ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

فإن الكتاب أود أن أنوه مونبلييه ريو التصوير (MRI) منصة حيث أجريت عمليات الاستحواذ. أنها أشكر إيزابيل كريستينا لوبيز ميخيا، الكسندرا ميتز، إيرينا Lassot، صولانج Desagher، فابيان Loustalot، وفيرجيني جورجيت لمساعدتهم في أجزاء مختلفة من البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بحوث صب لا MEDICALE (FRM) (إيكيب FRM 2011-N ° DEQ20111223745).

جميع الإجراءات الحيوان في هذا البروتوكول في الالتزام الصارم للمبادئ التوجيهية توجيهات المجلس الجماعة الأوروبية في 24 نوفمبر 1986 (86-609/EEC). بيت الفئران في المجموعة، مما يسمح للطعام والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. المحافظة عليها في بيئة تسيطر عليها (22 ± 1 درجة مئوية، 55 ± 5٪ الرطوبة) مع 12 ساعة: 12 ساعة ضوء: دورة الظلام (الضوء على الساعة 7:00 صباحا). 1 ثقافة خلايا الفئران الابتدائية: الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFs) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأوتوكلاف ملقط رقيقة، وكذلك ملقط منحنية ومقص تشريح. تخزين في حاوية معقمة. استخدام معقم D-PBS (Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة). إعداد كاملة المتوسطة MEFs: Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) / F12 تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FBS)، 1 ملم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 0.5 مم 2 المركابتويثانول ودافئة في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء ماوس الحوامل (13.5 في أيام تال للجماع (DPC)) قبل خلع عنق الرحم. إزالة قرون الرحم من الماوس مطهرة مع 90٪ ETOH. تحت غطاء محرك السيارة معقمة ونظيفة، ووضع قرون مع الأجنة في 37 ° C D-prewarmed PBS. فتح قرون، ومكان الأجنة في 100 ملم العقيمة البلاستيك طبق بتري، تنظيفها من المواد الحبل السري وغسلها بالماء الدافئ D-PBS لإزالة الزائدة في الدم. تحت مجهر، إزالة أطرافه الجنين، الأعضاء الداخلية و الجزء العلوي من الرأس الذي يحتوي على الدماغ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في طبق بتري جديدة، اللحم المفروم و الأجنة إلى قطع صغيرة جدا مع العقيمة الجراحية شفرة أو مقص (على الأقل لمدة 1 دقيقة). في حالة الأجنة من المورثات مختلفة، وتوخي الحذر لوضع كل جنين في أطباق بتري الفردية والحفاظ على الذيل أو الرأس العلوي لالتنميط الجيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغطية الجنين مع 1X التربسين EDTA-(0.25٪ التربسين، 1 ملم EDTA). احتضان لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية. إضافة 10 مل من اكتمالMEFs المتوسطة لوقف رد الفعل التربسين. الماصة صعودا وهبوطا لإزالة كافة المجاميع. ترك الجلوس تعليق الخلية في أنبوب مل 50 (مليئة المتوسطة كاملة) لمدة 10 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لطاف لمدة 5 دقائق في 300 XG في درجة حرارة الغرفة. resuspend الكرية في المتوسط ​​كاملة (6 مل ل1 الجنين). الخلايا الأنوية قابلة للحياة يمكن عدها باستخدام التريبان أزرق (حوالي 5 × 10 6 خلايا يمكن توقعه من جنين واحد). لوحة 3 مل لكل 60 مم طبق بتري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة في اليوم التالي و تسمح للخلايا أن تنمو حتى يتم متموجة الأطباق. كثير ويمكن رؤية أنواع الخلايا، ولكن الخلايا الليفية فقط سوف البقاء على قيد الحياة ثقافة فرعية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقسيم الخلايا والسماح لها أن تنمو في 35 ملم مع أطباق أسفل الزجاج (مهم لتجربة مرور الوقت)، حتى 50-70٪ confluency لترنسفكأيشن. اختبار لالميكوبلازما ومسببات الأمراض الماوس. </li></ol> 2. الثقافة وdaptations في حالة من العصبية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل يوم من الثقافة، ومعطف 35 ملم الزجاج أطباق بتري أسفل مع بولي-L-يسين (200 ميكرولتر من 0.1 ملغ / مل) تحت غطاء معقمة ونظيفة، وترك بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على صباح اليوم التالي، وشطف مع الماء النقي المعقم، مرتين لمدة 5 دقائق ومرة ​​واحدة لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة. استبدال مع 2 مل من DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS المتوسطة وتبقى في الحاضنة 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الأجنة في 18.5 DPC. تحت غطاء محرك السيارة معقمة ونظيفة، ووضع قرون مع الأجنة في HBSS العقيمة البارد (محلول الملح المتوازن هانك) في 100 ملم طبق بيتري. ويمكن أيضا الجراء حديثي الولادة أن تستخدم بدلا من الأجنة من أجل الحفاظ على حياة السد وتمكينها من انتاج المزيد من النسل، لا سيما في حالة من الحيوانات المعدلة وراثيا والتي يمكن أن يكون من الصعب الحصول عليها. في أطباق بتري الفردية، واتخاذ كل جنين أو الوليد وخفض الرأس مع مقص. عقد رئيس عن طريق إدراج ملقط المنحني في العيون، وقطع الجلد وبعناية فتح الجمجمة لينة من الخلفمن الرأس حتى العيون، وعلى كل جانب من الرأس. قطع الأعصاب البصرية وجذع الدماغ، وإزالة الدماغ، ووضعها في طبق بتري جديدة تحتوي على HBSS. تحت المجسام، وإزالة جميع السحايا باستخدام اثنين من ملقط رقيقة. فصل الحصين، القشرة أو أي جزء آخر من الدماغ اعتمادا على هيكل للدراسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج بنية الدماغ تشريح في 4.5 مل من HBSS الباردة أعدت سابقا في 15 مل أنابيب والحفاظ على الجليد حتى الهضم مع التربسين. إضافة 0.5 مل من 2.5٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى 20 دقيقة. شطف 3X مع التربسين HBSS، والحرص على عدم تجاهل غاية أجزاء الدماغ هضمها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend في 500 ميكرولتر (الحصين) إلى 1 مل (القشرة) DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS