&#xAE30; &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; &#xC140;&#xACFC; &#xAE4A;&#xC740; &#xC870;&#xC9C1; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xD5A5;&#xC0C1; &#xC2DC;&#xD0AC; &#xAC83;&#xC785;&#xB2C8;&#xB2E4;.

&#xC801;&#xC678;&#xC120; multiphoton &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;: &#xAE4A;&#xC740; &#xC870;&#xC9C1; subcellular &#xD574;&#xACB0; &#xC601;&#xC0C1;.

Microscop&iacute;a multifot&oacute;n (MPM) es el m&eacute;todo de elecci&oacute;n para la investigaci&oacute;n de las c&eacute;lulas y las funciones celulares en secciones de tejido profundo y &oacute;rganos. Aqu&iacute; presentamos la configuraci&oacute;n y aplicaciones de MPM-infrarrojo (IR-) con longitudes de onda de excitaci&oacute;n sobre 1080 nm. IR-MPM permite el uso de fluor&oacute;foros rojas y prote&iacute;nas fluorescentes, dobles im&aacute;genes en profundidad, mejora segunda harm&oacute;nica de estructuras del tejido y reduce fuertemente la fototoxicidad y photobleaching, en comparaci&oacute;n con el convencional MPM. Adem&aacute;s, todav&iacute;a ofrece resoluci&oacute;n subcelular a una profundidad de varios cientos micr&oacute;metros y as&iacute; mejorar&aacute; vivo a largo plazo de la c&eacute;lula y microscop&iacute;a de tejido profundo.

Microscop&iacute;a multifot&oacute;n infrarrojo: tisular profundo subcelular resuelta.

Lymphatic vessels, the second vascular system of higher vertebrates, are indispensable for fluid tissue homoeostasis, dietary fat resorption and immune surveillance. Not only are lymphatic vessels formed during fetal development, when the lymphatic endothelium differentiates and separates from blood endothelial cells, but also lymphangiogenesis occurs during adult life under conditions of inflammation, wound healing and tumour formation. Under all of these conditions, haemopoietic cells can exert instructive influences on lymph vessel growth and are essential for the vital separation of blood and lymphatic vessels. LECs (lymphatic endothelial cells) are characterized by expression of a number of unique genes that distinguish them from blood endothelium and can be utilized to drive reporter genes in a lymph endothelial-specific fashion. In the present paper, we describe the Prox1 (prospero homeobox protein 1) promoter-driven expression of the fluorescent protein mOrange2, which allows the specific intravital visualization of lymph vessel growth and behaviour during mouse fetal development and in adult mice.

Intravital two-photon microscopy of lymphatic vessel development and function using a transgenic Prox1 promoter-directed mOrange2 reporter mouse.

Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) enables detection of complex molecular assemblies within a single voxel for studies of cell function and communication with subcellular resolution in optically transparent tissue. We describe a fast FLIM technique consisting of a novel time-correlated single-photon counting (TCSPC) detector that features 80 MHz average count rate and the phasor analysis for efficient data acquisition and evaluation. This method in combination with multiphoton microscopy enables acquisition of a lifetime image every 1-2 s in 3D live organotypic tissue culture. 3D time-lapse fluorescence lifetime data were acquired over up to 20 h and analyzed by using exponential fitting and phasor analysis. By correlating specific areas in the phasor plot to the actual image, we obtained direct insight into cancer-cell invasion into a 3D collagen matrix, the differential uptake of doxorubicin by cells, and the consequences on cell invasion and apoptosis induction. Based on the fast acquisition and simplified image postprocessing and quantification, time-lapse 3D FLIM is a versatile approach for monitoring the 3D topography, kinetics, and biological output of structurally and spectrally complex cell and tissue models.

Fluorescence lifetime microscopy of tumor cell invasion, drug delivery, and cytotoxicity.

