تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة ديناميكيات حبيبات البروتين النووي الريبي في الخلايا الأولية ، وخاصة تكوين حبيبات الإجهاد. يتم تحقيق ذلك عن طريق زراعة الخلايا الأولى مثل الفأر أو الخلايا الجنينية أو الخلايا الليفية أو الخلايا العصبية في الحصين من ذات الأهمية. كخطوة ثانية ، يتم نقل مكون مميز من حبيبات الإجهاد للسماح بتصورها.

بعد ذلك ، يتم تحفيز الخلايا بالإجهاد ومراقبتها باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر بفاصل زمني. تظهر النتائج التي تم الحصول عليها ديناميكيات G three BP التي تحتوي على حبيبات الإجهاد في الأساطير أو الخلايا العصبية المرآة والحصين بناء على تصورها المباشر. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول الاستجابة للإجهاد في الخلايا مثل الخلايا العصبية.

على سبيل المثال ، في الفئران ، تم العثور على عيوب عصبية في الحمض النووي الريبي ، وحظر البروتينات الضرورية لحبيبات الإجهاد ، وعيوب عصبية. لذلك يمكن أن تساعد هذه الطريقة في فهم الآليات الكامنة وراء هذه الملاحظات. بعد القتل الرحيم للفأر الحامل E 13.5 ، قم بتعقيم الفأر بنسبة 90٪ من الإيثانول وإزالة قرون الرحم تحت غطاء معقم.

انقل القرون إلى 37 درجة مئوية DPBS وقم بإزالة الأجنة. انقل الأجنة إلى طبق 100 ملم. قم بإزالة الأنسجة الزائدة واغسلها باستخدام DPBS دافئ.

الآن تحت المجهر ، قم بإزالة الأطراف والأعضاء الداخلية والجزء العلوي من الرأس الذي يحتوي على الدماغ. يمكن استخدام أقسام الذيل أو الرأس للتنميط الجيني. افرم المناديل المتبقية في طبق منفصل لمدة دقيقة على الأقل.

لا تجمع بين الأنماط الجينية إذا كانت يجب أن تختلف داخل القمامة. غطي منديل اللحم المفروم بواحد × التربسين EDTA واحتضنه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك ، أضف 10 ملليلتر من وسط mes الكامل.

لإيقاف رد الفعل ، قم بفك الأنسجة بماصة وانقل التعليق الناتج إلى أنبوب سعة 50 مل. قم بتغطية الأنبوب بوسيط واترك المحتويات تستقر. ثم صب من الخلايا المعلقة.

بعد ذلك ، قم بتدوير التعليق عند 300 جي لمدة خمس دقائق. في درجة حرارة الغرفة ، قم بتعليق الحبيبات في ستة ملليلتر من الوسط الكامل لكل جنين. يجب أن يكون عدد الخلايا النووية القابلة للحياة حوالي 5 ملايين لكل جنين.

ثم قم بتحميل ألواح 60 ملم بثلاثة ملليلتر من تعليق الخلية والثقافة. هم. قم بتغيير الوسائط في اليوم التالي واسمح للخلايا بالنمو بطلاقة. عندما يتم زراعة الخلايا الفرعية ، ستبقى الخلايا الليفية فقط على قيد الحياة.

قسم الألواح المتقاربة إلى زجاج 35 ملم. أطباق سفل. قم بتنمية هذه الأطباق إلى ما بين 50 و 70٪ من الطلاقة المشتركة واستمر في التعدين.

لكل طبق 35 ملم ، احصل على ثلاثة ميكروغرامات من البلازميد المنقى للتعداد. يكفي استخدام مجموعة التعداء المتوفرة تجاريا. في هذا المثال، متجه يعبر عن فجوة RAS.

نقل بروتين ربط SSH ثلاثي المجالات. إنه عنصر مهم لحبيبات الإجهاد. هذا الإجراء بالطبع ، ينطبق على دراسة أي ناقل ذي أهمية في الخلايا الليفية في اليوم السابق لحصاد الجرو.

تحضير الأطباق المغلفة ببولين ليسين تبدأ بجمع الأجنة من 18.5 سد DPC ونقلها إلى HBSS في طبق كبير. إذا رغبت في ذلك ، يمكن استبدال صغار حديثي الولادة لمنع التضحية بالأم. قطع الرأس وإزالة الدماغ.

ثم احصد أدمغة الجرو إلى طبق نظيف مع HBSS تحت المجهر. قم بإزالة جميع السحايا باستخدام ملقط دقيق. ثم افصل الأجزاء المرغوبة من الدماغ مثل فرس النهر.

انقل الأنسجة إلى 4.5 مل من HPSS الباردة في أنابيب سعة 15 ملليلتر واحتفظ بها على الجليد. هضم الأنسجة بإضافة 0.5 مل من محلول التربسين 2.5٪. احتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة.

