النخاعي السوائل عن طريق الرنا الميكروي التنميط الكمي في الوقت الحقيقي PCR

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ملامح microRNAs في السوائل الدماغية عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي وتحليل البيانات باستخدام برنامج Gen X الاحترافي. يتم تحقيق ذلك عن طريق عزل الحمض النووي الريبي الكلي أولا من عينات السائل النخاعي الدماغي. الخطوة الثانية هي إجراء النسخ العكسي من أجل نسخ الحمض النووي الريبي إلى CDNAs.

بعد ذلك ، يتم خلط CDNAs مع مزيج رئيسي أخضر إلكتروني يتم تحميله في 384 لوحة بئر تحتوي على مواد أولية ل 742 تسلسلا فريدا ويتم تضخيمها باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي. الخطوة الأخيرة هي تحليل البيانات التي تم الحصول عليها من التضخيم في الوقت الفعلي. في النهاية ، يمكن التعبير عن النتائج على أنها تغيير طية أو زيادة أو نقصان على عنصر تحكم ، وتصورها في تمثيلات رسومية مختلفة.

لذا فإن الميزة الرئيسية لتقنيتنا على الطرق الحالية مثل مصفوفات الرقائق هي أن طريقتنا شديدة الحساسية وتتطلب الحد الأدنى من الحمض النووي الريبي. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب الكمية الكبيرة من البيانات التي تم إنشاؤها واستخدام البرنامج لتحليل البيانات. أولا ، رش منطقة العمل والماصات باستخدام RNA Zap.

للبدء ، يخفف تخليق CDNA عينات الحمض النووي الريبي النموذجية إلى تركيز خمسة نانوغرام لكل ميكرولتر بماء خال من النوكلياز. بعد ذلك ، ضع المخزن المؤقت للتفاعل خمسة x برفق على الجليد لإذابة الجليد. ثم أضف 40 ميكرولترا من الماء الخالي من النوكلياز إلى ارتفاع الحمض النووي الريبي لإعادة تعليق الكاشف ، وقم بدوامة الأنبوب واتركه على الجليد لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بإزالة الإنزيمات من الثلاجة ، ونفض الغبار عن الأنابيب وضعها على الجليد. أيضا ، بمجرد إذابة جميع الكواشف ، قم بتدويرها بسرعة. قم بإعداد محلول عمل النسخ العكسي في أنبوب eph سعة 1.5 مليلتر عن طريق إضافة إنزيم عازلة التفاعل خمسة ×.

امزج الماء الخالي من نوكلياز وارتفاع الحمض النووي الريبي في القالب باستخدام النسب الموضحة في الجدول الأول. بعد ذلك ، امزج محلول العمل عن طريق تدويره لمدة ثانية إلى ثانيتين بأقصى سرعة. قم بتدوير المحلول لفترة وجيزة لمدة 10 ثوان ، ثم قم بتوزيع محلول العمل في أنابيب PCR خالية من النوكلياز.

ثم أضف قالب الحمض النووي الريبي مباشرة إلى أنابيب PCR. قم بدوامة التفاعل برفق لمدة ثانية إلى ثانيتين للتأكد من خلط جميع الكواشف جيدا وتدويرها لأسفل الأنابيب لمدة 10 ثوان. ضع العينة في جهاز PCR وأدخل الإعدادات الموضحة هنا.

ثم ابدأ البرنامج بعد النسخ الرجعي. CDNA جاهز لتضخيم PCR في الوقت الفعلي ويمكن تخزينه عند سالب 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى خمسة أسابيع. لبدء تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي ، ضع أولا مزيج CDNA و PCR الرئيسي على الثلج.

لإذابة الجليد ، قم بحماية قوارير المزيج الرئيسية PCR من الضوء عن طريق تغطيتها بورق الألمنيوم أثناء ذوبانها. بمجرد إذابة الدوامة ، يمزج تفاعل البوليميراز المتسلسل الرئيسي لمدة ثانية إلى ثانيتين. بعد ذلك ، اجمع بين 2000 ميكرولتر من مزيجين رئيسيين XPCR و 1 ، 980 ميكرولتر من الماء في أنبوب مخروطي سعة 15 مل.

أضف 20 ميكرولترا من CDNA إلى الخليط وقم بتدوير المحاليل برفق لمدة ثانية إلى ثانيتين. ثم قم بتدوير المحاليل في جهاز طرد مركزي مبرد عند 1 ، 500 مرة جم لمدة دقيقة واحدة عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك، ضع مزيج تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في خزان ماصة متعدد القنوات.