&#x8367;&#x5149;&#x5BFF;&#x547D;&#x6210;&#x50CF;&#x663E;&#x5FAE;&#x6280;&#x672F; (FLIM) &#x4F7F;&#x68C0;&#x6D4B;&#x5185;&#x5355;&#x4E2A;&#x7D20;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x529F;&#x80FD;&#x548C;&#x4E9A;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5206;&#x8FA8;&#x7387;&#x5149;&#x5B66;&#x900F;&#x660E;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x4E2D;&#x7684;&#x6C9F;&#x901A;&#x7814;&#x7A76;&#x590D;&#x6742;&#x5206;&#x5B50;&#x7684;&#x7A0B;&#x5E8F;&#x96C6;&#x3002;&#x6211;&#x4EEC;&#x63CF;&#x8FF0;&#x7EC4;&#x6210;&#x7684;&#x65B0;&#x578B;&#x65F6;&#x95F4;&#x76F8;&#x5173;&#x5355;&#x5149;&#x5B50;&#x8BA1;&#x6570; &#xFF08;TCSPC&#xFF09; &#x63A2;&#x6D4B;&#x5668;&#x529F;&#x80FD; 80 MHz &#x5E73;&#x5747;&#x8BA1;&#x6570;&#x7387;&#x548C;&#x9AD8;&#x6548;&#x7387;&#x7684;&#x6570;&#x636E;&#x91C7;&#x96C6;&#x548C;&#x8BC4;&#x4EF7;&#x7684;&#x76F8;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x5FEB;&#x901F;&#x80F6;&#x7247;&#x6280;&#x672F;&#x3002;&#x6B64;&#x65B9;&#x6CD5;&#x4E0E;&#x591A;&#x5149;&#x5B50;&#x663E;&#x5FAE;&#x955C;&#x7ED3;&#x5408;&#x4F7F;&#x751F;&#x5B58;&#x671F;&#x56FE;&#x50CF;&#x91C7;&#x96C6; 3D &#x76F4;&#x64AD;&#x5668;&#x5B98;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x57F9;&#x517B;&#x4E2D;&#x7684;&#x6BCF; 1-2 s&#x3002;3D &#x5EF6;&#x65F6;&#x8367;&#x5149;&#x751F;&#x5B58;&#x671F;&#x6570;&#x636E;&#x88AB;&#x6536;&#x8D2D;&#x8FBE; 20 &#x5C0F;&#x65F6;&#x4EE5;&#x4E0A;&#xFF0C;&#x901A;&#x8FC7;&#x4F7F;&#x7528;&#x6307;&#x6570;&#x7684;&#x62DF;&#x5408;&#x548C;&#x76F8;&#x91CF;&#x5206;&#x6790;&#x8FDB;&#x884C;&#x5206;&#x6790;&#x3002;&#x901A;&#x8FC7;&#x5173;&#x8054;&#x7684;&#x5B9E;&#x9645;&#x56FE;&#x50CF;&#x76F8;&#x91CF;&#x56FE;&#x4E2D;&#x7684;&#x5177;&#x4F53;&#x9886;&#x57DF;&#xFF0C;&#x6211;&#x4EEC;&#x83B7;&#x5F97;&#x76F4;&#x63A5;&#x6DF1;&#x5165;&#x4E86;&#x89E3;&#x764C;&#x75C7;&#x7EC6;&#x80DE;&#x5165;&#x4FB5;&#x5230; 3D &#x80F6;&#x539F;&#x57FA;&#x8D28;&#x3001; &#x963F;&#x9709;&#x7D20;&#x7EC6;&#x80DE;&#xFF0C;&#x5DEE;&#x5206;&#x5438;&#x6536;&#x548C;&#x5BF9;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4FB5;&#x88AD;&#x548C;&#x8BF1;&#x5BFC;&#x51CB;&#x4EA1;&#x7684;&#x5F71;&#x54CD;&#x3002;&#x57FA;&#x4E8E;&#x5FEB;&#x901F;&#x91C7;&#x96C6;&#x548C;&#x7B80;&#x5316;&#x7684;&#x56FE;&#x50CF;&#x540E;&#x5904;&#x7406;&#x548C;&#x91CF;&#x5316;&#xFF0C;&#x5B9A;&#x65F6;&#x62CD;&#x6444;&#x7684; 3D &#x7535;&#x5F71;&#x662F;&#x76D1;&#x6D4B; 3D &#x5730;&#x5F62;&#x3001; &#x52A8;&#x529B;&#x5B66;&#x548C;&#x751F;&#x7269;&#x7684;&#x7ED3;&#x6784;&#x548C;&#x5149;&#x8C31;&#x590D;&#x6742;&#x7684;&#x7EC6;&#x80DE;&#x548C;&#x7EC4;&#x7EC7;&#x6A21;&#x578B;&#x7684;&#x8F93;&#x51FA;&#x901A;&#x7528;&#x505A;&#x6CD5;&#x3002;

&#x80BF;&#x7624;&#x7EC6;&#x80DE;&#x4FB5;&#x88AD;&#x3001; &#x836F;&#x53CA;&#x7EC6;&#x80DE;&#x6BD2;&#x6027;&#x7684;&#x8367;&#x5149;&#x5BFF;&#x547D;&#x663E;&#x5FAE;&#x672F;&#x3002;

Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) permet la d&eacute;tection des assemblages mol&eacute;culaires complexes au sein d&#39;un seul voxel pour l&#39;&eacute;tude de la fonction cellulaire et de la communication avec r&eacute;solution subcellulaire en tissu optiquement transparent. Nous d&eacute;crivons une technique rapide de FLIM consistant en un roman le temps-corr&eacute;l&eacute; monophotonique comptage (TCSPC) d&eacute;tecteur qui pr&eacute;sente le taux de comptage moyenne de 80 MHz et l&#39;analyse de phaseur pour acquisition de donn&eacute;es efficace et l&#39;&eacute;valuation. Cette m&eacute;thode en combinaison avec la microscopie multiphoton permet l&#39;acquisition d&#39;une image de vie toutes les 1-2 s en culture organotypique direct 3D. Donn&eacute;es de dur&eacute;e de vie de fluorescence de Time-Lapse 3D ont &eacute;t&eacute; acquises au cours jusqu&#39;&agrave; 20 h et analys&eacute;es en utilisant l&#39;analyse de raccord et phaseur exponentielle. En corr&eacute;lant les domaines sp&eacute;cifiques de la placette de phaseur &agrave; l&#39;image r&eacute;elle, nous avons obtenu directement de l&#39;aide dans l&#39;invasion de la cellule canc&eacute;reuse dans une matrice de collag&egrave;ne 3D, l&#39;absorption diff&eacute;rentielle de la doxorubicine par les cellules et les cons&eacute;quences sur l&#39;invasion des cellules et l&#39;induction de l&#39;apoptose. Bas&eacute; sur l&#39;acquisition rapide et le post-traitement de l&#39;image simplifi&eacute;e et la quantification, time-lapse FLIM 3D est une approche souple pour la topographie 3D, cin&eacute;tique, en contr&ocirc;lant biologique de spectralement et structurellement complexes mod&egrave;les cellulaires et tissulaires.

Microscopie &agrave; fluorescence lifetime d&#39;invasion des cellules tumorales, administration de m&eacute;dicaments et la cytotoxicit&eacute;.

Fluoreszenz-Lebensdauer-Mikroskopie (FLIM) imaging erm&ouml;glicht die Erkennung von komplexen molekularen Baugruppen innerhalb einer einzelnen Voxel f&uuml;r Studien der Zellfunktion und Kommunikation mit subzellulare Aufl&ouml;sung optisch transparente Gewebe. Wir beschreiben eine schnelle FLIM-Technik, bestehend aus einem Roman Zeit korrelierte Single-Photon z&auml;hlen (TCSPC) Detektor, die durchschnittliche Z&auml;hlrate 80 MHz sowie der Phasor-Analyse f&uuml;r effiziente Datenerfassung und Auswertung. Diese Methode in Kombination mit multiphoton-Mikroskopie erm&ouml;glicht den Erwerb eines Bildes Lebensdauer alle 1-2-s in 3D live organotypische Zellkultur. 3D Zeitraffer Fluoreszenz-Lebensdauer-Daten wurden &uuml;ber bis zu 20 h erworben und durch exponentielle Anpassung und Phasor Analyse analysiert. Durch die Korrelation von bestimmter Bereichen in der Phasor Handlung um das eigentliche Bild, erhalten wir direkten Einblick in Krebs-Zellen Eindringen in eine 3D Kollagen-Matrix, die differenzielle Aufnahme von Doxorubicin durch Zellen und die Auswirkungen auf die Invasion und Apoptose-Induktion. Auf der Grundlage der schnelle &Uuml;bernahme und vereinfachte Bild-Nachbearbeitung und Quantifizierung, ist Zeitraffer 3D FLIM ein vielseitiges Konzept zur &Uuml;berwachung der 3D-Topographie, Kinetik und biologische Ausgabe strukturell und Spektral komplexer Modelle von Zellen und Gewebe.

Fluoreszenzmikroskopie Lebensdauer der Zelle Tumorinvasion, Medikamentenabgabe und Zytotoxizit&auml;t.

Vita di fluorescenza (FLIM) microscopia di imaging consente il rilevamento di assiemi complessi molecolari all&#39;interno di un singolo voxel per gli studi di funzione delle cellule e la comunicazione con risoluzione sottocellulari nel tessuto otticamente trasparente. Descriviamo una tecnica FLIM veloce composto da un romanzo correlati nel tempo singolo-fotone conteggio (TCSPC) rivelatore che caratterizza il tasso di conteggio medio 80 MHz e l&#39;analisi fasoriale per acquisizione dati efficiente e valutazione. Questo metodo in combinazione con microscopia multifotonica consente l&#39;acquisizione di un&#39;immagine di vita ogni 1-2 s nella coltura del tessuto 3D live organotypic. Fluorescenza 3D time-lapse durata dati sono stati acquisiti oltre fino a 20 h e analizzati mediante analisi di raccordo e fasoriale esponenziale. Correlando le aree specifiche nella trama del fasore all&#39;immagine reale, abbiamo ottenuto la visione diretta invasione di cellule di cancro in una matrice di collagene 3D, l&#39;assorbimento differenziale di doxorubicina dalle cellule e le conseguenze sull&#39;invasione cellulare e induzione di apoptosi. Basato su acquisizione veloce e postprocessing immagine semplificata e quantificazione, time-lapse FLIM 3D &egrave; un approccio versatile per monitorare la topografia 3D, cinetica e biologici output dei modelli strutturalmente e spettralmente complessi di cellule e tessuti.

