منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

تنتج هذه التجربة فيروساتVaccinia معاد تركيبها وموسومة بفلورية من خلال طريقة نمطية وسريعة تعتمد على الانتقاء السائد العابر. أولاً، يتم إنشاء ناقل إعادة تركيب يحتوي على وسم فلوري محاط بمناطق تماثل دنيا مُصنّعة، بالإضافة إلى علامات للانتقاء الاستقلابي والفلوري. يتم ترنيق ناقل إعادة التركيب هذا في خلايا مصابة وتضخيم الفيروسات معاد التركيب باستخدام الانتقاء الاستقلابي والفلورية. بعد ذلك، يتم إزالة الانتقاء الاستقلابي لاستئصال كاسيت العلامة وعزل الخلايا التي تحتوي على الفيروسات معاد التركيب عن طريق الانتقاء باستخدام العلامة الفلورية. وتسمح نتائج اللويحات الفيروسية على الطبقات الخلوية الأحادية بتصور جزيئات الفيروس الفردية التي تميز الجين الموسوم فلورياً.

لقد طورنا هذه الطريقة لرغبتنا في إنتاج فيروسات مأشوبة ذات تعديلات جينية متعددة باستخدام طريقة اصطفاء يمكن استخدامها بشكل متكرر وعام بغض النظر عن الوسم المستخدم. وبينما تم وصف مبدأ الاصطفاء السائد العابر سابقاً، فقد أردنا تطبيقه على نطاق أوسع وبأسلوب نمطي لمنحنا مرونة أكبر في إجراء التعديلات الجينومية. ويعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية لأن فحص وعزل اللويحات الفيروسية المأشوبة قد يكون أمراً صعباً، حيث يمكن أن يكون تردد ظهورها منخفضاً، وبالتالي تبرز الحاجة إلى طرق فريدة لاستعادة الفيروس بكفاءة.

قم بوسم الجين الفيروسي المستهدف عند الطرف N أو C للبروتين. وبناءً على ذلك، حدد مناطق تماثل محيطة بطول 150 زوجاً قاعدياً. ثم صمم تسلسلاً من قليلة النيوكليوتيد (oligonucleotide) يشتمل على الذراعين اليسرى واليمنى بطول 150 زوجاً قاعدياً، يفصلهما زوج من مواقع التقييد المختارة. وقم أيضاً بإحاطة هذه المنطقة بزوج ثانٍ من مواقع التقييد المختلفة عن الزوج الأول للسماح بدمجها في ناقل TDS بمجرد تخليقها. والآن تحقق من أن قليلة النيوكليوتيد التي تحتوي على مواقع التقييد قد صُممت لتكون في نفس إطار القراءة (in frame) مع موقع الإدراج المطلوب. ولتخليق قليلة النيوكليوتيد، تأكد من أن مواقع التقييد المدرجة بين الذراعين اليسرى واليمنى تطابق تلك التي تحيط بإطار القراءة المفتوح لوسم الفلورسنت المختار. وقم بإدراج مواقع التقييد نفسها على كلا جانبي وسم الفلورسنت عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ثم قم باستنساخ القطعة المُخلقة في ناقل TDS. وقم أيضاً باستنساخ وسم الفلورسنت في ناقل إعادة التركيب الناتج باستخدام مواقع التقييد الموجودة بين منطقتي التماثل للذراع اليسرى واليمنى. وأخيراً، قم بإصابة طبقة أحادية من خلايا BS-C-one بفيروس vaccinia في وسط خالٍ من السيروم.

بعد ساعة واحدة من العدوى، قم بإنقاذ الخلايا باستخدام وسط Dulbecco's modified eagle medium. قم بإجراء عملية عفن (Transfection) باستخدام خليط من بلازميد ناقل إعادة التركيب وكواشف العفن بنسبة ثلاثة إلى واحد في وسط خالٍ من السيروم. بعد 24 ساعة، قم بكشط واستعادة الخلايا في وسط DMEM لا يحتوي على مصل جنين البقر (fetal bovine serum). أخضع الخلايا لثلاث دورات من التجميد والإذابة لتمزيق الخلايا وتحرير الجسيمات الفيروسية. بعد ذلك، وللحصول على فصل كافٍ للبقع الفردية، قم بإصابة طبقات أحادية من خلايا BS-C-one ذات تلاقي بنسبة 100% بتخفيفات متسلسلة من تحضير الجسيمات الفيروسية. قم بالتغطية بطبقة من 10% FBS السائل وDMEM بالإضافة إلى كواشف اختيار GPT، ثم قم بالتحضين لمدة 24 ساعة.

قم بشفط الطبقة السائلة العلوية واستخدم مجهراً فلورياً للبحث عن اللويحات التي تظهر فلورة حمراء منتشرة، مما يشير إلى دمج M-cherry من ناقل TDS في الفيروس. وبناءً على الجين المستهدف ووسم الفلورة المختار، قد يُلاحظ أيضاً وجود فلورة موضعية للجين الوسم في نفس اللويحة الحمراء.

الآن، لاختيار عدة لويحات لكل فيروس مأشوب، قم بكشطها باستخدام طرف الماصة وانقل الخلايا إلى أنبوب Eppendorf باستخدام 100 µL من وسط DMEM الذي يحتوي على 5% FBS. قم بإجراء ثلاث دورات من التجميد والإذابة للخلايا المكتشطة لتحرير الفيروسات المأشوبة.

