منصة ميكروفلويديك الانجذاب الكيميائي لقياس العدلات من الدم غير المجهزة الجامعة

هذا البروتوكول تفاصيل مقايسة مصممة لقياس الكيميائي العدلة الإنسان من قطرة واحدة من الدم الكامل مع استنساخ قوية. هذا النهج تلتف على ضرورة الفصل العدلة ويتطلب بضع دقائق فقط من الوقت اللازم لإعداد مقايسة. رقاقة ميكروفلويديك تمكن التدبير المتكررة الكيميائي العدلة مع مرور الوقت في الرضع أو الثدييات الصغيرة، حيث حجم العينة محدودة.

تهدف تقنية الموائع الدقيقة هذه إلى قياس وظائف العدلات البشرية مباشرة من قطرة دم واحدة على منصة يمكن تعدد الإرسال. تعمل غرفة التحميل المركزية كمصدر دم كامل وتعمل أيضا كحوض للتدرجات الجاذبة للعلاج الكيميائي التي تتشكل من 16 غرفة كيميائية بؤرية. يتيح الترشيح الميكانيكي الفريد لخلايا الدم الحمراء استكشاف وظيفة العدلات في السياق الطبيعي للدم والمكونات الخلوية والكيميائية الحيوية.

يسمح التشعب بين القناة المؤدية إلى الغرفة الكيميائية البؤرية والقناة الخارجة من الجهاز بالقياس الكمي وتعديل اتجاه العدلات المهاجرة. وبالتالي ، يمكن أن توضح النتائج مدى نشاط العدلات المهاجرة التي تهاجر بسهولة عبر خلايا الدم الحمراء المحاصرة وتتراكم بأعداد بمرور الوقت. تتمثل إحدى الميزات الفريدة لأجهزتنا الموائع الدقيقة في سهولة تصنيعها وإعدادها.

وهي تتكون من طبقة من PDMS مصبوبة على رقاقة صغيرة مصنعة نربطها على قاع زجاجي أو صفيحة مفردة أو متعددة الآبار. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تتطلب سوى قطرة من الدم الكامل. يمكن استخدام الأجهزة مع الماصات القياسية ، ولا تحتوي على أجزاء متحركة ، ولا تتطلب أنابيب أو مضخات حقنة خارجية.

تمتد الآثار المترتبة على هذه التقنية إلى التطبيقات السريرية مقارنة بتطبيقاتنا المطلوبة مع التقنيات التقليدية. يستغرق نهجنا دقائق من وقت جمع الدم إلى فحوصات هجرة العدلات. تمنع أمشاط ترشيح خلايا الدم الحمراء الجديدة كرات الدم الحمراء من منع الهجرة النشطة للعدلات وتميز هذه الطرق عن طرق الموائع الدقيقة الأخرى.

يتطلب ذلك إزالة الدم قبل إجراء فحوصات العلاج الكيميائي. يميز التشويش الميكانيكي لخلايا الدم الحمراء وقنواتها تقنيتنا ويتيح اختبار العدلات في بيئتنا الفسيولوجية للدم الكامل ، بما في ذلك المصل والصفائح الدموية. لذا فإن التكنولوجيا دقيقة وسهلة الاستخدام ، ويمكن أن تعزز بشكل كبير فهمنا لدور العدلات والجهاز المناعي الفطري C في الصحة والمرض.

بتصنيع رقاقة القالب الرئيسية لتحديد قنوات الهجرة وفقا لتعليمات النمط الأول من الشركة المصنعة. أول طبقة مقاومة للضوء السلبية القائمة على الإيبوكسي بثلاثة ميكرون ثم تنقش الطبقة الثانية 50 ميكرون لتحديد تحميل الخلية وغرف الكيموكين. الآن إلى أجهزة البولي ميثيل السوان المصبوب ، قم بخلط 20 جراما من PDMS بقوة مع جرامين من البادئ لمدة خمس دقائق.

صب PDMS بحذر على الرقاقة المزخرفة وتجفيف Degas في فراغ لمدة ساعة واحدة. ثم اخبز وقم بمعالجة أجهزة الموائع الدقيقة PDMS في فرن 65 درجة مئوية لمدة ثلاث ساعات على الأقل. للتأكد من خبز PDMS في درجة الحرارة الصحيحة ، تأكد من مراقبة درجة حرارة الفرن الداخلية باستخدام مقياس حرارة.

قم بإخراج غرف تحميل الدم الكامل المركزية بقطر 1.5 ملم. قم أيضا بإخراج أجهزة كاملة على شكل دونات بقطر 5.0 ملم. قم بإزالة الجزيئات من أجهزة الدونات باستخدام شريط لاصق.

بعد ذلك ، اشطف طبقا متعدد الآبار بالماء منزوع الأيونات وجففه بالنيتروجين بعد وضع الطبق في فرن 60 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. علاج بلازما الأكسجين لمدة 35 ثانية. ثم نضيف أجهزة الدونات وبلازما الأكسجين.

عالج مرة أخرى لمدة 35 ثانية أخرى. انقل الأجهزة بعناية إلى آبار اللوحة واخبزها بأجهزة مرتبطة على لوح ساخن 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد معالجة بلازما الأكسجين ، يكون الجهاز محبا للماء ويمكن أن تعزز التأثيرات الشعرية فتيلة القنوات الصغيرة في الجهاز.

