التصوير بالموجات فوق الصوتية الموجهة داخل القلب حقن لتطوير نموذج الفأر من الثدي الانبثاث سرطان الدماغ تلاه الطولية التصوير بالرنين المغناطيسي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام التوجيه بالموجات فوق الصوتية لإنشاء نموذج فأر لنقائل سرطان الثدي في الدماغ، والذي يمكن مراقبته لاحقاً بواسطة التصوير بالرنين المغناطيسي MRI. يتم تحقيق ذلك من خلال جمع خلايا سرطان الثدي المنجذبة للدماغ وحقنها في البطين الأيسر. ومن ثم تتم مراقبة تطور الورم داخل القحف بمساعدة التوجيه بالموجات فوق الصوتية.

باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) وتأكيد النقائل عن طريق صبغ الهيماتوكسيلين والإيوسين (h and e staining). وفي النهاية، يمكن أن يؤدي الحقن الدقيق الموجه بالتصوير إلى زيادة نجاح مراقبة تكوين وتطور النقائل الدماغية لسرطان الثدي بشكل كبير. كما يتيح التصوير بالرنين المغناطيسي الطولي مراقبة غير جراحية لتكوين وتطور سرطان الثدي.

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية في مركز جامعة تكساس ساوث ويسترن الطبي. لتحضير هذا البروتوكول، يجب تجهيز خلايا M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P المستزرعة في وسط DMEM يحتوي على 10%FBS و1%glutamine و1%penicillin وStreptomycin. يجب مراقبة حالة الخلايا باستمرار واستبدال الأوساط كل يومين إلى ثلاثة أيام. وعندما تصل درجة التلاقي إلى 80%confluence، يتم استخدام التربسين وهضم الخلايا ثم جمعها.

أولاً، قم بإزالة الوسط القديم تماماً باستخدام ماصة تفريغ. ثم أضف 5 milliliters من PBS لغسل الخلايا بلطف حتى يتم تغطية جميع الخلايا بـ PBS. بعد ذلك، قم بإزالة سائل الغسيل.

بعد ذلك، أضف 1.5 milliliters من trypsin إلى الطبق. قم بإمالة الطبق برفق لضمان تغطية جميع الخلايا بـ trypsin. ضع الطبق مرة أخرى في حاضنة الخلايا عند 37 degrees Celsius.

انتظر لمدة دقيقة واحدة، وافحص الخلايا تحت المجهر. إذا كانت الخلايا مستديرة وعائمة، فهذا يعني أنها قد انفصلت. أضف 3 mL من الوسط لإيقاف عملية الهضم، ثم انقل خليط الخلايا باستخدام الماصة إلى أنبوب طرد مركزي.

قم بطرد الخليط مركزياً عند 1,160 G لمدة خمس دقائق. ثم قم بإزالة الوسط بعناية باستخدام ماصة تفريغ. بعد ذلك، أعد تعليق الخلايا برفق في خمسة ملليلتر من وسط خالٍ من المصل باستخدام ماصة حتى لا تظهر أي كتل خلوية واضحة، ويبدو المحلول متجانساً عند سحب 50 µL من خليط الخلايا.

أضف 50 µL من صبغة تريبان الزرقاء بمجرد الخلط جيداً. أضف مقادير قدرها 10 µL إلى عدة شرائح عد الخلايا. ثم قم بعد الخلايا بناءً على قيم عداد الخلايا.

احسب واستخدم متوسط جميع عمليات العد المرة واحدة. الآن، قم بإعداد معلق خلوي أكثر دقة. قم بطردها مركزياً مرة أخرى وأعد تعليقها بتركيز 175,000 خلية لكل 100 µL من وسط خالٍ من المصل.

ثم تُحفظ الخلايا على الثلج تمهيداً للحقن داخل القلب. بالنسبة لهذا البروتوكول، تُستخدم إناث فئران BC nude، يتراوح عمرها بين ستة وثمانية أسابيع. قم بتسجيل الدخول إلى نظام التصوير وتهيئ المحول.

7 0 4 بتردد 40 megahertz. ابدأ دراسة جديدة واملأ مطالبات المعلومات وفقًا لذلك. بعد ذلك، قم بتخدير الفأر وإعطاء المخدر عبر مخروط أنفي.

أثناء عملية الحقن الموجه، اضبط درجة حرارة طاولة التصوير على 37 °C وثبّت الفأر على الطاولة باستخدام شريط لاصق في وضعية الاستلقاء الظهري. حافظ على هلام الموجات فوق الصوتية عند درجة حرارة 37 °C قبل التصوير، وضع كمية منه على صدر الفأر. الآن، قم بتركيب المحول في الحامل وخفضه إلى عمق التصوير المطلوب.

بعد ذلك، حرك المنصة حتى يتم تحديد البطين الأيسر باستخدام الأبهر الصاعد كعلامة استدلالية، ثم ثبت المنصة حيث تكون الرؤية في أوضح حالاتها. الآن، اسحب 100 µL من خليط الخلايا المبرد إلى سرنجة سعة 1 mL مع إبرة قياس 22 gauge. ثم قم بتثبيت السرنجة المحملة في حامل السرنجات.

بعد ذلك، حرّك المحقنة باتجاه الصدر. وقبل إدخالها في الفأر، حركها بعناية من جانب إلى آخر حتى تصبح طرف الإبرة ضمن مجال رؤية التصوير. اضبط ارتفاع الإبرة وزاويتها لاستهداف البطين الأيسر، وعندما تصبح في الموضع الصحيح، قم بإدخال الإبرة بسرعة عبر طبقات الجلد والعضلات وصولاً إلى البطين الأيسر.

تحت توجيه صورة الموجات فوق الصوتية، تكون علامة الإدخال الناجح في البطين الأيسر هي ارتداد الدم الشرياني الوردي الطازج إلى الحقنة. بعد ذلك، احقن خليط الخلايا ببطء عند الاكتمال، ثم اسحب الإبرة، وارفع المحول، ونظف جل الموجات فوق الصوتية باستخدام شاش مبلل. ثم حرر الحيوان من الشريط وانقله إلى قفص نظيف مزود بوسادة مسخنة مسبقاً.

راقب الفأر حتى يتعافى تماماً، وبعد ذلك افحصه يومياً لعدة أيام. باستخدام دقة مساحة 78 square micron، يمكن تحديد الآفات عالية الكثافة في التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) التي يبلغ قطرها 310 microns. ونظراً لأن النقائل في هذه الدراسة كانت صغيرة جداً وكان التنخر والوذمة في حدهما الأدنى، فإن الآفة عالية الكثافة في صور T two weighted مثلت الورم فعلياً.

تسمح دراسات التصوير بالرنين المغناطيسي الطولية واسعة النطاق بتقييم نمو الأورام في الجسم الحي بطريقة غير بضعية. تمكن التصوير بالرنين المغناطيسي عالي الدقة من اكتشاف عدة آفات صغيرة بعد ثلاثة أسابيع من الحقن داخل القلب، وفي الأسبوع الرابع، أصبحت جميع الآفات التي شوهدت في المسح السابق أكبر حجماً. كما ظهرت آفات جديدة إضافية في صور T2 weighted.

كشف صبغ H and e عن وجود آفات نقيلية منتشرة، أو كشف صبغ h and e عن وجود آفات نقيلية من النوع العنقودي. وغالباً ما لوحظ وجود أوعية دموية متضخمة حول الورم، مما يشير إلى حدوث عملية تكوين أوعية دموية غير برعمية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء حقن بالإبرة موجه بالتصوير بالموجات فوق الصوتية في البطين الأيسر لقلب الفأر.