عزل mRNAs والمرتبطين مع الميتوكوندريا الخميرة لدراسة آليات المترجمة ترجمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا المرتبطة بترجمة mRNAs. يتم تحقيق ذلك عن طريق حصاد خلايا الخميرة الأولى المزروعة في ظل ظروف إثراء الميتوكوندريا. الخطوة الثانية هي قمل الخلايا برفق في وجود cyclo heide.

بعد ذلك ، يتم فصل الميتوكوندريا عن المكونات القابلة للذوبان عن طريق الطرد المركزي التفاضلي. الخطوة الأخيرة هي استخراج الحمض النووي الريبي من الميتوكوندريا وعينات التحكم. في النهاية ، يتم استخدام التحليل الشمالي لإظهار نقاء وجودة الحمض النووي الريبي المرتبط بالميتوكوندريا.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنه يمكن عزل العديد من أنواع الحمض النووي الريبي في مستحضر واحد. لذلك ، يمكن إجراء تحليل مقارن. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي في بيولوجيا الخلية مثل الاستهداف داخل الخلايا والوظيفة العضوية.

في هذا الإجراء ، سيتم تنقية الميتوكوندريا من 100 إلى 150. نمت ملليلتر من خلايا الخميرة إلى OD 600 من واحد إلى 1.5 عند 30 درجة مئوية على نمو غير قابل للتخمير. متوسط. خلايا الطرد المركزي عند 3000 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية واغسل الحبيبات بجهاز طرد مركزي مزدوج بالماء المقطر مرة أخرى.

بعد التخلص من المادة الطافية ، قم بوزن حبيبات الخلية. عادة ما يتم الحصول على حوالي 0.6 جرام من 100 مل من الخلايا. يقوم Resus بتعليق الحبيبات في مليلتر واحد من المخزن المؤقت DTT لكل 0.5 جرام من الخلايا.

من المهم معالجة الخلايا بعامل اختزال من أجل كسر روابط كبريتيد الغبار داخل جدار الخلية ، وبالتالي تحسين التحلل المائي يحتضن الخلايا لمدة 10 دقائق عند 30 درجة مئوية مع الاهتزاز اللطيف. خلايا الطرد المركزي التالية عند 3000 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات.

في مليلتر واحد من المخزن المؤقت xmal liase لكل 0.15 جرام من الخلايا لا تدوام. قم بقياس OD 600 من 10 ميكرولتر من الخلايا في 990 ميكرولتر من الماء وسجل هذه القيمة. أضف xmal liase المحضر حديثا إلى الخلايا لتحلل بوليمرات الجلوكوز في بيتا واحد ثلاثة روابط جلوكان وتوليد Sphero plast.

من هنا فصاعدا ، يجب الاحتفاظ ب Sphero plast في محلول متساوي التوتر لتجنب التحلل ، واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع اهتزاز لطيف. للتحقق من التحلل المائي لجدار الخلية ومجال توليد البلاست ، قم بخلط 10 ميكرولتر من الخلايا مع 990 ميكرولتر من الماء وقم بقياس OD 600 من المتوقع أن تصاب لوحات Sphero بالقمل بسبب الاختلاف التناضحي ويجب أن يكون OD 600 أقل بعشرة أضعاف على الأقل من القيمة المحددة قبل إضافة xmal liase. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستمر في الحضانة باستخدام xmal liase لمدة 15 دقيقة أخرى.

أعد تعليق PHE من Plast مع 100 مل من وسط الاسترداد ونقل مجال البلاست إلى قارورة هيلين ماير. احتضن لمدة ساعة عند 30 درجة مئوية مع الرج. خطوة الاسترداد هذه ضرورية حيث يتم إيقاف الترجمة وتعطل توطين mRNA أثناء علاج XYs.

بعد ساعة واحدة ، أضف 0.1 ملليغرام لكل مليلتر ، cyclo heide ، وانقل Sphero plast إلى أنابيب مخروطية مبردة مسبقا سعة 50 مل. يعد إصدار Cyclo Heide مهما لتجميد ارتباط الريبوسومات ب mRNAs. وبالتالي ، يتم الحفاظ على ارتباط mRNA المعتمد على الريبوسوم بالميتوكوندريا.

جهاز الطرد المركزي ، مجال البلاس عند 3000 مرة من الجاذبية لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية واغسلها مرتين بالمانيتول البارد. المخزن المؤقت ريوس.

قم بتعليق مجال plass بأربعة ملليلتر من عازلة مانيتول الباردة وانقل التعليق إلى الخالط السفلي بسعة 15 مليلتر ومجهز بمدقة ضيقة. اكسر كرة plass برفق مع 15 ضربة وانقل المحللة إلى أنبوب 13 مل. جهاز الطرد المركزي المحللة عند 1،500 مرة الجاذبية لمدة ست دقائق عند أربع درجات مئوية.

