تحديد الطائرات الملزمة للجليد من البروتينات المضادة للتجمد من قبل تقارب طائرة الجليد القائم على الفلورسينس

الهدف العام من التجربة التالية هو تصوير مستويات الجليد المرتبطة ببروتينات مضادة للتجمد موسومة فلوروسنتياً. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تنمية بلورات جليدية مفردة يمكن للبروتينات المضادة للتجمد الارتباط بها في خطوة ثانية. وتُفحص كل بلورة من خلال مستقطبات متقاطعة للتحقق من تفردها واتجاهها.

بعد ذلك، يتم تركيب بلورة ثلج على إصبع تبريد خاضع للتحكم في درجة الحرارة وتشكيلها على هيئة نصف كرة. ثم تُغمر البلورة في محلول من البروتينات المضادة للتجمد والموسومة فلوروسنتياً، وذلك لامتصاص البروتينات المضادة للتجمد على مستويات ربط محددة في نصف الكرة النامي. ويتم الحصول على نتائج الجليد عن طريق تصور وتصوير الجليد المرتبط بالبروتينات المضادة للتجمد الموسومة فلوروسنتياً، باستخدام ضوء وفلاتر ذات أطوال موجية محددة في غرفة تبريد مظلمة.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية مثل النقش الجليدي، في أن البروتينات المضادة للتجمد موسومة فلورياً للسماح بالتصور الفوري لمستويات الجليد المرتبطة بالبروتين. ابدأ عملية نمو البلورات من خلال تحضير حمام إيثيلين جليكول يتم التحكم في درجة حرارته عند -0.5 °C، وإيجاد وعاء معدني نظيف يتناسب مع الحمام ويمكنه الطفو فوقه. تتشكل البلورات في قوالب؛ استخدم قوالب أسطوانية يبلغ ارتفاعها من 3 إلى 4 cm مقطوعة من أنبوب بولي فينيل كلوريد.

يجب أن يحتوي كل قالب على ثلم بعرض 1 مليمتر وارتفاع 2 مليمتر على أحد جوانبه. ضَع طبقة رقيقة من شحم التخلخل (vacuum grease) على جانب الحلقة التي قُطع منها الثلم. ثم أحكم إغلاق هذا السطح المثلم والمدهون بالشحم على الوعاء المعدني، بحيث يكون الثلم موجهاً بعيداً عن مركز الوعاء.

تأكد من عدم ملء أو سد الثلمات بالشحم. قم بتحضير أكبر عدد ممكن من القوالب التي يمكن أن تتسع لها المقلاة. بعد ذلك، أضف ماء Degas المفلتر ومنزوع الأيونات إلى مركز المقلاة خارج القوالب.

يجب الحرص على عدم إدخال أي فقاعات. ومع رفع طبقة الماء إلى خمسة مليمترات، ينبغي أن يدخل الماء ببطء إلى القوالب عبر الشقوق. عند الانتهاء، ضع الحوض في حمام الإيثيلين جليكول بحيث يكون مستوياً تماماً.

بعد أن تصل درجة حرارة المقلاة والماء إلى -0.5 درجة Celsius، أضف قطعة صغيرة من الثلج في منتصف المقلاة خارج القوالب. يتم التحضين طوال الليل لتكوين طبقة من الثلج على مدار الأيام الثلاثة التالية. أعدها إلى الحمام لإضافة الماء إلى القوالب.

ضع 13 milliliters من الماء منزوع الغازات والمتأين عند درجة حرارة أربع degrees Celsius في كل قالب. وبمجرد مرور يوم واحد بعد إضافة الماء، قم بخفض درجة حرارة حمام إيثيلين جلايكول. وبحلول اليوم الرابع، يجب أن تمتلئ القوالب بالكامل بالثلج.

استخرج القوالب وجهّز سطحاً نظيفاً للثلج. اسحب كل قالب من الصينية وادفع بلورة الثلج للخارج. ضع السطح النظيف مع القوالب في مجمد بدرجة حرارة -20 °C لمدة ساعة واحدة.

قبل المناولة. عندما يصبح الجليد جاهزاً، انقله إلى غرفة تجميد أو غرفة تبريد لتحديد ما إذا كان بلورة أحادية. ضع الجليد بين مستقطبين متقاطعين.

إذا كان الجليد عبارة عن بلورة واحدة، فلا ينبغي أن تظهر أي شقوق أو انقطاعات، كما يجب ألا يتغير اتجاه الضوء داخل البلورة. معما بقاء المستقطب في مكانه، حدد اتجاه المحور C من خلال ملاحظة الضوء النافذ عند تدوير الجليد. ولتحديد اتجاه A AEs، قم بلف الجليد بإحكام في رقائق الألومنيوم.

وجِّه إبرةً بشكل عمودي على محور البحر واثقب ثقباً صغيراً عبر الرقاقة وصولاً إلى الجليد. بعد ذلك، ضع الجليد في فراغ بقدر 0.5 millibar لمدة 20 دقيقة. وبمجرد استعادة البلورة، اكشف عنها في الغرفة الباردة.

