تجريب

الهدف العام من هذا الإجراء هو توفير اختبار بسيط باستخدام متاهة Y لاختبار حاسة الشم لدى ذبابة Drosophila melanogaster. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تجويع الذباب لمدة تتراوح من 16 إلى 18 ساعة، ليكون لديها دافع لاستكشاف بيئات جديدة تحتوي على محفزات متطايرة. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي تجميع إعداد متاهة Y التي تحتوي على مصادر الروائح على ورق ترشيح، مثل حمض الأسيتيك في مذيب مقابل المذيب وحده.

تتمثل الخطوة الثالثة في نقل الذباب بسرعة وبحذر إلى أنبوب التحميل. وبعد عدة ساعات، تكون الخطوة النهائية هي تسجيل موقع الذباب في المتاهة. وفي النهاية، يمكن أن تظهر النتائج استجابة تجاه المادة العطرية من خلال البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام متاهة Y.

تبادرَت إلينا فكرة هذه الطريقة عندما قررنا إيجاد وسيلة بسيطة وغير مكلفة لاختبار الاستجابة الشمية لدى الذباب. وتتمثل ميزة هذه التقنية مقارنة بالخيارات الأخرى في أنها تسمح للذباب باتخاذ قرار فيما إذا كان هناك قدر كبير من الإجهاد. ستقوم ميغان سايمون، طالبة الدكتوراه من مختبري، بشرح الإجراء. من أجل هذا البروتوكول، يجب تجهيز سلالة ذباب متجانسة ذات أنماط ظاهرية سلوكية مستقرة وقوية. وتصلح أي سلالة من هذا النوع كضابط مرجعي لاختبار الشم؛ وبالنسبة لكل سلالة وراثية ستُستخدم في التجربة، يتم تهجين السلالة عكسياً مع السلالة المرجعية لخمسة أجيال.

قم بتزويج إناث السلالة التجريبية المنفردة مع عدد قليل من الذكور المتماثلة جينياً لكل عملية تهجين عكسي. وبالنسبة لتجارب الشم، يتم تربية ذباب الدروزوفيلا على وسط دقيق الذرة القياسي مع إضافة مضاد حيوي تحت دورة ضوئية 1212، وفي درجة حرارة 25 °C.

يجب تنفيذ التجارب دائمًا عند 25 درجة Celsius وتحت إضاءة في أطياف الأحمر البعيد، والتي لا تراها ذبابة drosophila. كما يجب أن يكون من الممكن تهوية الغرفة بالكامل بين التجارب قبل إجراء المقايسة في صباح اليوم التالي. وفي نهاية اليوم، يتم نقل مجموعات مكونة من 10 إلى 20 خطًا تجريبيًا إلى قوارير زجاجية مع توفير الرطوبة من خلال منشفة مبللة.

يجب اختبار الذباب في غضون 16 إلى 18 ساعة، وإلا فقد يموت نتيجة للجفاف أو الجوع في اليوم التالي. قم بتجميع متاهة Y. ابدأ بتوصيل الموصل الذي يتخذ شكل Y بأنبوبين زجاجيين باستخدام موصلات رغوية مثبت بها رؤوس ماصات مقصوصة، والتي تشكل القنوات؛ حيث يجعل شكلها المستدق من هذه القنوات ممرات ذات اتجاه واحد.

يتم توصيل الفرع الثالث من وصلة Y بأنبوب تحميل مصنوع من الجزء الكبير من رأس ماصة، وهو ما يسمح بالمرور من قارورة التحميل إلى نقطة الاختيار في المتاهة. وتوجد قارورة زجاجية بعد كل نفق مستدق، حيث يجب تحميل إحداها بحمل عطري. تكون هذه الأحمال على شكل جرعات بحجم 40 µL مشربة في مربعات من ورق المناديل بمقاس 28 mm.

يجب أن يتم التناوب عشوائياً بين أي من الأنبوبين يحتوي على المادة العطرية لإجراء الاختبار أولاً. قم بتبريد الذباب على الثلج لفترة وجيزة لإبطاء حركته. يجب أن تتم هذه العملية تحت ضوء أحمر بعيد من مصابيح LED، وفي درجة حرارة 25 degrees Celsius، قم بإسقاط مجموعة الذباب برفق في أنبوب التحميل ثم ضع ذباب الاختبار في متاهة Y.

تجنب استخدام التخدير الغازي. من الضروري جداً نقل الذباب إلى أنبوب التحميل بسرعة وبرفق في آن واحد. تعد هذه الخطوة في الواقع الأصعب في هذه التجربة، إذ يجب أن يستيقظ الذباب بسرعة قبل انتشار الحشرات الأخرى في كتلة Y.

يجب ترك الذباب لاستكشاف المتاهة لمدة 24 ساعة، لضمان انتقال أكبر عدد ممكن من الذباب إلى إحدى القارورتين الزجاجيتين. ويُستخدم عدد الذباب الموجود في الأنابيب المختلفة لحساب المؤشر الشمي. كما ينبغي تطبيق الطرق الإحصائية القياسية على هذه القيمة التي تم جمعها من سلوك ما يصل إلى 10 ذبابات.

إذا لم تقدم 10 مجموعات من الذباب نتائج متسقة، يمكن إجراء التجارب باستخدام 20 مجموعة من الذباب. لتنظيف مكونات المتاهة، تُنقع المكونات وهي مفككة في RBS 35 MD طوال الليل. يتبع ذلك شطفها بماء الصنبور ثم شطفة نهائية بماء DI قبل تركها لتجف في الهواء.

الاستجابات القياسية لمادة عطرية. باستخدام متاهة Y، تشمل هذه الاستجابات الانجذاب، أو عدم المبالاة، أو التجنب. على سبيل المثال، تتجنب ذباب cantons بشدة حمض acetic بتركيز 10%، بينما لا تتجنب حمض pheno acetic بتركيز 10%.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن مقايسة الموجة هذه تمثل بيئة اصطناعية للذباب. يمكن اتباع هذا الإجراء كطريقة تكميلية، حيث يمكن إجراء مقايسات الساحة الممتلئة بالزملاء أو المقايسات الداخلية من أجل تأكيد الاستجابات الشمية للذباب والظروف المختلفة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية اختبار الاستجابات الشمية لـ filano gaste ببساطة باستخدام مقايسة SW.