والماصة صعودا وهبوطا عدة مرات مع 1 مل micropipette مجهزة تلميح 1 مل، ثم مجهزة 1 مل زائد 200 نصائح ميكرولتر، حتى يكون هناك لا الكلي مرئية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توزيع 100-200 ميكرولتر من تعليق خلية لكل 35 مم الزجاج بوتوم صحن يحتوي DMEM زائد FBS 10٪ والسماح للخلايا العصبية الالتزام عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعة. استبدال الخلايا العصبية التي كتبها prewarmed المتوسطة كاملة (المتوسطة Neurobasal تستكمل مع 250 ميكرومتر L-الجلوتامين وNS21، أعد كما هو موضح في تشن وآخرون 19) وترك عند 37 درجة مئوية للسماح للنمو الخلايا العصبية. بالنقل الخلايا العصبية في 5-14 أيام في المختبر (شعبة) (كفاءة ترنسفكأيشن هو أعلى بعد بضعة اتصالات شعبة متشابك ولكن هي رسوخا 7-10 شعبة). </li></ol> 3. ترنسفكأيشن من EGFP-G3BP1 تعبيد بالنقل الخلايا مع متجه يحتوي على [كدنا] من البروتين اهتمامك (أي مكون من اس جي اس) لتنصهر علامة فلوري (GFP، YFP، الخ)، وذلك باستخدام 3 ميكروغرام من البلازميد المنقى في 35 ملم الطبق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل وMEFs باستخدام طريقة التجارية، بعد بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد / الكواشف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بالنقل الخلايا العصبية مع الكالسيومطريقة الفوسفات مقتبس من شيا وآخرون 20 لفترة وجيزة.: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول: DMEM غسل: DMEM تحتوي على 25 ملي بوكل؛ الحل ترنسفكأيشن: DMEM غسل تحتوي على 1X DMKY (HEPES 5 مم، MgCl 2 10 ملي، الفينول الحمراء)؛ والحل صدمة: أنواع البسكويت العالي الطاقة 1X، DMKY 1X، وDMSO 2٪ (V / V)؛ والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وسائل الإعلام من الخلايا العصبية، الترشيح، والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية. تغسل مع DMEM غسل ثم استبدل مع ترنسفكأيشن المتوسطة والحفاظ على 37 درجة مئوية خلال إعداد الكالسيوم فوسفات البلازميد رواسب الحمض النووي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة (في هذا النظام) براون المياه (الحجم النهائي 50 ميكرولتر)، 5 ميكرولتر من 2.5 و CaCl 2 M، و 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد. إسقاط هذا المزيج على 50 ميكرولتر من أنواع البسكويت العالي الطاقة 2X أدخلت بالفعل في الجولة أنبوب أسفل البولي بروبلين. مزج أنبوب بالتناوب مع إسقاط. السماح للشكل راسب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة precipitatه قطرة قطرة على الخلايا العصبية وترك عند 37 درجة مئوية خلال 30 إلى 50 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال الحل صدمة لمدة 1 دقيقة، ثم يشطف DMEM غسل وأخيرا إعادة العمل المتوسطة شروطا مسبقة. إبقاء الخلايا في 37 درجة مئوية. </li></ol></li></ol> 4. التصور من G3BP تحتوي على الجمعية SGS وحيوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال المتوسطة من الخلايا التي تحتوي على الفينول الحمراء الفينول الحمراء الخالية المتوسط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر متحد البؤر مضان مجهزة لعمليات الاستحواذ. بدوره على أنظمة المجهر: مصباح الزئبق، والكمبيوتر، وأجهزة الليزر. الاحماء الغرفة إلى 37 درجة مئوية على الأقل 20 دقيقة قبل بداية عمليات الاستحواذ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعبير أكثر من G3BP الحث على تشكيل عفوية من نوع اس جي اس. وبالتالي يمكن لاحظت خلايا لتجميع اس جي اس 24 ساعة مباشرة بعد ترنسفكأيشن دون إجهاد الاستقراء. بدلا من ذلك، والإجهاد يمكن أن يتسبب في مزيد من حمل التجمع من SGS. إضافة 0.5 ملي الزرنيخ الصوديوم ونجمةر اكتساب الحق بعد إضافة المركب (سيتم تشكيل حبيبات جيدا في حدود 1 ساعة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى النفط الهدف الغمر (استخدام 40X 63X أو أهداف) وتثبيت طبق بيتري على الهدف في تكييفها 35 مم حامل المجهر، استقرت على حامل المرحلة. تأكد من أن طبق مسطح وإلا سيتم تغيير الاستحواذ. بدوره على ضوء مضان وفقا لfluorophore ذات الصلة ووضع تصور الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. إيقاف مضان مرة واحدة في خلية من الفائدة في الميدان من أجل تقليل تبيض وسمية الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في &quot;الحصول على علامة التبويب&quot;، حدد الليزر اعتمادا على الطول الموجي الإثارة من fluorophore علامة (488 نانومتر في بروتوكول لدينا والذي يستخدم G3BP الموسومة EGFP) وحدد طول الانبعاثات تكييفها لPMT (أنبوب مضخم). ضبط قوة الليزر (عادة لا تزيد عن 10٪) للحد من الضوضاء وoversaturation فضلا عن سمية، وتعيين مكسب وتعويض لتعديل إشارة إلى نسبة الضوضاء.مسح سريع (1،000 هرتز) من أجل تقليل مدة المعرض ليزر (الخط المتوسط ​​2، والإطار متوسط ​​1). إذا رغبت في ذلك، تعيين المعلمات لZ المكدس لتكون قادرة على إعادة بناء الصورة في 3D (خطوة Z من 1 ميكرومتر عادة ما يكون على ما يرام مع الخلايا). تحديد الوقت الفاصل بين كل اقتناء: تسمح فترات أصغر للحصول على الفيلم أكثر تماسكا ولكن هذا قد تحفز photobleaching من وسمية (تم استخدام فاصل زمني من 20 ثانية في التجارب وصفه). مدة الاستحواذ الكلي قد تختلف تبعا لنوع من الإجهاد. وشكلت العديد من SGS التي تحتوي على G3BP بسرعة كبيرة تحت العلاج الزرنيخ وتكون مرئية بشكل جيد بعد 1 ساعة من العلاج: في هذه الحالة، واختيار الخلايا بسرعة إلى السينما وبدء عمليات الاستحواذ مباشرة بعد الإجهاد، مع المدة الإجمالية من عمليات الاستحواذ من 15 - 20 دقيقة كافية إلى حد كبير لمراقبة تجميع العديد من SGS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ الصور وإعادة بناء المداخن والفيلم باستخدام برنامج ImageJ. </li></ol>

