بدء النقيلي سرطان الثدي عن طريق استهداف ظهارة الأقنية مع اتش، لجنة المساواة العرقية: رواية المعدلة وراثيا نموذج الفأر من سرطان الثدي

الهدف العام من التجربة التالية هو تطوير نموذج فأر لسرطان الثدي ينتقل في النهاية في وجود جهاز مناعة صحي. يتم تحقيق ذلك أولا عن طريق إعطاء كري الذي يعبر عن الفيروس الغدي في قناة الأقنية الثديية لحيوانات التجارب. ثم يتم تحسس الغدة الثديية بانتظام لمراقبة تطور الورم.

في النهاية ، يمكن تقييم ورم خبيث للورم وتسلل الكريات البيض إلى العقدة الليمفاوية الإبطية عن طريق تحليل التدفق الخلوي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على نماذج أورام الثدي الحالية هي أنها تسمح بالبدء الدقيق للأورام التي يمكن أن تتطور في وجود جهاز مناعي ناضج ، والتي يمكن تتبعها عن طريق تعبير YFP. يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية حيث يصعب تعلم خطوات الحقن التمهيدي.

يتطلب الوضع الصحيح للإبرة الدقة والممارسة. في يوم التجربة ، قم بتخزين Eloqua من أربعة أضعاف 10 من وحدات تشكيل اللويحات الثامنة من الفيروس الغدي Cree على الجليد الجاف ، وقم بإذابة درجة حرارة الغرفة التي حددتها الفيروس واخلطها مع ما يكفي من 3٪ من السكروز في ماء معقم ليصل الحجم النهائي إلى 10 ميكرولتر. بعد ذلك ، امزج برفق 34 ميكرولترا من mem وأربعة ميكرولترات من كلوريد الكالسيوم المحضر حديثا في الفيروس واحتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة.

بعد 15 إلى 20 دقيقة ، ستظهر الوسائط غائمة مما يشير إلى تكوين رواسب الفيروس الغدي. قم بنفض الأنبوب برفق للتأكد من توزيع جزيئات الفيروس بالتساوي في جميع أنحاء التعليق ، ثم لحقن جزيئات الفيروس ، قم بسحب ثلاثة ميكرولترات من الفيروس في حقنة سعة 10 ميكرولتر. بعد ذلك ، ضع فأرة مخدرة على ظهره على المسرح المضيء لمجهر تشريح نظيف.

أضيء البطن بمصدر ضوء إضافي وحدد موقع الغدة الثديية الأربية اليسرى الرابعة أو التاسعة اليمنى من خلال البقع البيضاء الصغيرة من الفراء المحيطة بكل حلمة. الآن افركي الحلمة برفق باستخدام قضيب قطني معقم مبلل بالإيثانول. ثم قم بتأمين الحلمة بالملقط الجراحي الناعم واسحبها بقوة خفيفة.

لإزالة سدادة الكيراتين ، قم بتثبيت الحلمة بين الملقط وأدخل الإبرة برفق بين الأطراف. قم بتسلية قناة القناة بزاوية 90 درجة لضمان العمق المناسب للحقن ، اسحب الإبرة برفق لأعلى بعد إدخالها في تجويف القناة ، وسحب الحلمة لأعلى على طول حواف الإبرة أثناء سحبها لأعلى. عندما يتم وضع الإبرة بشكل مناسب ، اغمر محتويات المحقنة بالكامل برفق.

يجب أن تنتفخ الحلمة قليلا عند إضافة السائل. بعد الحقن ، ضع الماوس مرة أخرى على وسادة التدفئة حتى يبدأ في التعافي من التخدير. ثم ضع مرة أخرى في قفص نظيف وراقبه حتى يلاحظ الشفاء التام.

ملامسة غدة الذاكرة المحقونة في اليوم 30 لتقييم تضخم وتورم الغدة. راقب تطور الورم كل خمسة إلى سبعة أيام. بمجرد ملاحظة تورم وتضخم الغدة الثديية ، قم بقياس أحجام الورم كل ثلاثة إلى أربعة أيام بحثا عن حركية نمو الورم.

بمجرد ظهور الأورام الملموسة ، يمكن تصور الاستهداف الناجح لشجرة الأقنية الثديية عن طريق تحضير حوامل كاملة من الغدة الثديية بعد حقن الرحلة والأزرق للتحقق من الحقن المناسب أو بعد حقن الفيروس الغدي الذي يعبر عن الكرز M للتحقق من التحضير الفيروسي المناسب وعدوى الخلايا الظهارية الدكتاليل. عندما يتم إحداث الأورام في الفئران المعدلة وراثيا F Fluxed P 53 LSLK RAs ، لن تظهر الأورام الأولية حتى حوالي اليوم 40 عندما تتضخم الغدد الثديية وتتورم. بدءا من اليوم 56 تقريبا ، ستبدأ الأورام في النمو بشكل كبير.

في هذه المرحلة ، من الأهمية بمكان قياس أحجام الورم كل ثلاثة أيام. إذا كانت الدراسات الحركية مطلوبة ، حيث سيكون هناك بعض التباين الطبيعي في تطور الورم ، ستظهر كتل البطن الكبيرة بحلول اليوم 80 وبعد ذلك يجب قتل الفئران الرحيم إذا تجاوزت الأورام أكثر من 10٪ من وزن جسم. كشف تحليل CDNA لثلاثة خطوط خلوية مشتقة من أورام الثدي في التدفق P 53 LSL KRAS أن الأورام تعبر عن السيتوكيراتين الميزوثيلين ثمانية ، واثنين من مستقبلات هرمون الاستروجين الجديدة HER ، على غرار البيئة المكروية الخلوية في تسلل سرطان الثدي البشري لخلايا ألفا وبيتا وجاما دلتا التائية ، بالإضافة إلى الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع والضامة في الأورام.

سيبدأ تصريف الأوعية الدموية إلى العقدة الليمفاوية الإبطية في الاحتقان قبل نمو الأورام ويشمل في النهاية أنسجة الذاكرة بأكملها حيث تم إجراء الحقن. سيكون هناك احتقان واضح في الوريد الشرسوفي السطحي بين الغدد الليمفاوية الأربية والإبطية أيضا. بعد سبعة إلى ثمانية أسابيع ، تتضخم العقدة الليمفاوية الإبطية بسبب الغزو الليمفاوي الوعائي للخلايا السرطانية.

يمكن تتبع الغزو الليمفاوي الوعائي والورم الخبيث للخلايا السرطانية عن طريق عبور الفئران المعدلة وراثيا P-53 LSLK RAs مع الفئران L-S-L-E-Y-F-P. بعد الاستئصال المسبق ، يتم الكشف عن خلايا الاستئصال التي تعبر عن مستويات عالية ومنخفضة من YFP في الورم ويمكن إرجاع ورم خبيث إلى العقدة الليمفاوية الإبطية المستنزفة. بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية على مجموعة تجريبية من 20 فأرا في ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

باتباع هذا الإجراء ، يمكن تطوير نماذج أخرى للورم عن طريق تربية الفئران ذات الأقفال الإضافية ، p الجينات المعدلة وراثيا ، للإجابة على أسئلة مثل ، كيف تؤثر الجينات المسرطنة المختلفة على علم الأمراض والبيئة المكروية المناعية والغزو النقيلي لسرطان الثدي.