Microscopia di fluorescenza durata di invasione delle cellule tumorali, drug delivery e citotossicit&agrave;.

&#x86CD;&#x5149;&#x5BFF;&#x547D;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x30F3;&#x30B0;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x6CD5; (FLIM) &#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x5206;&#x5B50;&#x306E;&#x30A2;&#x30BB;&#x30F3;&#x30D6;&#x30EA;&#x5185;&#x306B;&#x5358;&#x4E00;&#x30DC;&#x30AF;&#x30BB;&#x30EB;&#x7814;&#x7A76;&#x7D30;&#x80DE;&#x6A5F;&#x80FD;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7D30;&#x80DE;&#x30EC;&#x30D9;&#x30EB;&#x4E0B;&#x306E;&#x89E3;&#x50CF;&#x5EA6;&#x3067;&#x5149;&#x5B66;&#x7684;&#x306B;&#x900F;&#x660E;&#x306A;&#x7D44;&#x7E54;&#x3068;&#x306E;&#x901A;&#x4FE1;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x691C;&#x51FA;&#x3092;&#x53EF;&#x80FD;&#x3002; &#x306B;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x6211;&#x3005; &#x306F; 80 MHz &#x5E73;&#x5747;&#x8A08;&#x6570;&#x7387;&#x3068;&#x52B9;&#x7387;&#x7684;&#x306A;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x53CE;&#x96C6;&#x3068;&#x8A55;&#x4FA1;&#x306E;&#x305F;&#x3081;&#x306E;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30B6;&#x89E3;&#x6790;&#x6A5F;&#x80FD;&#x306F;&#x5C0F;&#x8AAC;&#x6642;&#x9593;&#x76F8;&#x95A2;&#x5358;&#x4E00;&#x5149;&#x5B50;&#x8A08;&#x6570; &#xFF08;&#x30D4;&#x30B3;&#xFF09; &#x5668;&#x304B;&#x3089;&#x6210;&#x308B;&#x9AD8;&#x901F; FLIM &#x306E;&#x30C6;&#x30AF;&#x30CB;&#x30C3;&#x30AF;&#x306B;&#x3064;&#x3044;&#x3066;&#x8AAC;&#x660E;&#x3057;&#x307E;&#x3059;&#x3002;&#x591A;&#x5149;&#x5B50;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x3068;&#x306E;&#x7D44;&#x307F;&#x5408;&#x308F;&#x305B;&#x3067;&#x3053;&#x306E;&#x30E1;&#x30BD;&#x30C3;&#x30C9;&#x306E;&#x6709;&#x52B9;&#x671F;&#x9593;&#x306E;&#x753B;&#x50CF;&#x306E;&#x53D6;&#x5F97;&#x3059;&#x3079;&#x3066; 1 2 s 3 D &#x30E9;&#x30A4;&#x30D6;&#x57F9;&#x990A;&#x7D44;&#x7E54;&#x306E;&#x3053;&#x3068;&#x304C;&#x3067;&#x304D;&#x307E;&#x3059;&#x3002;3 