لاحظ النقش السداسي على المستوى القاعدي. تمر الـ A AEs عبر رؤوس النجمة سداسية الرؤوس. سيتم قطع هذه البلورة إلى نصفين على طول خط موازٍ للنقاط المتقابلة في النجمة.

لكشف مستوى منشور أساسي، ثبّت البلورة بإحكام على طاولة العمل. استخدم منشاراً يدوياً لقطع البلورة إلى نصفين. اجمع القطع لتركيبها على الإصبع البارد.

يجب تحضير بلورة الجليد بشكل إضافي لتثبيتها على الإصبع المبرد، وذلك بإحضار قضيبين من الألومنيوم بأقطار مختلفة قليلاً، ولكن بأحجام مقاربة لحجم الإصبع المبرد. يتم التناوب في استخدام القضيبين لإذابة تجويف في الجزء العلوي من البلورة، والتوقف عند تكوّن تجويف يمكن للإصبع المبرد أن يستقر فيه. يتم تبريد الإصبع المبرد إلى -0.5 °C ثم وضعه في تجويف الجليد.

ثبّت البلورة في مكانها حتى تتجمد وتلتصق بالمعدن. بعد ذلك، املأ كوباً نصف كروي يبلغ قطره ضعف قطر بلورة الجليد تقريباً بماء منزوع الأيونات ومفلتر ومبرد إلى 4 °C. اغمر بلورة الجليد المثبتة على الإصبع البارد في الكوب، ثم تخلص من الماء الزائد بحيث يكون الجزء العلوي من بلورة الجليد في مستوى السائل تقريباً دون أن يلامسه الجليد.

تغطي جدران الكوب الكوب بالعزل وتخفض درجة الحرارة إلى 5- °C. اترك الجليد ليشكل نصف كرة على مدار ساعة تقريبًا. استعد لإضافة البروتين الفلوري.

عندما يصبح نصف الكرة جاهزاً، قم بإزالة بلورة الثلج من الكوب، ثم قم بإزالة الماء منه. بعد ذلك، أضف 25 إلى 30 milliliters من محلول البروتين المسمى فلورياً والمبرد مسبقاً بالتركيز المطلوب.

مع الحفاظ على الحجم الكلي للسائل دون تغيير، اغمر بلورة الثلج في الكوب. مرة أخرى، تأكد من أن الجزء العلوي من البلورة بمستوى السائل ولا يلامس جدران الكوب. اخفض درجة حرارة الإصبع البارد (cold finger) إلى 8- °C واترك محلول البروتين يتجمد داخل البلورة لمدة تتراوح من ساعتين إلى ثلاث ساعات.

أوقف نمو الجليد عندما تتكون طبقة من الجليد بسمك خمسة مليمترات على الأقل من محلول البروتين. ومع بقاء الإصبع المبرد متصلاً، قم بإزالة بلورة الجليد من الكوب. ثم افصل الإصبع المبرد عن طريق تسخين سائل التبريد إلى درجة حرارة أعلى قليلاً من 0 °C.

انتظر حتى تذوب بلورة الجليد. عندما تذوب البلورة عن الإصبع المبرد (cold finger)، ضعها بحيث يكون الجانب المسطح للأسفل على سطح نظيف. احرص على عدم لمس الجليد المتكون حديثاً.

يُحفظ البلور عند درجة حرارة 20- °C لمدة 20 دقيقة على الأقل. وقبل البدء في تصور الفلورة، يجب العمل في غرفة تبريد يمكن إظلامها. قم بتجهيز المصابيح المزودة بمرشحات استثارة ذات طول موجي محدد لتحفيز العلامة الفلورية، ومرشحات انبعاث للكاميرا. ولمنع الضوء غير النوعي، ضع الثلج بحيث يكون الجانب المسطح لأسفل تحت المصابيح، ثم أظلم الغرفة وعاين الأنماط في الثلج المضاء.

لتقدير مستويات الجليد التي ترتبط بها البروتينات المانعة للتجمد، قارن صورة تقليدية للنقش الجليدي بصورة تحليل ألفة مستويات الجليد القائمة على الفلورة المقابلة باستخدام trixy، حيث تظهر كلتاهما البروتينات المانعة للتجمد من النوع الأول التي ينتجها سمك موسى الشتوي pseudo pectus Americana. يمكن استخدام هذه التقنية لمقارنة أنماط ارتباط الجليد لبروتينات مانعة للتجمد مختلفة في وقت واحد. وفي هذه الحالة، تم استخدام النوع الثالث NFEA FP eight المسمى بـ Pacific Blue والبروتين المانع للتجمد من النوع الأول المسمى بـ trixy.

هذه هي نتيجة تصوير النوع الثالث فقط من N-F-E-A-F-P، بينما يتم في هذه الصورة تصوير بروتين مضاد للتجمد من النوع الأول فقط. ويتم تصوير الاثنين معاً. لاحظ أن المحور C هو نفسه في كل صورة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية تنمية وتوجيه بلورات جليدية مفردة، واستخدام تحليل ألفة المستوى الجليدي القائم على الفلورة لتقييم أنماط ارتباط البروتينات المضادة للتجمد الملحقة بفلوروفورات بالمستويات الجليدية.