بالنسبة للمحلول الجاذب الكيميائي ، امزج خمسة ميكرولترات من 10 ميكرومولار FMLP مع خمسة ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل مليلتر من فيبرونكتين ، و 490 ميكرولتر من HBSS. قم بسحب محلول الجاذب الكيميائي ببطء في ماصة غرفة تحميل الدم بالكامل و 20 ميكرولترا إضافيا من الجاذب الكيميائي حول الجزء الخارجي من الجهاز. ضع الطبق في مجفف لمدة 15 دقيقة.

ضع مكنسة كهربائية على الجهاز لتجهيز الجهاز بمحلول جاذب كيميائي. قم بإزالة اللوحة من المجفف وتأكد من ترطيب قناة الجهاز عن طريق الانخفاض التدريجي في حجم فقاعة الهواء. ثم اغسل غرفة تحميل الدم بالكامل والجزء الخارجي من الجهاز جيدا لإزالة محلول الجذب الكيميائي الزائد.

بعد ذلك لإنشاء تدرج من الجاذب الكيميائي من كل غرفة من غرف الكيماويكتيريا البؤرية إلى مركز الجهاز. قم بحقن 100 ميكرولتر من PBS برفق في الحفرة بحيث تتشكل قطرة من PBS أعلى الجهاز. قم بإمالة اللوحة والماصة ملليلتر واحد من PBS حول الجهاز لتجميعها في قاع البئر ، واستنشق السائل وكرر غسل PBS ثلاث مرات.

بعد ذلك ، املأ كل بئر بالوسائط لغمر الأجهزة واترك 15 دقيقة حتى يستقر التدرج. ثم قم ببسط ميكرولترين من الدم الكامل في كل غرفة تحميل دم كاملة. لجمع الدم بوخز الإصبع ، اغسل يديك بالماء والصابون.

جفف الجلد كمحلول مضاد للتخثر. أضف ملليلتر واحد من 0.2٪ HSA و 10 ميكرولتر من 32.4 خطاف ميكرومولار. وصمة عار على أنبوب جمع دم الهيبارين وخز إصبع المتبرع السليم وامسح أول قطرة دم.

اجمع 50 ميكرولترا من الدم في محلول البقع المضاد للتخثر واخلطه برفق. قم بإعداد الغرفة الحيوية على 37 درجة مئوية و 80٪ رطوبة و 5٪ CO2. ابدأ على الفور التصوير بفاصل زمني عند تكبير 10 × أو أعلى لإجراء تحليل إحصائي ذي مغزى ، وتتبع يدويا ما لا يقل عن 50 عدلة في كل عينة.

عد الخلايا التي تدخل غرف الانجذاب الكيميائي البؤري بمرور الوقت. ثم باستخدام الصورة J ، احسب سرعات العدلات في القناة بين WBLC و FCC. ثم لتحديد اتجاه العدلات ، احسب عدد الخلايا التي تمر بالتشعب واحسب النسبة بين عدد الخلايا التي تتجه نحو غرف الانجذاب الكيميائي البؤري والخلايا التي تخرج من الجهاز.

تتبع الخلايا غير الاتجاهية التدرج الكيميائي وبالتالي تهاجر بأعداد متساوية نحو لجنة الاتصالات الفيدرالية (FCC) وقناة الخروج. في هذه التجربة ، تم التحقق من صحة مقايسة الانجذاب الكيميائي للعدلات في الدم بالكامل عن طريق قياس تراكم العدلات باتجاه تدرج FMLP. تؤكد النتائج أن خلايا الدم الحمراء محاصرة بواسطة مشط الترشيح بينما تكون العدلات قادرة على الهجرة بنشاط من الدم الكامل.

تم تأكيد التدرج الخطي المستقر للجاذب الكيميائي الذي يتكون من جهاز الموائع الدقيقة للدم بالكامل باستخدام ديكستران المسمى FSE وتم قياس مستويات التألق بمرور الوقت. تكشف النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام منصة WB Chemotaxis الجديدة أن العدلات من جميع مصادر الدم تهاجر بسرعة ثابتة وبخلايا مهاجرة إجمالية مماثلة. الأهم من ذلك ، أن هذا النظام يسمح بتحديد كمية العدلات ، وبالتالي يميز الانجذاب الكيميائي عن العلاج الكيميائي الحركي بمجرد إتقانها ، يمكن إجراء هذه التقنية في أقل من 10 دقائق إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

دمج أجهزتنا في لوحة 12 أو 24 بئر باستخدام تقنيات الغرفة النظيفة القياسية ، والمرافق ، وفحص الظروف المتعددة في وقت واحد. باستخدام هذه التقنية ، يمكننا قياس سرعة العدلات واتجاهها على مستوى الخلية الواحدة. على عكس الطرق التقليدية التي تقيس ترحيل خلايا نقطة النهاية بالجملة ، تذكر أن تقوم بتجهيز جهاز الموائع الدقيقة بعناية وتحميل كلتا العينتين ببطء حتى لا يتم دفع كرات الدم الحمراء إلى ما بعد com الجهاز.

البروتوكول الموصوف مفيد بشكل خاص لقياس أوجه القصور الكيميائية للعدلات العابرة ، مما يسمح بأخذ عينات متكررة على مدى نقاط زمنية متعددة ، ولكن يمكن أيضا تكييفه لقياس هجرة أنواع الخلايا الأخرى من الكائنات الحية النموذجية المختلفة. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة للتغيرات المؤقتة في وظائف العدلات في المرضى الذين يعانون من حالات مختلفة مرتبطة بارتفاع معدل الإصابة بالعدوى ، بما في ذلك مرضى الصدمات والمرضى بعد الجراحة الكبرى ومرضى السرطان الذين يتلقون العلاج الكيميائي.