<ol><li>Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+granules%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">RNA granules: The good, the bad and the ugly.</a> Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).</li>
<li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+sites+of+mRNA+triage+that+regulate+mRNA+stability+and+translatability%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Society+transactions%22%5BJournal%5D)">Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability.</a> Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).</li>
<li>Anderson, P., Kedersha, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granules%3A+the+Tao+of+RNA+triage%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Stress granules: the Tao of RNA triage.</a> Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).</li>
<li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP+assembles+stress+granules%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).</li>
<li>Parker, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Ras-GTPase-activating+protein+SH3-domain-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein.</a> Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).</li>
<li>Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisiting+G3BP1+as+a+RasGAP+binding+protein%3A+sensitization+of+tumor+cells+to+chemotherapy+by+the+RasGAP+317-326+sequence+does+not+involve+G3BP1%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1.</a> PLOS ONE. 6 (12), (2011).</li>
<li>Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G3BPs%3A+tissue+specific+expression%2C+chromosomal+localisation+and+rasGAP%28120%29+binding+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).</li>
<li>Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PKC%CE%B1+Binds+G3BP2+and+Regulates+Stress+Granule+Formation+Following+Cellular+Stress%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress.</a> PLOS ONE. 7 (4), (2012).</li>
<li>Tourrière, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RasGAP-associated+endoribonuclease+G3Bp%3A+selective+RNA+degradation+and+phosphorylation-dependent+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization.</a> Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).</li>
<li>Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+helicase+VIII%3A+a+DNA+and+RNA+helicase+corresponding+to+the+G3BP+protein%2C+an+element+of+the+ras+transduction+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway.</a> Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).</li>
<li>Solomon, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+structural+features+of+caprin-1+mediate+its+interaction+with+G3BP-1+and+its+induction+of+phosphorylation+of+eukaryotic+translation+initiation+factor+2alpha%2C+entry+to+cytoplasmic+stress+granules%2C+and+selective+interaction+with+a+subset+of+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs.</a> Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).</li>
<li>Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-GAP+SH3+domain+binding+protein+%28G3BP%29+is+a+modulator+of+USP10%2C+a+novel+human+ubiquitin+specific+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease.</a> Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).</li>
<li>Zekri, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fetal+growth+and+neonatal+survival+by+the+RasGAP-associated+endoribonuclease+G3BP%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP.</a> Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).</li>
<li>Martin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiency+of+G3BP1%2C+the+stress+granules+assembly+factor%2C+results+in+abnormal+synaptic+plasticity+and+calcium+homeostasis+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons.</a> Journal of neurochemistry. , (2013).</li>
<li>Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+of+messenger+RNA+by+Fragile+X+Mental+Retardation+protein+into+cytoplasmic+granules+induces+translation+repression%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression.</a> Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).</li>
<li>Colombrita, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+is+recruited+to+stress+granules+in+conditions+of+oxidative+insult%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult.</a> Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).</li>
<li>Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Staufen+1+is+recruited+to+stress+granules+and+impairs+their+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly.</a> Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).</li>
<li>Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NS21%3A+re-defined+and+modified+supplement+B27+for+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience%22%5BJournal%5D)">NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures.</a> Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).</li>
<li>Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Influx+via+the+NMDA+Receptor+Induces+Immediate+Early+Gene+Transcription+by+a+MAP+Kinase%2FERK-Dependent+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism.</a> The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).</li>
<li>Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+transfection+of+DNA+into+neurons+in+primary+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+protocols+in+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture.</a> Current protocols in neuroscience. 3, (2001).</li>
<li>Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+G3BP-induced+granules+trigger+eIF2%CE%B1+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+biology+of+the+cell%22%5BJournal%5D)">Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation.</a> Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).</li>
<li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).</li>
</ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