قم بتدوير الألواح الجاهزة للاستخدام لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي مبرد عند 1,500 مرة جم قبل إزالة مانع تسرب اللوحة. ثم قم بتوزيع 10 ميكرولتر من مزيج PCR الرئيسي الذي يحتوي على CD NA لكل بئر من لوحة 384 بئر. باستخدام ماصة 16 قناة وختم اللوحة بغشاء مانع للتسرب بصري.

بعد إضافة المزيج الرئيسي ، قم بتدوير اللوحة لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي مبرد عند 1 ، 500 مرة G لسحب المحلول إلى قاع الآبار. امزج العينات وقم بإزالة فقاعات الهواء لإيقاف التجربة مؤقتا. في هذه المرحلة ، قم بتخزين التفاعلات في منطقة محمية من الضوء عند أربع درجات مئوية لمدة تصل إلى 24 ساعة.

بعد ذلك ، قم بإجراء تضخيم PCR في الوقت الفعلي وتحليل منحنى الذوبان باتباع المعلمات المفصلة في الجدول الثاني. لبدء التحليل ، حدد طريقة تحليل المشتقات الثانية في جهاز تدوير الضوء Roche. ثم احسب دورة القياس الكمي أو قيم CQ.

تصدير البيانات كجدول وحفظها كملف نصي. بعد ذلك ، قم باستيراد البيانات إلى Gen X بالنقر أولا على زر معالج استيراد gon ثم النقر فوق ابدأ في النافذة التالية ، وحدد تنسيق أداة وملفات تخطيط اللوحة. يمكن تنزيل ملفات Excel لتخطيط اللوحة من موقع GON الإلكتروني.

ثم قم باستيراد اللوحة الأولى وانقر فوق التالي. يحتوي الجدول الذي تم إنشاؤه بعد استيراد الملف على أعمدة محددة مسبقا وتحرير أسماء العينات وإضافة أعمدة التصنيف أو إزالتها في هذه الخطوة. انقر فوق التالي عند الانتهاء واحفظ البيانات.

ثم قم بتحميله على محرر البيانات أولا ، قم بمعايرة البيانات بين اللوحات عن طريق اختيار معايرة INTERPLATE من قائمة المعالجة المسبقة لضمان حساب جميع اللوحات باستخدام نفس المعلمات. بعد ذلك ، حدد قيمة قطع من شأنها تجاهل البيانات الأعلى من دورة العتبة أو ct. إذا كان الحمض النووي الريبي الصغير يحتوي على CT أكبر لنسخة طبق الأصل واحدة من أصل ثلاثة ، استبدال هذه القراءة بمتوسط التصوير المقطعي المحوسب من المجسفين الآخرين.

حدد الجينات المرجعية عن طريق تحديد قائمة من microRNAs التي لها قيم CQ متشابهة عبر جميع العينات وتشغيل معيار الجينات. بعد ذلك ، قم بتطبيع البيانات باستخدام الجينات المرجعية التي تم الحصول عليها. سوف تتوافق القيم الناتجة مع دلتا CT.

قم بإزالة الأعمدة الفارغة والفارغة تقريبا عن طريق فتح نافذة المعالجة المسبقة وتحديد التحقق من صحة الورقة، ثم تحديد تطبيق في سطر إزالة الأعمدة الفارغة في السطر أدناه. اختر النسبة المئوية المطلوبة من البيانات الصالحة وانقر فوق تطبيق. حدد 100٪ إذا كنت ترغب في مقارنة microRNAs المشتركة فقط لجميع العينات.

قم بتحميل ملف MDF النهائي في Gen X وافتح مدير البيانات لتصنيف المجموعة وتصور microRNAs والعينات على الخرائط الحرارية و dendro grams. ثم حدد مجموعات من العينات وأنشئها وانقر فوق تطبيق عند الانتهاء. بعد ذلك في نافذة لوحة التحكم ، انقر فوق تشغيل.

احفظ خريطة التمثيل اللوني بالتنسيق المطلوب مثل TIFF أو الصورة النقطية، ثم انسخ الخريطة الحرارية وقم بتعديلها حسب الحاجة. تم الحصول على هذا الشريط الرسومي من تطبيق معيار G داخل Gen X لتحليل 10 جينات مرجعية محتملة للحمض النووي الريبي الدقيق. تشير هذه النتائج إلى أن MIR 622 و MI 1 ، 266 هما أكثر الحمض النووي الريبي الميكروي التعبير عنه استقرارا.

يوضح مخطط المربع المعروض هنا توزيع البيانات لكل من 11 microRNAs ذات دلالة إحصائية داخل مجموعات HIVE و HIV بالإضافة إلى التهاب الدماغ. في كل عمود ، يشير المخطط إلى المتوسط والربع الأول والثالث ، جنبا إلى جنب مع القيم القصوى والدنيا بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء التنميط المعدني على أي سوائل في الجسم وعينات من الأنسجة والخلايا المستنبتة.