لحبيبات النوى والخلايا غير المكسورة. انقل سوبر ناتين بعناية إلى أنبوب جديد. ضع جانبا ملليلتر واحد أو 25٪ من العينة كعينة غير مجزأة أو إجمالية.

انقل 50 ميكرولترا من هذه العينة إلى أنبوب جديد وأضف 15 ميكرولترا من أربعة XLSB. لتحليل الدم الغربي ، سيتم ترسيب الحمض النووي الريبي من بقية العينة الإجمالية لتحليلات المصفوفات الشمالية والمصفوفات الدقيقة. الطرد المركزي سوبر ناتين في 10 ، 000 مرة.

الجاذبية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. لحبيبات الميتوكوندريا ، انقل السوبر ناتين إلى أنبوب جديد واحتفظ به على الجليد. هذا هو الجزء العصاري الخلوي.

انقل 50 ميكرولترا من هذه العينة إلى أنبوب جديد وأضف 15 ميكرولترا من أربعة XLSB. لتحليل اللطخة الغربية ، سيتم ترسيب الحمض النووي الريبي من بقية عينة العصارة الخلوية لتحليلات المصفوفات الشمالية والمصفوفات الدقيقة. اغسل الحبيبات بثلاثة ملليلتر من المانيتول والمخزن المؤقت وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 10 ، 000 مرة.

الجاذبية لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. يقوم Reus بتعليق الحبيبات بثلاثة ملليلتر من المانيتول العازل. تحتوي هذه العينة على الميتوكوندريا ويشار إليها باسم جزء الميتوكوندريا.

انقل 50 ميكرولترا من هذه العينة إلى أنبوب جديد وأضف 15 ميكرولترا من أربعة XLSB لتحليل اللطخة الغربية. لبدء هذا الإجراء ، أضف إلى كل عينة حجما واحدا من ثمانية مولار من غواد ديوم ، HCEL ومجلدين من دوامة الإيثانول 100٪ واحتضانها لمدة ساعتين على الأقل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. الطرد المركزي للعينات عند 10،000 مرة الجاذبية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية. كن حذرا لأن الحبيبات قد تكون غير مستقرة. بعد غسل الحبيبات ب 70٪ ريوس الإيثانول ، قم بتعليق الحبيبات ب 400 ميكرولتر من الماء الحر من الحمض النووي الريبي وانقل العينة إلى أنبوب einor جديد.

قم بترسيب الحمض النووي الريبي مرة أخرى عن طريق إضافة 0.1 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية درجة الحموضة 5.2 ومجلدين من دوامة الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانها لمدة ساعتين على الأقل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. عينات أجهزة الطرد المركزي في 20 ، 000 مرة. الجاذبية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الطافية واغسلها بنسبة 70٪ من الإيثانول. تجفيف الحبيبات في الهواء وتعليق الإعادة باستخدام الحمض النووي الريبي الخالي من الحمض النووي الريبي لتخزين المياه. عينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

يمكن استخدام العينات لاحقا لتحليلات المصفوفات الشمالية أو المصفوفات الدقيقة. لإعداد الحمض النووي الريبي لتحليل المصفوفات الدقيقة ، قم أولا بتعليق كل حبيبات MRNA تم الحصول عليها من guin HCL وهطول الأمطار الإيثانول مع 650 ميكرولتر من الماء الخالي من الحمض النووي الريبي ونقله إلى أنبوب orph ذو غطاء لولبي. ثم أضف 650 ميكرولتر من الفينول الحمضي الكلوروفورم والدوامة بقوة بأقصى سرعة لمدة دقيقتين.

نقل 500 ميكرولتر من المرحلة المائية العلوية إلى أنبوب جديد. تجنب أخذ الطور البيني لاحتوائه على الحمض النووي. احرص أيضا على تجنب تناول الفينول ، والذي يمكن أن يثبط تفاعل النسخ العكسي.

قم بإزالة الهيبارين من عينة الحمض النووي الريبي عن طريق ترسيب كلوريد الليثيوم. أضف كلوريد الليثيوم إلى التركيز النهائي البالغ مليين واحتضان العينات طوال الليل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر في اليوم التالي. قم بإذابة العينات عند أربع درجات مئوية وأجهزة الطرد المركزي عند 20،000 مرة.

الجاذبية لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية بعناية واغسل الحبيبات باستخدام جهاز طرد مركزي للإيثانول بنسبة 80٪. مرة أخرى ، تخلص من الهواء الطافي الجاف وأعد تعليق الحبيبات في 150 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الحر من الماء لإزالة أي بقايا من كلوريد الليثيوم يترسب مرة أخرى بحجم 0.1 من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولار درجة الحموضة 5.3 وثلاثة أحجام من 100٪ يحتضن الإيثانول عند 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة ساعتين على الأقل.

جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. اغسل الحبيبات الشفافة بعناية باستخدام 80٪ من الإيثانول وجففها في الهواء. أخيرا ، قم بتعليق الحبيبات ب 25 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي الخالي من الماء واحتفظ بالعينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.

الأفضل اختبار نجاح هذا البروتوكول في فصل جزء يحتوي على الميتوكوندريا عن مكونات العصارة الخلوية من خلال إجراء التحليل الشمالي والتحليل الغربي على عينات من خطوات العزل المختلفة. في هذا المثال ، كانت العينات من قبل التجزئة أو الكسر الكلي ، وجزء العصارة الخلوية وجزء الميتوكوندريا. تم إجراء التحليل الشمالي ل mRNAs التالية ، COB و RNA.

يتم نسخ ذلك داخل الميتوكوندريا ، ثاني أكسيد الكربون و MRNA الذي يشفر بروتينا يتم استيراده إلى الميتوكوندريا. جهاز التصوير المقطعي المحوسب ، وهو Mr.Nna الذي يشفر بروتين الأكتين العصاري الخلوي و SEC 61 و M nna الذي يشفر بروتين مقيم في ER. اللوحة السفلية عبارة عن تلطيخ أزرق الميثيلين للغشاء الشمالي حيث تم الكشف عن شريطين بارزين من الحمض النووي الريبي 25 ثانية و 18 ثانية.

نظرا لأن COB يتم نسخها داخل الميتوكوندريا ، يجب أن تكون إشارتها حصريا في الميتوكوندريا. كما لوحظ في هذه الدراسة. سيشير ظهور COB في الجزء العصاري الخلوي إلى تحلل الميتوكوندريا أثناء التحضير.

ACO One بتشفير البروتين الذي يتم استيراده إلى الميتوكوندريا ويظهر في الغالب في جزء الميتوكوندريا. يقوم التصوير المقطعي المحوسب بتشفير بروتين العصارة الخلوية وبالتالي يظهر في الغالب في الجزء العصاري الخلوي. يشير وجود SEC 61 في جزء الميتوكوندريا إلى وجود مكونات ER في هذا الكسر.

تظهر إشارات الحمض النووي الريبي في كلا الكسرين مما يشير إلى وجود الريبوسومات. تم إجراء التحليل الغربي للبروتينات التالية ، الميتوكوندريا POR one A ، وبروتين الغشاء الخارجي hx ، و K one A ، والبروتين العصاري الخلوي CUE one ، وبروتين ER و RPL 39. تم اكتشاف بروتين ريبوسومي كما هو متوقع POR إشارة واحدة فقط في جزء الميتوكوندريا.

إذا تم اكتشاف إشارة POR واحدة في الجزء الخلوي ، فسيشير ذلك إلى تفكك مكونات الميتوكوندريا أثناء التحضير. أيضا ، كما هو متوقع ، تم اكتشاف hx K واحد فقط في الجزء العصاري الخلوي. تشير إشارة CUE القوية في جزء الميتوكوندريا إلى أن كميات كبيرة من المواد المتعلقة ب ER معزولة بشكل مشترك في جزء الميتوكوندريا.

قد يكون هذا نتيجة للاتصالات الجسدية المعروفة بين غرفة الطوارئ والميتوكوندريا. تظهر إشارة RPL 39 في كلا الكسرين ، مرة أخرى ، تؤكد وجود الريبوسومات في كلا الكسرين ، باستثناء خطوة الاسترداد من الإجراء يؤدي إلى اختفاء الريبوسومات من الجزء M ، مما سيؤثر على ارتباط mRNA بالميتوكوندريا. بالإضافة إلى التحقق من جودة الفصل بين مكونات الميتوكوندريا والعصارة الخلوية ، من المهم التأكد من أن الحمض النووي الريبي أو البروتينات في العينات سليمة ولا توجد خسائر شديدة في الحمض النووي الريبي أو البروتينات أثناء تحضير العينة.

يجب الكشف عن الحمض النووي الريبي والبروتينات السليمة كنطاقات متميزة في التحليلات كما هو موضح هنا. بالنسبة ل c CCP واحد mRNA ، الذي يشفر بروتينا يتم استيراده إلى الميتوكوندريا ، فإن ظهور نطاقات أو مسحات أقصر إضافية سيشير إلى التدهور. ستؤدي الخسائر الفادحة إلى فرق كبير بين الكمية الإجمالية والكمية النسبية للإشارة ، والتي لم يتم ملاحظتها معا.

تؤكد هذه النتائج صحة هذا البروتوكول كطريقة فعالة لعزل mRNAs والريبوسومات والبروتينات في إجراء واحد. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طرق على مستوى الجينوم مثل RNA-Seq أو التحليل البروتيني من أجل تحديد السمات الرئيسية والفريدة للوظائف العضوية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية عزل الحمض النووي الريبي المرتبط بالميتوكوندريا.