الخطوات الأكثر أهمية في قلق بروتوكول ترنسفكأيشن وأكثر من ذلك وخاصة عمليات الاستحواذ الفاصل الزمني، والتي يجب مراقبتها بعناية من أجل خفض أسفل السمسة. ثقافة الخلايا الأولية ليس الجزء الصعب، طالما يتم الحفاظ على ظروف معقمة ويتم أخذ الحذر من أجل منع الضرر أثناء تشريح والتفكك الخلية الخطوات. MEFs يمكن أن تظل مجمدة في الممرات في وقت مبكر. وقد تبين عصبون ترنسفكأيشن مع فوسفات الكالسيوم للعمل بشكل جيد وهذا البروتوكول <sup...

حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي بؤر حشوية غير الغشائي شكلت كرد الخلوية واقية للإجهاد البيئي، مثل درجة حرارة مرتفعة، الاكسدة، نقص الأكسجة، صدمة التناضحي، الأشعة فوق البنفسجية، والحرمان من الجلوكوز، أو عدوى فيروسية 1. أنها يمكن أن يتسبب كيميائيا عن طريق العلاج مع مركبات مثل الزرنيخ الصوديوم، والذي يطلق الاكسدة. اس جي اس تتراكم المتوقفة ترجمة القبض رسول بروتين نووي ريبوزي (mRNPs) مجمعات 2، عزل من mRNAs والآلات متعدية، ويمكن أن تسبب التجمع من قبل الفسفرة من eIF2α (بدء حقيقية النواة عامل 2 α). SGS هي هياكل دينامية تبادل المكونات مع polysomes وحبيبات أخرى مثل الهيئات-P. أنها تشكل &quot;مركز الفرز&quot; حيث يتم فرز mRNAs ومعالجتها وإما ترجمة، باستعادة وتدهور، أو التعبئة والتغليف في غير مستقرة mRNPs polysomal-3. تجميع SGS سريع بالتحرير هو عملية تدريجية مع العديد من المجاميع الصغيرة الأولية التي تتجمع في حبيبات أكبر. استخدام مثبطات الكيميائية التي تعطل أو استقرار الأنابيب الدقيقة تبين أن الشبكة أنيبيب هو مطلوب لديناميات SG بما في ذلك عمليات التجميع، التحام والتفكيك. يتم الترويج لتجميع حيوي من SGS أيضا تجميع البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي محددة (RNA-BP) مثل TIA-1 (T-الخلية الداخلية مستضد-1) وTIAR (البروتين المتصلة TIA-1)، والتي هي قادرة على dimerize وتعزيز polysome التفكيك والتوجيه من mRNAs وإلى SGS 4. G3BP (RasGAP SH3 مجال البروتين ملزمة) مثل هذا RNA-BP أن يموضع لاس جي اس عندما تتعرض لإجهاد الخلايا مع الزرنيخ أو ارتفاع في درجة الحرارة، وoverexpression من G3BP dephosphorylated يمكن أن تحدث SGS التجمع 5. G3BP هو الحفاظ تطويريا RNA-BP التي تميزت في البداية من خلال تفاعلها مع بروتين تفعيل رأس GTPase (ع RasGAP120 6)؛ ولكن هذا التفاعل تم مؤخرا إعادة النظر 7. ويشمل الأسرة G3BP عضوين في الثدييات، G3BP1 (المشار إليها باسم G3BP) وG3BP2 8. كل من البروتينات colocalize في اس جي اس، عندما تتعرض الخلايا للإجهاد 9. تشمل G3BPs اقترح مجال NTF2 N-محطة للتأثير على توطين وoligomerization، تليها البرولين الغنية (PxxP) الزخارف، ثم الزخارف C-محطة المرتبطة الحمض النووي الريبي ملزمة: الكنسي RNA-التعرف على الحافز (RRM) مع الحفظ RNP1 والزخارف RNP2 ، تليها الغنية (RGG) مربع أرجينين الجلايسين. ومن المثير للاهتمام، وأظهر تحليل أجزاء مختلفة من البروتين عن طريق بناء مختلف المجالات لتنصهر EGFP أن NTF2 مثل النطاق والمجال ملزم RNA كانت جندت أكثر كفاءة لSGS، مما يدل على أهمية خصائص dimerization والحمض النووي الريبي ملزمة في تجميع SGS. وقد كشفت نماذج متنوعة وظائف مختلفة من البروتينات G3BP في المختبر 10-13.وقد أظهرت اضطراب G3BP في الفئران أهمية هذا البروتين في النمو والبقاء على قيد الحياة 14 التنموية، فضلا عن الدور الهام للG3BP في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وتتميز ترنح وعيوب في الذاكرة العاملة المكانية 15. نقص G3BP يؤدي إلى تغير الخلايا العصبية اللدونة والكالسيوم التوازن، وإقامة صلة مباشرة بين تشكيل SG وأمراض الاعصاب 15. بالتالي فمن المهم أن تكون قادرة على دراسة ديناميات SGS في الخلايا الأولية مثل الخلايا العصبية. يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لمراقبة تجميع المحتوية على G3BP1 SGS في الخلايا الأولية تحت العلاج الزرنيخ. ويمكن استخدامه لدراسة SGS التجمع في ظل ظروف مختلفة، على سبيل المثال أنواع مختلفة من الضغوط. فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع حبيبات أو غيرها من المكونات الأخرى من SGS. في الواقع، ويركز هذا البروتوكول على G3BP1، ولكن هناك علامات أخرى حبيبات الإجهاد مثل TIA-1 / R، TTP (tristetraprolin) 2،FMRP (X الهشة تخلف العقلي متلازمة البروتين) 16، TDP-43 (DNA استجابة transactive بروتين ملزمة 43) 17 أو 18 ستاوفن. على وجه الخصوص، والبروتينات مثل TIA-1 / R هي، مثل G3BP، nucleating البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي التي يمكن أن تحدث عند التجميع SGS بإفراط (overexpressed)، حتى لو كان SGS شكلت مختلفة يمكن أن تختلف في وظيفة والتنظيم والنصوص المرتبطة بها. ترنسفكأيشن من النسخة الموسومة fluorophore من أي من هذه المكونات الرئيسية أو nucleators من SGS لا يمكن أن يؤديها لصورة معينة التجمع اس جي اس والديناميات.

