منهجية لتوليد كفاءة من البروتينات فيروس Vaccinia الموسومة الفلورية

تولد هذه التجربة فيروسات EO المؤتلفة المصنفة فلورسنت من خلال طريقة معيارية وسريعة تعتمد على الانتقاء السائد العابر. أولا ، قم بإنشاء ناقل مؤتلف يحتوي على علامة فلورية محاطة بمناطق دنيا مركبة من التماثل ، بالإضافة إلى علامات لاختيار التمثيل الغذائي والفلورسنت. قم بنقل ناقل إعادة التركيب هذا إلى الخلايا المصابة وتضخيمه للفيروسات المؤتلفة باستخدام الانتقاء الأيضي والتألق.

بعد ذلك ، قم بإزالة الاختيار الأيضي لاستئصال كاسيت العلامة وعزل الخلايا التي تحتوي على فيروسات مؤتلفة بواسطة علامة الفلورسنت. إنتخاب. تسمح نتائج اللويحات الفيروسية على الطبقات الأحادية للخلية بتصور جزيئات الفيروس الفردية التي تتميز بالجين الموسوم بالفلورسنت. لقد طورنا هذه الطريقة لأننا أردنا توليد فيروسات مؤتلفة ذات تعديلات جينية متعددة باستخدام طريقة اختيار يمكن استخدامها بشكل متكرر وعالمي بغض النظر عن العلامة.

بينما تم وصف مبدأ الانتقاء المهيمن العابر سابقا ، أردنا تطبيقه على نطاق أوسع وبطريقة معيارية لمنحنا مزيدا من المرونة في إجراء تعديلات جينومية يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية لأن فحص اللويحات الفيروسية المؤتلفة والعزل قد يكون أمرا صعبا. يمكن أن يكون تواترها منخفضا ، وبالتالي هناك حاجة إلى بعض الطرق الفريدة للتعافي الفعال من الفيروس.

لذلك تم تسمية الجين الفيروسي ذي الأهمية في الطرف N أو C للبروتين. وفقا لذلك ، حدد 150 زوجا أساسيا من المناطق المحيطة بطول التماثل. ثم صمم تسلسلا قليل النوكليوتيدات يتألف من 150 زوجا أساسيا من الذراعين الأيمن والأيسر ، مفصولة بزوج من مواقع التقييد المفضلة.

قم أيضا بإحاطة هذه المنطقة بزوج ثان من مواقع التقييد التي تختلف عن الزوج الأول للسماح بالدمج في متجه TDS. بمجرد التصنيعه ، تحقق الآن من أن قليل النوكليوتيد مع مواقع التقييد مصمم ليكون في إطار مع موقع الإدخال المطلوب. لتخليق قليل النوكليوتيدات ، تأكد من مواقع التقييد المدمجة بين الذراعين الأيمن والأيسر.

تطابق مع أولئك الذين يحيطون بإطار القراءة المفتوح لعلامة التألق المفضلة. قم بدمج مواقع التقييد نفسها على جانبي علامة التألق بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). استنساخ الجزء المركب في متجه TDS.

استنساخ علامة التألق أيضا في ناقل إعادة التركيب الناتج باستخدام مواقع التقييد بين الذراع الأيسر والأيمن. مناطق التماثل. تصيب طبقة واحدة من خلايا BSC بفيروس اللقاح والوسائط الخالية من المصل.

بعد ساعة واحدة من الإصابة. أنقذ الخلايا باستخدام ECCOs المعدل متوسط النسر المعدل بمزيج من إعادة التركيب ، وبلازميد الناقل ، وكواشف التعدي بنسبة ثلاثة إلى واحد في الوسائط الخالية من المصل. بعد 24 ساعة ، اكشط واستعادة الخلايا في DMEM التي لا تحتوي على مصل بقري جنيني.

أخضع الخلايا لثلاث دورات ذوبان مجانية لكسر الخلايا المفتوحة وإطلاق جزيئات الفيروس بعد ذلك للحصول على فصل مناسب للويحات الفردية. تصيب 100٪ طبقات أحادية الخلية المتجمعة من الخلايا الواحدة BSC مع التخفيفات التسلسلية لتحضير جزيئات الفيروس. تراكب مع سائل 10٪ FBS و DMEM بالإضافة إلى اختيار GPT والكواشف واحتضانها لمدة 24 ساعة.

قم بشفط تراكب السائل واستخدم مجهر الفلورسنت للبحث عن اللويحات. إظهار تألق أحمر منتشر يتوافق مع دمج الكرز M من ناقل TDS في الفيروس. اعتمادا على الجين المستهدف وعلامة التألق المختارة ، يمكن أيضا ملاحظة التألق الموضعي لجين العلامة في نفس اللويحة الحمراء.

الآن لاختيار لويحات متعددة لكل فيروس مؤتلف ، اكشط بطرف الماصة ومع 100 ميكرولتر من 5٪ FBS يحتوي على DMEM نقل الخلايا إلى أنبوب einor. قم بإجراء ثلاث جولات من تجميد الذوبان للخلايا المكشطة. لإطلاق الفيروسات المؤتلفة.