D &#x30BF;&#x30A4;&#x30E0;&#x30E9;&#x30D7;&#x30B9;&#x86CD;&#x5149;&#x5BFF;&#x547D;&#x30C7;&#x30FC;&#x30BF;&#x3044;&#x305F; 20 h &#x4EE5;&#x4E0A;&#x3092;&#x8CB7;&#x53CE;&#x3057;&#x3001;&#x6307;&#x6570;&#x95A2;&#x6570;&#x30D5;&#x30A3;&#x30C3;&#x30C6;&#x30A3;&#x30F3;&#x30B0;&#x3068;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30B6;&#x5206;&#x6790;&#x3092;&#x7528;&#x3044;&#x3066;&#x5206;&#x6790;&#x3057;&#x307E;&#x3057;&#x305F;&#x3002;&#x30D5;&#x30A7;&#x30FC;&#x30B6; &#x30D7;&#x30ED;&#x30C3;&#x30C8;&#x3092;&#x5B9F;&#x969B;&#x306E;&#x30A4;&#x30E1;&#x30FC;&#x30B8;&#x306E;&#x7279;&#x5B9A;&#x9818;&#x57DF;&#x3092;&#x95A2;&#x9023;&#x4ED8;&#x3051;&#x308B;&#x3053;&#x3068;&#x306B;&#x3088;&#x3063;&#x3066;&#x3001;3 D &#x30B3;&#x30E9;&#x30FC;&#x30B2;&#x30F3; &#x30DE;&#x30C8;&#x30EA;&#x30C3;&#x30AF;&#x30B9;&#x3001;&#x7D30;&#x80DE;&#x3001;&#x30C9;&#x30AD;&#x30BD;&#x30EB;&#x30D3;&#x30B7;&#x30F3;&#x306E;&#x5DEE;&#x5206;&#x5438;&#x53CE;&#x3068;&#x7D50;&#x679C;&#x306E;&#x7D30;&#x80DE;&#x4FB5;&#x5165;&#x3068;&#x30A2;&#x30DD;&#x30C8;&#x30FC;&#x30B7;&#x30B9;&#x8A98;&#x5C0E;&#x3078;&#x306E;&#x764C;&#x7D30;&#x80DE;&#x4FB5;&#x5165;&#x306B;&#x76F4;&#x63A5;&#x306E;&#x6D1E;&#x5BDF;&#x529B;&#x3092;&#x5F97;&#x305F;&#x3002;&#x9AD8;&#x901F;&#x96C6;&#x9332;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x7C21;&#x7565;&#x5316;&#x3055;&#x308C;&#x305F;&#x753B;&#x50CF;&#x306E;&#x5F8C;&#x51E6;&#x7406;&#x3068;&#x5B9A;&#x91CF;&#x5316;&#x306B;&#x57FA;&#x3065;&#x3044;&#x3066;&#x3001;&#x6642;&#x9593;&#x7D4C;&#x904E;&#x306E; 3 D FLIM &#x69CB;&#x9020;&#x3068;&#x30B9;&#x30DA;&#x30AF;&#x30C8;&#x30EB;&#x8907;&#x96D1;&#x306A;&#x7D30;&#x80DE;&#x3068;&#x7D44;&#x7E54;&#x30E2;&#x30C7;&#x30EB;&#x306E;&#x751F;&#x7269;&#x5B66;&#x7684;&#x51FA;&#x529B;&#x3068;&#x52D5;&#x614B;, 3 D &#x306E;&#x5730;&#x5F62;&#x3092;&#x76E3;&#x8996;&#x3059;&#x308B;&#x305F;&#x3081;&#x6C4E;&#x7528;&#x6027;&#x306E;&#x9AD8;&#x3044;&#x30A2;&#x30D7;&#x30ED;&#x30FC;&#x30C1;&#x3067;&#x3059;&#x3002;

