تقييم التخليص أكلة الموت الخليوي في السكتة الدماغية التجريبية قبل Ligatable نيون تحقيقات

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسمية الخلايا البلعمية النشطة بشكل انتقائي ، والتي تزيل جثث الخلايا في السكتة الدماغية. يتم تحقيق ذلك عن طريق إعداد المكونات أولا لتفاعل تضخيم الإشارة القائم على Tite. الخطوة الثانية هي إعداد الأقسام.

بعد ذلك ، يتم إجراء تفاعل الملصقات باستخدام إنزيم اللقاح ، وتوبويزوميراز ومجسات الفلورسنت المسؤولة. الخطوة الأخيرة هي تحسين إشارة الفلورسنت القائمة على IDE. في النهاية ، يتم استخدام الفحص المجهري الفلوري لتقييم التصفية البلعمية للخلايا الميتة في أقسام الأنسجة لنقص تروية الدماغ البؤري.

يلعب إزالة الخلايا الميتة بواسطة الخلايا البلعمية دورا مهما في تعافي الدماغ بعد نقص التروية. تحدد الطريقة المقدمة كفاءة هذه العملية عن طريق تسمية أحجام البيجو التي تزيل الخلايا الميتة بنشاط فقط. على الرغم من أن هذه الطريقة توفر نظرة ثاقبة للدماغ الإقفاري ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة الإصابة الإقفارية في الأعضاء والأنسجة الأخرى.

حيث يكون التصفية الحمضية للخلايا الميتة مهمة. على الرغم من أن تضخيم إشارة IDE أو خطوة TSA تحدث في المرحلة النهائية من وضع العلامات ، إلا أن التحضير لهذا التفاعل قد يستغرق أكثر من ساعة. لذلك من الأنسب صنع كواشف TSA أولا.

تتمثل الخطوة الأولى في جعل محلول مخزون الفلورو أربعة TYROM عند 300 ميكرولتر من DMSO إلى ملفات كاشف التيروم المضمنة في مجموعة وضع العلامات على TSA. بعد ذلك ، قم بإعداد مخزن الغسيل TNT لإذابة الكاشف المانع تماما. عند عمل المخزن المؤقت للحجب TNB ، أضفه ببطء بزيادات صغيرة مع التقليب ، سخني المحلول تدريجيا إلى 55 درجة مئوية.

مع التحريك المستمر ، سيظهر المحلول حليبي ويجب إحضاره إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدام aliquot وتخزينه عند سالب 20 درجة مئوية للاستخدام طويل الأمد لهذا الإجراء ، ويتم تحضير الشرائح في وقت مبكر عن طريق تركيب أقسام بسمك خمسة ميكرومتر. قطع من أنسجة الفورمالين الثابتة. أولا ، قم بمعالجة الأقسام بالزيلين لمدة 15 دقيقة ، وأعد ترطيب الأقسام من خلال سلسلة من غسلات الإيثانول ، متبوعة بغسلتين في الماء.

بعد ذلك ، اصنع محلول عمل البروتيناز K عن طريق تخفيف محلول المخزون إلى 50 ميكروغرام لكل مليلتر في PBS. أصعب جزء في هذه التجربة هو تحديد المدة الزمنية المثالية لضوابط الهضم البروتيناز K مع أوقات هضم أقصر وأطول لضمان النجاح اعتمادا على حجم ونوع الأنسجة. أضف الحجم المناسب من محلول عمل البروتين ACE K إلى الأقسام واحتضانه لمدة 15 دقيقة عند 23 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، اغسل الأقسام بالماء المقطر مرتين لمدة خمس دقائق لكل منهما. أثناء نقع الأقسام ، قم بإعداد مزيج الملصقات الذي يحتوي على المسبار النشط. لتحضير محلول المسبار النشط ، امزج قليل النوكليوتيدات مع الماء ، وثلاثية الهيدروكلوريك ، والحمض الهيدروكلوريك ، واللقاح توبويزوميراز المزود في المجموعة الممزوج برفق عن طريق سحب العينة واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة للسماح بتنشيط المسبار.

بعد فترة الغسيل الثانية ، خذ الأقسام من البرطمان واستنشق الماء المتبقي. عندما تصبح جاهزا ، ضع محلول المسبار النشط الذي تم إعداده مسبقا. انزلق الأقسام واحتضانها لمدة 15 دقيقة عند 23 درجة مئوية.

بعد الحضانة ، اغمس الشرائح في الماء لإزالة زلات الغطاء برفق. اغسل الشرائح بالماء ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. بعد الغسيل الأخير ، قم بتغطية أقسام المناديل بمحلول مانع TNB واحتضان الشرائح في غرفة رطبة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

خلال هذا الوقت ، قم بإعداد مخفف من واحد إلى 100 من اقتران بيروكسيداز الفجل والفجل الحصاني. S-A-H-R-P في المخزن المؤقت لحجب TNB ، قم باسترداد الشرائح واستنشاق المخزن المؤقت لحجب TNB بعيدا. قبل تطبيق محلول S-A-H-R-P ، استخدم كاشفا كافيا لتغطية قسم الأنسجة بالكامل.

بمجرد تغطيتها ، احتضن الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة بعد الحضانة ، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها. في مخزن غسيل TNT في درجة حرارة الغرفة ، قم بإعداد مخفف من واحد إلى 50 من مخزون الفلورو أربعة TY IDE في مخفف تضخيم واحد x مباشرة قبل الاستخدام. ضع المحلول على الشرائح التي تغطي قسم الأنسجة بالكامل.

نظرا لأنه لا يمكن إعادة استخدام المحلول ، فتخلص من أي جزء غير مستخدم متبقي. احتضن الشرائح في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث إلى 10 دقائق. مراقبة التألق.

قم بزيادة تحت المجهر حتى تظهر التلميحات الأولى للهياكل في هذا الوقت. انتقل بسرعة إلى خطوة الغسيل. اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها.

في TNT اغسل المخزن المؤقت في درجة حرارة الغرفة مع التحريض. بعد الغسيل ، أضف المحلول المضاد للبهتان مع DPI وانزلاق الغطاء. راقب النتائج تحت المجهر الفلوري.

توضح هذه الصور مثالين على التصفية الحمضية ل PHA. يظهر البقع النووية الدابي في التألق الأزرق ويظهر مسبار vac topo المسؤول في مخططات مضان أخضر للأحداث المعروضة في هذه الصور تظهر نوى الخلايا البلعمية والنوى الإضافية التي ابتلعت التشنج اللاإرادي في مراحل مختلفة من الهضم. بمجرد إتقانها ، يمكن القيام بهذه التقنية في حوالي ثلاث ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، ستعرف كيفية استخدام مجسات الفلورسنت المسؤولة في أقسام الأنسجة. ستتمكن أيضا من تسمية الأدلة النشطة بشكل انتقائي لإزالة الخلايا الميتة في الدماغ الإقفاري.