أضف وسط DMEM المحتوي على الفيروس الذي تم تجميده وإذابته إلى طبقة أحادية من الخلايا في طبق مكون من 12 بئراً لتكثير الفيروسات المؤتلفة باستخدام كواشف اختيار GPT في وسط النمو. بعد ذلك، قم بكشط عمليات التكثير الناجحة بعد 24 ساعة من العدوى. ولإجراء مقايسة اللويحات للويحات التي تم تكثيرها بنجاح والتي تظهر فلورة حمراء، قم بزرع طبقة أحادية من خلايا BS-C-one في طبق مكون من ستة آبار.

قم بإجراء تخفيف تسلسلي للفيروسات المؤتلفة وصيب الآبار بتخفيفات متزايدة من الفيروسات في وسط DMEM الخالي من مصل الجنين البقري (FBS). بعد مرور ساعة واحدة من الإصابة، قم بإزالة الوسط السائل وغطِّ كل بئر بطبقة من الأجاروز بتركيز 0.5% في وسط أساسي أدنى كامل. بعد ثلاثة أيام من الإصابة، اختر اللويحات التي تظهر فلورية باللون الأحمر وباللون الخاص بعلامة الفلورية المختارة.

قم بتضخيم هذه اللويحات مرة أخرى دون استخدام انتخاب GPT. اختر اللويحات التي فقدت تألقها الأحمر المنتشر، ولكنها احتفظت بالتألق الموضعي المقابل للوسم المختار. استمر في تنقية اللويحات دون انتخاب للحصول على مخزون نقي من الفيروسات المعاد تركيبها التي فقدت جينات M-cherry وانتخاب GPT، ولكنها احتفظت بالتألق الموضعي المقابل للوسم المختار.

قيم نقاوة المخزونات باستخدام مقايسة اللويحات بهدف الحصول على لويحات ذات نمط ظاهري متشابه. قم بتضخيم المخزونات الفيروسية المختبرة في طبقة أحادية من خلايا BS-C-one. بعد 24 ساعة من الإصابة، قم بكشط الخلايا المصابة في 250 µL من DMEM. قم بطرد مركزي للخلايا المصابة، وأزل الطافي ثم أعد تعليق الراسب الخلوي في 500 µL من 0.1% SDS في منظم TE. استخدم جهاز الـ Vortex لتحليل الخلايا. بعد ذلك، أضف 500 µL من الفينول والكلوروفورم وكحول الإيزواميل، وقم بالقلب للمزج. قم بالطرد المركزي. اجمع الطور العلوي وكرر عملية الاستخلاص.

ثم لترسيب الـ DNA من الطبقة المائية، أضف 1 mL من الإيثانول المبرد بتركيز 100% و 50 µL من أسيتات الصوديوم. اخلط المزيج عن طريق القلب ثم ضع العينة في درجة حرارة -20 °C طوال الليل. بعد تجميع الـ DNA في شكل قرص عن طريق الطرد المركزي، أزل جميع السوائل وجفف قرص الـ DNA بالهواء ثم أعد تعليقه في 50 µL من محلول TE المنظم. استخدم قالب الـ DNA الجينومي هذا لإجراء فحص PCR للتحقق من الإدخال الفيروسي. قم بإنتاج فيروسات مأشوبة تحتوي على وسوم متعددة كما هو مفصل في البروتوكول النصي.

تعبر فيروسات الفاكسينيا المعاد تركيب هذه عن بروتينات وسمت بعلامات فلورية تستهدف البروتينات التركيبية الفيروسية، A3 وF13، واللذين يشكلان جزءاً من اللب الفيروسي الداخلي والغلاف الخارجي على التوالي. وقد تم اختيار الجينات المقابلة للبروتينات المتموضعة في الفيريون لتصوير الجسيمات الفيروسية. يعد A3 بروتيناً لبياً في فيريون الفاكسينيا، بينما يعد F13 بروتيناً في الغلاف الفيروسي.

يظهر أيضاً فيروس يحمل علامتين مزدوجتين، حيث تم وسم كل من A3 وF13 بصبغات فلورية. يمكن إجراء مجهرية الفلورة في الوقت الحقيقي باستخدام فيروس مُوسوم ثنائياً. وفي هذه الحالة، تم وسم البروتين اللبي الداخلي لفيروس vaccinia بـ A3 باللون الأحمر، بينما وُسم بروتين الغلاف الخارجي F13 باللون الأخضر.

تظهر جزيئات الفيروس غير المغلفة من مصنع الفيروسات باللون الأحمر، بينما تُمثَّل الفيريونات المغلفة من خلال التوضع المشترك للقناتين الحمراء والخضراء. استُخدم التحليل الكمي لتحديد كفاءات إعادة الاندماج بين النواقل المؤشبة وجينوم فيروس الجدري. ويمكن الكشف عن كفاءة إعادة الاندماج المتماثل للنواقل مع جينوم فيروس الجدري بمناطق تماثل قصيرة تصل إلى 70 base pair.

استُخدمت هذه الطريقة لإنشاء فيروسات تحتوي على وسوم فلورية متعددة و/أو عمليات حذف جينية متعددة. وقد وُظفت هذه الفيروسات في دراسة دورة حياة الفيروس المعدية، ودور البروتينات الفيروسية في تقويض أنظمة الدفاع لدى المضيف، بالإضافة إلى التفاعلات مع عمليات إرسال الإشارات في المضيف. بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد فيروسات vaccinia مأشوبة باستخدام طريقة تتميز بكونها تركيبية في الوسوم المستخدمة، ودقيقة في فصل المأشوبات المطلوبة، وقابلة للتطبيق في مجموعة متنوعة من سياقات البحث.