&#x86CD;&#x5149;&#x5BFF;&#x547D;&#x9855;&#x5FAE;&#x93E1;&#x306B;&#x3088;&#x308B;&#x7D30;&#x80DE;&#x6BD2;&#x6027;&#x85AC;&#x5264;&#x914D;&#x9054;&#x304A;&#x3088;&#x3073;&#x816B;&#x760D;&#x7D30;&#x80DE;&#x6D78;&#x6F64;&#x306E;&#x3002;

&#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95; (FLIM) &#xC774;&#xBBF8;&#xC9D5; &#xD615;&#xAD11; &#xC218;&#xBA85; &#xC138;&#xD3EC; &#xAE30;&#xB2A5; &#xBC0F; &#xAD11;&#xD559; &#xD22C;&#xBA85; &#xD55C; &#xC870;&#xC9C1; subcellular &#xD574;&#xC0C1;&#xB3C4;&#xC640; &#xD1B5;&#xC2E0;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xB2E8;&#xC77C; voxel &#xB0B4;&#xC5D0;&#xC11C; &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xBD84;&#xC790; &#xC5B4;&#xC148;&#xBE14;&#xB9AC;&#xC758; &#xAC80;&#xC0C9;&#xC744; &#xC218; &#xC788;&#xC2B5;&#xB2C8;&#xB2E4;. &#xC6B0;&#xB9AC;&#xB294; &#xC18C;&#xC124; &#xC2DC;&#xAC04; &#xC0C1;&#xAD00; &#xB2E8;&#xC77C; &#xAD11;&#xC790; &#xACC4;&#xC218; (TCSPC) &#xAC80;&#xCD9C;&#xAE30;&#xC758; 80 MHz &#xD3C9;&#xADE0; &#xD69F;&#xC218; &#xC18D;&#xB3C4; &#xBCA1;&#xD130; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC704;&#xD55C; &#xD6A8;&#xC728;&#xC801;&#xC778; &#xB370;&#xC774;&#xD130; &#xC218;&#xC9D1; &#xBC0F; &#xD3C9;&#xAC00; &#xAD6C;&#xC131; &#xB41C; &#xBE60;&#xB978; FLIM &#xAE30;&#xC220;&#xC744; &#xC124;&#xBA85; &#xD569;&#xB2C8;&#xB2E4;. Multiphoton &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD;&#xACFC; &#xD568;&#xAED8;&#xC5D0;&#xC11C;&#xC774; &#xBC29;&#xBC95;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558;&#xBA74; &#xD3C9;&#xC0DD; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xC218;&#xC9D1; 3D &#xB77C;&#xC774;&#xBE0C; organotypic &#xC870;&#xC9C1; &#xBB38;&#xD654;&#xC5D0;&#xC11C; &#xB9E4;&#xC77C; 1-2 s. 3D &#xC2DC;&#xAC04; &#xACBD;&#xACFC; &#xD615;&#xAD11; &#xC218;&#xBA85; &#xB370;&#xC774;&#xD130; 20 h &#xC774;&#xC0C1; &#xCDE8;&#xB4DD; &#xD558; &#xACE0; &#xC9C0; &#xC218; &#xD53C;&#xD305; &#xBC0F; &#xBCA1;&#xD130; &#xBD84;&#xC11D;&#xC744; &#xC0AC;&#xC6A9; &#xD558; &#xC5EC; &#xBD84;&#xC11D; &#xD588;&#xB2E4;. &#xC2E4;&#xC81C; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0;&#xB97C; &#xBCA1;&#xD130; &#xD50C;&#xB86F;&#xC5D0;&#xC11C; &#xD2B9;&#xC815; &#xC601;&#xC5ED;&#xC744; &#xC5F0;&#xAD00; &#xD558; &#xC5EC; &#xC6B0;&#xB9AC; &#xC554; &#xC138;&#xD3EC; &#xCE68;&#xACF5; 3D &#xCF5C;&#xB77C;&#xAC90; &#xB9E4;&#xD2B8;&#xB9AD;&#xC2A4;, &#xC138;&#xD3EC;, &#xB3C5; &#xC18C; &#xB8E8;&#xBE44;&#xC758; &#xCC28;&#xB3D9; &#xAE00;&#xADC0;&#xC640; &#xC140;&#xC758; &#xCE68;&#xACF5;&#xACFC; apoptosis &#xC720;&#xB3C4;&#xC5D0; &#xACB0;&#xACFC;&#xC5D0; &#xC9C1;&#xC811;&#xC801;&#xC778; &#xD1B5;&#xCC30;&#xB825;&#xC744; &#xC5BB;&#xC744;. &#xBE60;&#xB978; &#xC218;&#xC9D1; &#xBC0F; &#xAC04;&#xB2E8;&#xD55C; &#xC774;&#xBBF8;&#xC9C0; &#xD6C4; &#xCC98;&#xB9AC; &#xBC0F; &#xBD80; &#xB7C9;&#xC5D0; &#xB530;&#xB77C; &#xC2DC;&#xAC04; &#xACBD;&#xACFC; 3D FLIM 3D &#xC9C0;&#xD615;, &#xC18D;&#xB3C4; &#xB860;, &#xADF8;&#xB9AC;&#xACE0; &#xAD6C;&#xC870;&#xC801;&#xC73C;&#xB85C; spectrally &#xBCF5;&#xC7A1; &#xD55C; &#xC138;&#xD3EC; &#xBC0F; &#xC870;&#xC9C1; &#xBAA8;&#xB378;&#xC758; &#xC0DD;&#xBB3C; &#xD559;&#xC801; &#xCD9C;&#xB825;&#xC744; &#xBAA8;&#xB2C8;&#xD130;&#xB9C1; &#xD558;&#xAE30; &#xC704;&#xD55C; &#xB2E4;&#xC591; &#xD55C; &#xC811;&#xADFC; &#xC774;&#xB2E4;.

&#xC885;&#xC591; &#xC138;&#xD3EC; &#xCE68;&#xC785;, &#xC57D;&#xBB3C; &#xC804;&#xB2EC; &#xBC0F; &#xC138;&#xD3EC; &#xB3C5;&#xC131;&#xC758; &#xD615;&#xAD11; &#xC218;&#xBA85; &#xD604;&#xBBF8;&#xACBD; &#xAC80;&#xC0AC; &#xBC95;.