<table><tbody><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>21331</td><td>Prewarm عند 37 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>بيروفات الصوديوم</td><td>Gibco</td><td>11360</td><td></td></tr><tr><td>الأحماض الأمينية غير الأساسية</td><td>Gibco</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15096</td><td></td></tr><tr><td>قاع زجاجي B-35</td><td>Greiner</td><td>627860 / 627861</td><td>معالج أم لا (معالج: يزيد من ارتباط الخلايا الملتصقة)</td></tr> <tr><td>بولي إل ليسين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td>Prewarm عند 37 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>HeBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103</td><td>Prewarm عند 37 درجة ؛ C</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>ملقط</td><td>Biotek</td><td>DU-110-A</td><td>رفيع جدا ، نصائح 0.1 مم (مفيد لإزالة السحايا)</td></tr><tr><td>ملقط منحني</td><td>Biotek</td><td>P-110-BUF</td><td>رفيع جدا ، نصائح 0.1 مم</td></tr><tr><td>مقص صغير</td><td>Biotek</td><td>CM-85-BS</td><td>يمكن أن يكون مفيدا لإزالة تعداء حصين</td></tr><tr><td>Polyplus كاشف JetPEI &nbsp ؛</td><td>تعداء Ozyme</td><td>101-10</td><td>MEFs ، اتبع البروتوكول الأمامي</td></tr><tr><td>مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر المقلوب</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr></tbody></table>

تصور g3bp الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGS يمكن تصور في الخلايا المناعية التي كتبها مكونات بروتين معين أو بوليا + mRNAs و. SGS هي ديناميكية للغاية ودراسة جمعيتهم ومصير المهم أن نفهم الاستجابة الخلوية للإجهاد. نقص في العوامل الرئيسية لمثل SGS G3BP (RasGAP SH3 مجال بروتين ملزمة) يؤدي إلى عيوب التنموية في الفئران والتعديلات في النظام العصبي المركزي. لدراسة ديناميات SGS في الخلايا من كائن حي، يمكن للمرء الخلايا الأولية الثقافة واتبع توطين عنصر الموسومة transfected من SGS. نحن تصف التجربة الوقت الفاصل بين لمراقبة SGS التي تحتوي على G3BP1 في الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة SGS التي تحتوي على الخلايا العصبية في G3BP الحية، وهو أمر حاسم كما تبين مؤخرا أن هذه SGS تتشكل في ظهور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر. يمكن تكييفها هذا النهج تجاه أي من مكونات أخرى من الجسم الخلوية والبروتينات الحبيبية، وأجرىمع الحيوانات المعدلة وراثيا، والسماح للدراسة حية من حبيبات ديناميات على سبيل المثال في حالة عدم وجود عامل معين من هذه الحبيبات.

تشكيل الإجهاد الحبيبية مهم في استجابة الخلايا للإجهاد، والسماح التكيف الخلوية مع الترجمة المتعثرة، حتى طهر الإجهاد، ويرتبط لمنع موت الخلايا المبرمج. تصاريح هذا الاختبار لدراسة SGS في الخلايا الأولية، وذلك باتباع توطين المكونات الرئيسية البروتين اس جي اس (الشكل 1). G3BP، عاملا رئيسيا من SGS التجمع، هو الحاضر بدلا diffusively في سيتوبلازم الخلايا العصبية MEFs مثقف أو (الشكل 2A ألف وجيم)، وموجودة بشكل واضح في حبيبات منفصلة تحت العلاج الزرنيخ في MEFs ...

حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي حبيبات الحمض النووي الريبي حشوية تحتوي على جزيئات بروتين نووي ريبوزي المتعثرة (RNPs)، والمهم في الاستجابة الخلوية لمختلف الضغوط. يمكن اتباعها ديناميات SGS في الخلايا الحية من خلال وضع تصور توطين عنصر الموسومة اس جي اس في الخلايا الأولية transfected بعد الإجهاد.

تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

الهدف العام من التجربة التالية هو دراسة ديناميكيات حبيبات البروتين النووي الريبوزي في الخلايا الأولية، وبشكل خاص تكوين حبيبات الإجهاد. يتم تحقيق ذلك أولاً من خلال زراعة خلايا مثل الخلايا الليفية الجنينية للفئران، أو العصبونات الحصينية من الحيوانات المستهدفة. وفي خطوة ثانية، يتم ترانسفكشن مكون مُوسوم من حبيبات الإجهاد للسماح بتصويرها بصرياً.بعد ذلك، يتم تحفيز الإجهاد في الخلايا ومراقبتها باستخدام المجهر البؤري بنظام التصوير المتقطع (time-lapse confocal microscopy). وتُظهر النتائج التي تم الحصول عليها ديناميكيات الحبيبات الإجهادية التي تحتوي على G3BP1 في العصبونات الحصينية أو عصبونات المرآة بناءً على التصوير المباشر لها. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية حول الاستجابة للإجهاد في خلايا مثل العصبونات.على سبيل المثال، تبيّن وجود عيوب عصبية في الفئران عند تثبيط RNA، مما أدى إلى منع البروتينات الأساسية للحبيبات الإجهادية. لذا، يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في فهم الآليات الكامنة وراء هذه الملاحظات. بعد القتل الرحيم لفأرة حامل في اليوم 13.5 من الحمل، يتم تعقيم الفأرة باستخدام 90%ethanol وإزالة القرون الرحمية تحت غطاء معقم.انقل القرون إلى محلول DPBS عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وقم بإزالة الأجنة. انقل الأجنة إلى طبق قطرُه 100 ملم. تخلص من الأنسجة الزائدة واغسلها باستخدام محلول DPBS دافئ.الآن وتحت المجهر، قم بإزالة الأطراف والأعضاء الداخلية والجزء العلوي من الرأس الذي يحتوي على الدماغ. يمكن استخدام مقاطع الذيل أو الرأس لإجراء التنميط الجيني. قم بتقطيع الأنسجة المتبقية في طبق منفصل لمدة دقيقة واحدة على الأقل.لا تدمج الأنماط الجينية إذا كان من المفترض أن تختلف داخل البطن الواحد. غطِّ الأنسجة المفرومة بـ 1x trypsin EDTA واتركها في الحضانة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. بعد ذلك، أضف 10 milliliters من وسط mes الكامل.لإيقاف التفاعل، قم بتفكيك النسيج باستخدام ماصة وانقل المعلق الناتج إلى أنبوب سعة 50 milliliter. املأ الأنبوب بالوسط الغذائي واترك المحتويات تترسب، ثم قم بسكب الخلايا المعلقة.بعد ذلك، قم بطرد المعلق مركزياً عند 300 Gs لمدة خمس دقائق. وفي درجة حرارة الغرفة، أعد تعليق الراسب في ستة ملليلتر من الوسط الكامل لكل جنين. يجب أن يكون عدد الخلايا ذات النواة القابلة للحياة حوالي 5 مليون خلية لكل جنين.بعد ذلك، يتم ملء أطباق بقطر 60 millimeter بـ 3 milliliters من معلق الخلايا وزراعتها. يتم تغيير الوسط في اليوم التالي وترك الخلايا تنمو حتى تصل إلى مرحلة التلاقي (confluency). وعند إعادة زراعة الخلايا، ستبقى الخلايا الليفية (fibroblasts) فقط هي التي تنجو.قم بتوزيع الأطباق المكتملة النمو في أطباق زجاجية ذات قاع مسطحة بمقاس 35 مليمتر. اترك هذه الأطباق لتنمو حتى تصل نسبة التلاقي (confluency) فيها إلى ما بين 50 و70%، ثم ابدأ بعملية عفن التحول (transfection).لكل طبق بقطر 35 مليمتر، جهّز ثلاث ميكروغرامات من البلازميد المُنقّى لعملية عفن الخلية (transfection). سيكفي استخدام طقم عفن خلية متاح تجاريًا. في هذا المثال، تم استخدام ناقل يعبر عن RAs gap.يتم ترصيف بروتين SSH ثلاثي النطاقات الرابط. وهو مكون مهم في الحبيبات الإجهادية. وبالطبع، ينطبق هذا الإجراء على دراسة أي ناقل اهتمام في الخلايا الليفية في اليوم السابق لجمع العينة.لتحضير الأطباق المطلية بـ Pauline lysine، ابدأ بجمع الأجنة من الأمهات في اليوم 18.5 DPC ونقلها إلى محلول HBSS في طبق كبير. وإذا رغبت في ذلك، يمكن استبدالها بجراء حديثة الولادة لتجنب التضحية بالأم. اقطع الرأس ثم استخرج الدماغ.بعد ذلك، يتم استئصال أدمغة الجراء ووضعها في طبق نظيف يحتوي على HBSS تحت المجهر. يتم إزالة جميع السحايا باستخدام ملاقط دقيقة، ثم يتم فصل أجزاء الدماغ المطلوبة مثل الحصين (hippo campi).