أضف DMEM الذي يحتوي على فيروس مذاب بالتجميد إلى طبقة أحادية من الخلايا. في صفيحة 12 بئر لتضخيم الفيروسات المؤتلفة باستخدام كواشف اختيار GPT في وسط النمو. ثم كشط التضخيمات الناجحة في 24 ساعة بعد الإصابة لاختبار البلاك للويحات المضخمة بنجاح ، وتظهر مضان أحمر C اثنين ستة ، يتم لعبها بشكل جيد مع طبقة أحادية من الخلايا BSC واحدة.

قم بإجراء التخفيف التسلسلي للفيروسات المؤتلفة وإصابة الآبار بتخفيف متزايد للفيروسات في DME M1 الخالية من FBS بعد ساعة من الإصابة. قم بإزالة الوسائط السائلة وتراكب كل بئر بنسبة 0.5٪ agros في الحد الأدنى الكامل من الوسط الأساسي بعد ثلاثة أيام من الإصابة. اختر اللوحات التي تعرض التألق الأحمر ولون علامة التألق المختارة.

قم بتضخيمها مرة أخرى دون اختيار GPT. اختر اللويحات التي فقدت تألقها الأحمر المنتشر ، ولكن احتفظ بالتألق الموضعي المقابل للعلامة المختارة. استمر في تنقية البلاك بدون اختيار للحصول على مخزون نقي من الفيروسات المؤتلفة التي فقدت جينات اختيار M cherry و GPT ، ولكنها تحتفظ بالتألق الموضعي المقابل للعلامة المختارة.

قم بتقييم نقاء الأسهم باستخدام مقايسة البلاك التي تهدف إلى جميع اللويحات ذات النمط الظاهري المماثل للويحة. تضخيم مخزون الاختبار الفيروسي في طبقة أحادية من خلايا BSC واحدة. بعد 24 ساعة من الإصابة ، اكشط الخلايا المصابة إلى 250 ميكرولتر من أجهزة الطرد المركزي DMEM للخلايا المصابة.

قم بإزالة supernat وإعادة تعليق حبيبات الخلية في 500 ميكرولتر من 0.1٪ SDS في دوامة عازلة TE لتحلل الخلايا. ثم أضف 500 ميكرولتر من الفينول والكلوروفورم وكحول الأيزواميل واقلبها لخلط أجهزة الطرد المركزي. احصد المرحلة العليا وكرر الاستخراج.

ثم لترسيب الحمض النووي من الطبقة المائية ، أضف ملليلترا واحدا من الإيثانول المبرد و 100٪ و 50 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم. امزج عن طريق الانعكاس وضع العينة على سالب 20 درجة مئوية طوال الليل. بعد تكوير الحمض النووي عن طريق الطرد المركزي, قم بإزالة كل السائل والهواء يجفف حبيبات الحمض النووي وإعادة التحرير.

قم بتعليقه في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE. استخدم قالب الحمض النووي الجيني هذا لفحص تفاعل البوليميراز المتسلسل لإدخال الفيروس. قم بإنشاء فيروسات مؤتلفة بعلامات متعددة كما هو مفصل في بروتوكول النص.

تعبر فيروسات اللقاح المؤتلفة هذه عن بروتينات موسومة بعلامات فلورية تستهدف البروتينات الهيكلية الفيروسية ، A three و F 13 ، والتي تعد جزءا من قلب الفيروس الداخلي والغلاف الخارجي على التوالي. تم اختيار الجينات المقابلة للبروتينات الموضعية للفيريون لتصور جزيئات الفيروس. A Three هو بروتين أساسي لفيروس اللقاح ، و F 13 هو بروتين مغلف فيروسي.

أيضا فيروس مزدوج العلامات مع كل من المسمى بالفلورسنت A three و F 13 ، ويمكن إجراء الفحص المجهري الفلوري في الوقت الفعلي باستخدام فيروس مزدوج المسمى. في هذه الحالة ، البروتين الأساسي الداخلي لفيروس اللقاح. تم تسمية الثلاثة باللون الأحمر وبروتين الغلاف الخارجي F 13 باللون الأخضر.

يتم تصور جزيئات الفيروس غير المغلفة من مصنع الفيروسات باللون الأحمر ويتم تمثيل الفيروس الملفوف من خلال تحديد موقع القنوات الحمراء والخضراء. تم استخدام التحليل الكمي لتحديد كفاءات إعادة التركيب بين النواقل المؤتلفة وجينوم فيروس اللقاح. يمكن الكشف عن كفاءة إعادة التركيب المتماثل للنواقل مع جينوم فيروس اللقاح مع 70 منطقة زوج أساسي من التماثل.

تم استخدام هذه الطريقة لإنشاء فيروسات ذات علامات فلورية متعددة و / أو عمليات حذف جينية متعددة. وقد تم استخدام هذه في دراسة دورة الحياة المعدية للفيروس، ودور البروتينات الفيروسية في تخريب أنظمة الدفاع عن المضيف، فضلا عن التفاعلات مع عمليات إشارات المضيف. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية توليد فيروسات اللقاح المؤتلفة باستخدام طريقة معيارية في العلامات المستخدمة ، ودقيقة في حل المؤتلفات المرغوبة وقابلة للتطبيق في مجموعة متنوعة من سياقات البحث.