ثم اشطف التربسين بثلاث غسلات من HBSS مع الحرص على عدم فقدان أي أنسجة. الآن أعد تعليق الأنسجة في نصف إلى مليلتر واحد من DMM مع 10٪ FBS. ثم قم بتجانس الأنسجة عن طريق تدفقها عبر الماصة.

ثم قم بالتبديل إلى طرف سعة 200 ميكرولتر وقم بسحب المحلول حتى لا يكون هناك مجاميع مرئي. بعد ذلك ، أضف 100 إلى 200 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 35 ملم زجاجي تحتضن الأطباق السفلية المحضرة بوسائط DMM FBS الأطباق. بعد ثلاث ساعات من الثقافة ، استبدل الوسائط بوسائط كاملة للخلايا العصبية الدافئة لوقت الثقافة المتبقي.

بعد خمسة إلى 14 يوما في الثقافة ، انقل الخلايا العصبية باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم. بعد 24 ساعة من نجاح إجهاد التعداء ، ستبدأ حبيبات الإجهاد في التجميع بسبب G ثلاثة BP على التعبير. سيؤدي الإجهاد الإضافي إلى زيادة تجميع حبيبات الإجهاد ، وتسخين مكونات المجهر متحد البؤر مسبقا لمدة 20 دقيقة على الأقل ، بما في ذلك تسخين المرحلة إلى 37 درجة مئوية.

مطلوب حامل لوحة 35 ملم قبل تصور الخلايا مباشرة. قم بما يلي. أولا ، استبدل أي وسط خلية يحتوي على الفينول الأحمر بآخر بدون فينول أحمر.

ابدأ بتصوير الخلايا على الفور. سوف تتشكل حبيبات الإجهاد في أقل من ساعة ، لذلك سيتم إحداث الإجهاد بعد تصور الخلايا. من المهم أن تبدأ عمليات الاستحواذ في أسرع وقت ممكن بعد تحريض الإجهاد ، وضبط معلمتين بدقة اعتمادا على نوع الخلية ونوع البروتين الخاص بك.

كثافة الليزر ومدة عمليات الاستحواذ أقل من كليهما لتقليل السمية الخلوية. بعد ذلك ، اعرض الخلايا بهدف الغمر بالزيت 40 × و 63 ×. تأكد من أن اللوحة مسطحة في الحامل واستخدم ضوء الفلورسنت بالحد الأدنى.

بمجرد تحديد مجال الاهتمام ، استخدم البرنامج للحصول على الصور. ابدأ بطاقة الليزر بنسبة 10٪ أو أقل ، واضبط الكسب والإزاحة للحصول على أفضل نسبة إشارة ممكنة إلى الضوضاء. قم بالمسح الضوئي بسرعة 1000 هرتز لتقليل تعرض الخلايا لمجموعة الليزر لمجموعة المرض حسب الرغبة ، والحفاظ على الفاصل الزمني للمسح لأطول فترة ممكنة للحفاظ على صحة الثقافة بشكل أفضل.

الحصول على البيانات طالما كانت هناك حاجة في MEFs تتشكل حبيبات في غضون 10 دقائق وتكون مرئية بوضوح في غضون ساعة. في الخلايا العصبية ، تكون العملية أبطأ قليلا. يجب أن يوفر G ثلاثة BP إشارة قوية بشكل معقول لمدة 45 دقيقة على الأقل باستخدام التقنيات الموصوفة.

تمت مراقبة تكوين حبيبات الإجهاد في الخلايا المستزرعة. كان توطين البروتين الموسوم ب G three BP منتشرا في أساطير السيتوبلازم المزروعة ، وأيضا منتشرا في سيتوبلازم الخلايا العصبية. مع معالجة الزرخونايت ، يتم توطين البروتينات بوضوح في بؤر محددة وأكبر في أي من أنواع الخلايا.

هذه هي حبيبات الإجهاد. يمكن إعادة بناء الصور الملتقطة في فيلم بفاصل زمني. يظهر الفيديوها الأول والثاني الخلايا الليفية التي تستجيب للإجهاد.

الفيديو الثالث نفس الشيء. في الخلايا العصبية الحصينية ، توفر إعادة بناء زاك توطين ثلاثي الأبعاد ل G ثلاثة B bp الموسومة وبالتالي منظور مختلف للتتبع. بعد هذا الإجراء ، يمكن استخدام كيمياء السيتو المناعية لتصور مكونات الحبيبات بعد نوع مختلف من الإجهاد وبعد التثبيت الذاتي.

يمكن أن يجيب هذا على أسئلة كمية حول حجم وعدد الأجسام الخلوية المختلفة في ظروف مختلفة.