انقل الأنسجة إلى 4.5 milliliters من محلول HPSS البارد في أنابيب سعة 15 milliliter واحفظها على الثلج. قم بهضم الأنسجة بإضافة 0.5 milliliters من محلول trypsin بتركيز 2.5%. حضنها عند درجة حرارة 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من 15 إلى 20 دقيقة.بعد ذلك، اشطف التريبسين بثلاث غسلات من HBSS مع الحرص على عدم فقدان أي جزء من النسيج. الآن، أعد تعليق الأنسجة في كمية تتراوح من نصف ملليلتر إلى 1 ملليلتر من DMM مع 10% FBS. ثم قم بتجنيس النسيج عن طريق تمريره عبر الماصة.ثم انتقل إلى استخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر وقم بسحب المحلول وإعادة وضعه حتى تختفي جميع التجمعات المرئية. بعد ذلك، أضف من 100 إلى 200 ميكرولتر من معلق الخلايا إلى أطباق ذات قاعدة زجاجية مقاس 35 مليمتر مُعدة مسبقاً بوسط DMM FBS، ثم قم بتحضين الأطباق. وبعد ثلاث ساعات من الزراعة، استبدل الوسط بوسط neuron complete المُدفأ مسبقاً للفترة المتبقية من وقت الزراعة.بعد مرور خمسة إلى 14 يوماً في المزرعة، قم بنقل العصبونات باستخدام طريقة فوسفات الكالسيوم. وبعد 24 ساعة من عملية ترنسفكشن ناجحة، ستبدأ حبيبات الإجهاد في التجمع نتيجة فرط تعبير G3BP. وسيؤدي الإجهاد الإضافي إلى تحفيز تجميع حبيبات الإجهاد بشكل أكبر؛ لذا قم بتسخين مكوّنات المجهر البؤري لمدة 20 دقيقة على الأقل، بما في ذلك تسخين المنصة إلى 37 °C.يلزم توفير حامل أطباق مقاس 35 مليمتر مباشرة قبل تصوير الخلايا. قم بما يلي: أولاً، استبدل أي وسط زراعة خلوي يحتوي على phenol red بوسط آخر خالٍ من phenol red.ابدأ بتصوير الخلايا على الفور. ستتشكل الحبيبات الإجهادية في أقل من ساعة، لذا سيتم تحفيز الإجهاد بعد تصور الخلايا. من المهم البدء في عمليات الاستحواذ في أسرع وقت ممكن بعد تحفيز الإجهاد، وضبط معلمتين بدقة بناءً على نوع الخلايا ونوع البروتين لديك.يتم خفض شدة الليزر ومدة عملية الالتقاط لتقليل السمية الخلوية. بعد ذلك، يتم فحص الخلايا باستخدام عدسات شيئية غمر زيتي بقوة 40x و 63x. تأكد من استواء الطبق في الحامل، واستخدم الضوء الفلوري بالحد الأدنى.بمجرد تحديد المجال المراد دراسته، استخدم البرنامج لالتقاط الصور. ابدأ بضبط قدرة الليزر عند 10% أو أقل، واضبط الكسب (gain) والإزاحة (offset) للحصول على أفضل نسبة إشارة إلى ضوضاء ممكنة. قم بالمسح بتردد 1000 hertz لتقليل تعرض الخلايا لليزر، واضبط مجموعة الصور المتراكمة (stack) حسب الرغبة، واجعل الفاصل الزمني بين عمليات المسح طويلاً قدر الإمكان للحفاظ على صحة المزرعة بشكل أفضل.قم باكتساب البيانات للمدة المطلوبة؛ حيث تتشكل الحبيبات في خلايا MEFs في غضون 10 دقائق وتصبح مرئية بوضوح خلال ساعة واحدة. أما في الخلايا العصبية، فتكون العملية أبطأ قليلاً. ومن المفترض أن يوفر G3BP إشارة قوية بشكل معقول لمدة 45 دقيقة على الأقل باستخدام التقنيات الموصوفة.تمت مراقبة تكوين الحبيبات الإجهادية في الخلايا المستنبتة. كان تموضع بروتين G three BP الموسوم منتشرًا في سيتوبلازم الخلايا المستنبتة، وكذلك منتشرًا في سيتوبلازم الخلايا العصبية. ومع المعالجة بالأرسونيت، تَموضع البروتين بوضوح في بؤر محددة وأكبر حجمًا في كلا نوعي الخلايا.هذه هي الحبيبات الإجهادية. يمكن إعادة تركيب الصور الملتقطة في مقطع فيديو بتقنية الفاصل الزمني. يوضح المقطعان الأول والثاني استجابة الخلايا الليفية للإجهاد.يوضح الفيديو الثالث الشيء نفسه. وفي خلية عصبية في الحصين، توفر عمليات إعادة بناء Zack تحديداً ثلاثي الأبعاد لمواقع G three B bp المميّزة، وبالتالي منظوراً مختلفاً للتتبع. وباتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام الكيمياء النسيجية المناعية لتصوير مكونات الحبيبات بعد أنواع مختلفة من الإجهاد وبعد التثبيت الذاتي.يمكن لهذا أن يجيب على أسئلة كمية حول حجم وعدد الأجسام الخلوية المختلفة في ظروف متنوعة.