Vida de fluorescencia im&aacute;genes de microscop&iacute;a (FLIM) permite la detecci&oacute;n de complejos conjuntos moleculares dentro de un &uacute;nico voxel para estudios de la funci&oacute;n de la c&eacute;lula y la comunicaci&oacute;n con resoluci&oacute;n subcelular en tejido &oacute;pticamente transparente. Describimos una t&eacute;cnica r&aacute;pida de FLIM que consta de un nuevo tiempo correlacionados del solo-fot&oacute;n cuenta (TCSPC) detector que presenta la tasa de conteo promedio de 80 MHz y el an&aacute;lisis del fasor de adquisici&oacute;n de datos eficiente y evaluaci&oacute;n. Este m&eacute;todo en combinaci&oacute;n con microscop&iacute;a multifot&oacute;n permite la adquisici&oacute;n de una imagen de vida cada 1-2 s en 3D organotypic en cultivo de tejidos. Fluorescencia de time-lapse 3D vida datos adquirida a lo largo de hasta 20 h y analizada mediante an&aacute;lisis de guarnici&oacute;n y fasor exponencial. Al correlacionar las &aacute;reas espec&iacute;ficas en el diagrama de fasores a la imagen real, obtuvimos la penetraci&oacute;n directa en la invasi&oacute;n de c&eacute;lulas de c&aacute;ncer en una matriz de col&aacute;geno 3D, la absorci&oacute;n diferencial de doxorrubicina por las c&eacute;lulas y las consecuencias de la invasi&oacute;n celular y la inducci&oacute;n de apoptosis. Basado en la r&aacute;pida adquisici&oacute;n y post-procesamiento de imagen simplificada y cuantificaci&oacute;n, time-lapse FLIM 3D es un enfoque vers&aacute;til para vigilar la topograf&iacute;a 3D, cin&eacute;tica y la producci&oacute;n biol&oacute;gica de modelos complejos estructuralmente y espectral de c&eacute;lulas y tejidos.

Microscop&iacute;a de fluorescencia de por vida de invasi&oacute;n de la c&eacute;lula del tumor, administraci&oacute;n de f&aacute;rmacos y citotoxicidad.

Cellular communication constitutes a fundamental mechanism of life, for instance by permitting transfer of information through synapses in the nervous system and by leading to activation of cells during the course of immune responses. Monitoring cell-cell interactions within living adult organisms is crucial in order to draw conclusions on their behavior with respect to the fate of cells, tissues and organs. Until now, there is no technology available that enables dynamic imaging deep within the tissue of living adult organisms at sub-cellular resolution, i.e. detection at the level of few protein molecules. Here we present a novel approach called multi-beam striped-illumination which applies for the first time the principle and advantages of structured-illumination, spatial modulation of the excitation pattern, to laser-scanning-microscopy. We use this approach in two-photon-microscopy--the most adequate optical deep-tissue imaging-technique. As compared to standard two-photon-microscopy, it achieves significant contrast enhancement and up to 3-fold improved axial resolution (optical sectioning) while photobleaching, photodamage and acquisition speed are similar. Its imaging depth is comparable to multifocal two-photon-microscopy and only slightly less than in standard single-beam two-photon-microscopy. Precisely, our studies within mouse lymph nodes demonstrated 216% improved axial and 23% improved lateral resolutions at a depth of 80 µm below the surface. Thus, we are for the first time able to visualize the dynamic interactions between B cells and immune complex deposits on follicular dendritic cells within germinal centers (GCs) of live mice. These interactions play a decisive role in the process of clonal selection, leading to affinity maturation of the humoral immune response. This novel high-resolution intravital microscopy method has a huge potential for numerous applications in neurosciences, immunology, cancer research and developmental biology. Moreover, our striped-illumination approach is able to improve the resolution of any laser-scanning-microscope, including confocal microscopes, by simply choosing an appropriate detector.

High-resolution intravital microscopy.

During mammalian development, a subpopulation of endothelial cells in the cardinal vein (CV) expresses lymphatic-specific genes and subsequently develops into the first lymphatic structures, collectively termed as lymph sacs. Budding, sprouting and ballooning of lymphatic endothelial cells (LECs) have been proposed to underlie the emergence of LECs from the CV, but the exact mechanisms of lymph vessel formation remain poorly understood. Applying selective plane illumination-based ultramicroscopy to entire wholemount-immunostained mouse embryos, we visualized the complete developing vascular system with cellular resolution. Here, we report emergence of the earliest detectable LECs as strings of loosely connected cells between the CV and superficial venous plexus. Subsequent aggregation of LECs resulted in formation of two distinct, previously unidentified lymphatic structures, the dorsal peripheral longitudinal lymphatic vessel (PLLV) and the ventral primordial thoracic duct (pTD), which at later stages formed a direct contact with the CV. Providing new insights into their function, we found vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) and the matrix component CCBE1 indispensable for LEC budding and migration. Altogether, we present a significantly more detailed view and novel model of early lymphatic development.