visualization-of-g3bp-stress-granules-dynamics-in-live-primary-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

وقد جرت العادة على العمليات الخلوية مثل الهجرة الخلية درس على السطوح ثنائية الأبعاد ، والبلاستيك شديدة. هذا التقرير وصفا لأسلوب لتصور مباشرة توطين البروتين وتحليل ديناميات البروتين في الخلايا المهاجرة في مصفوفة أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية ثلاثي الأبعاد.

تعيش خلية من خلايا التصوير تعرب عن ترحيل البروتينات Fluorescently الموسومة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد

يوضح هذا الفيديو فحصا لتوصيف وقياس حبيبات إجهاد الثدييات ، والتي تتكون من mRNAs وبروتينات ربط الحمض النووي الريبي (RBPs) والعديد من البروتينات الأخرى.

مقايسة التألق المناعي لتوصيف وقياس حبيبات الإجهاد في الثدييات

للتمييز بين انقسام الخلايا واختلافات دورة الخلية في خلايا عضلة القلب ، نقدم بروتوكولات باستخدام خطين من الفئران المعدلة وراثيا: الفئران المعدلة وراثيا Myh6-H2B-mCh ، للتحديد الواضح لنوى خلايا عضلة القلب ، وفئران CAG-eGFP-anillin ، لتمييز انقسام الخلايا عن اختلافات دورة الخلية.

تصور التغيرات دورة الخلية وتحديد في النواة في ما بعد الولادة العضلية

نحن تصف طريقة للتحليل النوعي والكمي لتشكيل الحبيبة الإجهاد في خلايا الثدييات بعد تحدي الخلايا مع البكتيريا وعدد من الضغوط المختلفة. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول للتحقيق في الاستجابة الحبيبية الإجهاد الحبيبية في مجموعة واسعة من التفاعلات المضيف البكتيرية.

تحليل المناعي من الإجهاد الحبيبية تشكيل بعد تحدي البكتيريا من خلايا الثدييات

حبيبات الإجهاد (سغس) هي الهياكل السيتوبلازمية غير الغشائية التي تشكل في الخلايا المعرضة لمجموعة متنوعة من الضغوط. سغس تحتوي على مرناس، والبروتينات ملزم رنا، الوحدات الفرعية الريباسي الصغيرة، العوامل المرتبطة الترجمة، والبروتينات خلية إشارة مختلفة. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يستخدم العديد من النهج التجريبية للكشف عن، وتحديد، وتحديد الكميات سغس حسن النية .

طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

تصوير خلية يعيش يقدم ثروة معلومات عن خلايا مفردة أو شعوب بأكملها التي غير قابلة للتحقيق بالتصوير ثابتة من خلية مفردة. ويرد هنا، خلية يعيش التصوير بروتوكولات لتقييم القرارات مصير الخلية بعد العلاج مع باكليتاكسيل الانقسامية لمكافحة المخدرات.

الطويلة الأجل العيش-الخلية أن التصوير لتقييم مصير الخلية ردا على باكليتاكسيل

ويصف هذا البروتوكول طريقة سهلة ومريحة التسمية ووضع تصور للكروموزومات الحية في الخلايا الانقسامية باستخدام تسمية 2.0 باكمام Histone2B-التجارة والنقل ونظام الفحص المجهري [كنفوكل] قرص غزل.

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

هنا نقدم بروتوكول لتقييم ديناميات تشكيل المغزل والتقدم الميتومي. لدينا تطبيق التصوير الفاصل الزمني تمكن المستخدم من تحديد الخلايا في مراحل مختلفة من المنوّد، وتتبع وتحديد العيوب الميتوتيكية، وتحليل ديناميات المغزل ومصير الخلية الميتومية عند التعرض للأدوية المضادة للميثوتيك.

التصوير بالخلايا الحية لتقييم ديناميات توقيت الطور ومصير الخلية بعد اضطرابات المغزل الميتوتيك

الاصباغ الفلورية الحيوية هي أدوات أساسيه لتحليلات التصوير بالخلايا الحية في بيولوجيا الخلايا الفطرية الحديثة. هذه الورقة تفاصيل تطبيق الاصباغ الفلورية الثابتة والمعروفة لتتبع ديناميات غشاء البلازما ، اندو-/الندرات والخلايا الجدارية تخلق في الفطريات الخيطية.

تطبيق غشاء وجدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية لتصوير الخلايا الحية من الفطريات الخيطية

نقدم سير العمل المتوفرة مجانا بنيت لاستكشاف سريع وتحليل دقيق للأجسام الخلوية في مقصورات خلية محددة في الصور المجهرية الفلوريس. تم تصميم سير العمل سهل الاستخدام هذا على برنامج المصدر المفتوح Icy ويستخدم أيضًا وظائف ImageJ. خط الأنابيب بأسعار معقولة دون معرفة في تحليل الصور.

محلل البنية الفرعية: سير عمل سهل الاستخدام للاستكشاف السريع والتحليل الدقيق للأجسام الخلوية في صور المجهر الفلوري

يقدم البروتوكول التالي الكشف عن بؤر الحمض النووي التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية باستخدام مزامنة دورة الخلية متبوعة بتلطيخ RPA2 المناعي.

تصور بؤر الحمض النووي المفردة التي تقطعت بها السبل في المرحلة G1 من دورة الخلية

اكتشف ديناميكيات حبيبات الإجهاد في الخلايا الأولية باستخدام تصوير G3BP المباشر. يوضح هذا الأسلوب تشكيل الحبيبات في الألياف الحاملة للأجنة والخلايا العصبية الحصينية للفئران، مما يساعد الباحثين على فهم استجابات الإجهاد الخلوية.

تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

استكشف المزيد من الفيديوهات