A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.

We report our efforts in identifying optimal scanning laser microscope parameters to study cells in three-dimensional culture. For this purpose we studied contrast of extracellular matrix (ECM) mimics, as well as signal attenuation, and bleaching of red and green fluorescent protein labeled cells. Confocal backscattering, second harmonic generation (SHG), and autofluorescence were sources of contrast in ECM mimics. All common ECM mimics exhibit contrast observable with confocal reflectance microscopy. SHG imaging on collagen I based hydrogels provides high contrast and good optical penetration depth. Agarose is a useful embedding medium because it allows for large optical penetration and exhibits minimal autofluorescence. We labeled breast cancer cells' outline with DsRed2 and nucleus with enhanced green fluorescent protein (eGFP). We observed significant difference both for the bleaching rates of eGFP and DsRed2 where bleaching is strongest during two-photon excitation (TPE) and smallest during confocal imaging. But for eGFP the bleaching rate difference is smaller than for DsRed2. After a few hundred microns depth in a collagen I hydrogel, TPE fluorescence of DsRed2 becomes twice as strong compared to confocal imaging. In fibrin and agarose gels, the imaging depth will need to be beyond 1 mm to notice a TPE advantage.

Intravital confocal and two-photon imaging of dual-color cells and extracellular matrix mimics.

Two-photon laser-scanning microscopy has revolutionized our view on vital processes by revealing motility and interaction patterns of various cell subsets in hardly accessible organs (e.g. brain) in living animals. However, current technology is still insufficient to elucidate the mechanisms of organ dysfunction as a prerequisite for developing new therapeutic strategies, since it renders only sparse information about the molecular basis of cellular response within tissues in health and disease. In the context of imaging, FÃ¶rster resonant energy transfer (FRET) is one of the most adequate tools to probe molecular mechanisms of cell function. As a calibration-free technique, fluorescence lifetime imaging (FLIM) is superior for quantifying FRET in vivo. Currently, its main limitation is the acquisition speed in the context of deep-tissue 3D and 4D imaging. Here we present a parallelized time-correlated single-photon counting point detector (p-TCSPC) (i) for dynamic single-beam scanning FLIM of large 3D areas on the range of hundreds of milliseconds relevant in the context of immune-induced pathologies as well as (ii) for ultrafast 2D FLIM in the range of tens of milliseconds, a scale relevant for cell physiology. We demonstrate its power in dynamic deep-tissue intravital imaging, as compared to multi-beam scanning time-gated FLIM suitable for fast data acquisition and compared to highly sensitive single-channel TCSPC adequate to detect low fluorescence signals. Using p-TCSPC, 256Ã—256 pixel FLIM maps (300Ã—300 Âµm(2)) are acquired within 468 ms while 131Ã—131 pixel FLIM maps (75Ã—75 Âµm(2)) can be acquired every 82 ms in 115 Âµm depth in the spinal cord of CerTN L15 mice. The CerTN L15 mice express a FRET-based Ca-biosensor in certain neuronal subsets. Our new technology allows us to perform time-lapse 3D intravital FLIM (4D FLIM) in the brain stem of CerTN L15 mice affected by experimental autoimmune encephalomyelitis and, thereby, to truly quantify neuronal dysfunction in neuroinflammation.

Article	Year
The power of single and multibeam two-photon microscopy for high-resolution and high-speed deep tissue and intravital imaging. Biophysical journal\| PubMed ID: 17557785	2007
Scattering suppression and confocal detection in multifocal multiphoton microscopy. Journal of biomedical optics\| PubMed ID: 17614718	2007
Intravital two-photon microscopy: focus on speed and time resolved imaging modalities. Immunological reviews\| PubMed ID: 18275472	2008
Infrared multiphoton microscopy: subcellular-resolved deep tissue imaging. Current opinion in biotechnology\| PubMed ID: 19324541	2009
Intravital two-photon microscopy of lymphatic vessel development and function using a transgenic Prox1 promoter-directed mOrange2 reporter mouse. Biochemical Society transactions\| PubMed ID: 22103506	2011
Fluorescence lifetime microscopy of tumor cell invasion, drug delivery, and cytotoxicity. Methods in enzymology\| PubMed ID: 22264531	2012
High-resolution intravital microscopy. PloS one\| PubMed ID: 23251402	2012
A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. The EMBO journal\| PubMed ID: 23299940	2013
Intravital confocal and two-photon imaging of dual-color cells and extracellular matrix mimics. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada\| PubMed ID: 23380006	2013
Parallelized TCSPC for dynamic intravital fluorescence lifetime imaging: quantifying neuronal dysfunction in neuroinflammation. PloS one\| PubMed ID: 23613717	2013

Volker Andresen

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