عزل mRNAs والمرتبطين مع الميتوكوندريا الخميرة لدراسة آليات المترجمة ترجمة

الهدف العام من هذا الإجراء هو عزل الميتوكوندريا المرتبطة بجزيئات mRNA التي تخضع للترجمة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حصاد خلايا الخميرة التي نمت في ظروف تؤدي إلى إثراء الميتوكوندريا. وتتمثل الخطوة الثانية في تحلل الخلايا بلطف في وجود cyclo heximide.

بعد ذلك، يتم فصل المتقدرات عن المكونات الذائبة بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. وتتمثل الخطوة النهائية في استخلاص RNA من المتقدرات وعينات الضبط. وفي الختام، يتم استخدام تحليل northern لإثبات نقاء وجودة RNA المرتبط بالمتقدرات.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية في إمكانية عزل أنواع عديدة من الـ RNA في تحضير واحد، مما يتيح إجراء تحليل مقارن. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة جوهرية في بيولوجيا الخلية، مثل الاستهداف داخل الخلايا والوظائف العضوية.

في هذا الإجراء، سيتم تنقية الميتوكوندريا من 100 إلى 150 ملي لتر من خلايا الخميرة التي تم تنميتها حتى تصل قيمة OD 600 إلى 1 إلى 1.5 عند 30 °C في وسط نمو غير تخميري. تُطرد الخلايا مركزياً عند 3000 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يُتخلص من السائل الطافي وتُغسل الراسبة بالماء المقطر مرتين ثم تُطرد مركزياً مرة أخرى.

بعد التخلص من الطافي، قم بوزن كتلة الخلايا المترسبة. عادةً ما يتم الحصول على حوالي 0.6 grams من 100 milliliters من الخلايا. أعد تعليق الكتلة المترسبة في واحد milliliter من DTT buffer لكل 0.5 grams من الخلايا.

من المهم معالجة الخلايا باستخدام عامل مختزل من أجل كسر روابط ثنائي الكبريتيد داخل جدار الخلية، مما يؤدي إلى تحسين التحلل المائي؛ قم بتحضين الخلايا لمدة 10 دقائق عند 30 °C مع الرج اللطيف. بعد ذلك، قم بطرد الخلايا مركزياً عند 3000 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب.

في 1 مل من xmal liase buffer لكل 0.15 جرام من الخلايا، تجنب استخدام جهاز الرج (vortex). قم بقياس الكثافة الضوئية OD 600 لعينة حجمها 10 µL من الخلايا في 990 µL من الماء وسجل هذه القيمة. أضف xmal liase المحضر حديثاً إلى الخلايا لتحلل بوليمرات الجلوكوز عند روابط beta one three glucan وتكوين Sphero plast.

من هذه النقطة فصاعداً، يجب حفظ الـ Sphero plast في محلول متساوي التوتر لتجنب التحلل، تُحضن الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 30 degrees Celsius مع الرج اللطيف. وللتحقق من تحلل الجدار الخلوي وتكون الـ sphere of plast، اخلط 10 µL من الخلايا مع 990 µL من الماء وقم بقياس OD 600. من المتوقع أن تتحلل الـ Sphero plats بسبب الفرق الاسموزي، ويجب أن تكون قيمة OD 600 أقل بعشر مرات على الأقل من القيمة التي تم تحديدها قبل إضافة xmal liase. وفي حال لم يحدث ذلك، استمر في التحضين مع xmal liase لمدة 15 دقيقة أخرى.

أعد تعليق PHE الخاص بـ Plast باستخدام 100 milliliters من وسط الاستعادة وانقل كرة plast إلى دورق Helen Meyer. قم بالتحضين لمدة ساعة واحدة عند 30 degrees Celsius مع الرج. خطوة الاستعادة هذه ضرورية لأن عملية الترجمة تتوقف ويتعطل تموضع mRNA أثناء معالجة XYs.

بعد مرور ساعة واحدة، أضف 0.1 mg/mL من cyclo heximide، وانقل الـ Spheroplasts إلى أنابيب مخروطية سعة 50 mL مبردة مسبقاً. تعد إضافة cyclo heximide ضرورية لتثبيت ارتباط الريبوسومات بـ mRNAs، وبذلك يتم الحفاظ على ارتباط mRNA بالميتوكوندريا المعتمد على الريبوسومات.

قم بطرد مركزي للكرة البلاستيكية عند 3000 ×g لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C. تخلص من الطافي واغسل مرتين بمانيتول بارد. إعادة استخدام المنظم.

علق كرات البلازم (sphere of plass) باستخدام 4 mL من منظم المانيتول البارد، وانقل المعلق إلى مجانس سفلي بسعة 15 mL مجهز بمدقة محكمة الإغلاق. قم بتكسير كرات البلازم بلطف من خلال 15 ضربة، ثم انقل المادة المحللة إلى أنبوب سعة 13 mL. قم بطرد المادة المحللة مركزياً عند 1,500 ×g لمدة ست دقائق عند درجة حرارة 4 °C.

لترسيب النوى والخلايا غير المتكسرة. انقل الطافي بعناية إلى أنبوب جديد. اعزل 1 mL أو 25% من العينة كعينة غير مجزأة أو عينة كلية.

انقل 50 µL من هذه العينة إلى أنبوب جديد وأضف 15 µL من four XLSB. ولتحليل western blood، سيتم ترسيب RNA من بقية العينة الكلية لإجراء تحليلات northern وmicroarray. قم بطرد السائل العلوي مركزياً بسرعة 10,000 ×g.

الترسيب بالجاذبية لمدة 10 minutes عند درجة حرارة four degrees Celsius. ولترسيب الميتوكوندريا، انقُل السائل الطافي إلى أنبوب جديد واحفظه على الثلج. يمثل هذا الجزء السيتوسولي.

انقل 50 µL من هذه العينة إلى أنبوب جديد وأضف 15 µL من four XLSB. ولإجراء تحليل western blot، سيتم ترسيب RNA من بقية عينة السيتوسول لإجراء تحليلات northern وmicroarray. اغسل الراسب بـ 3 mL من mannitol buffer ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 10,000 ×g.

الترسيب بالجاذبية لمدة 10 minutes عند درجة حرارة 4 °C. ثم يتم إعادة تعليق الراسب باستخدام 3 mL من منظم المانيتول (mannitol buffer). تحتوي هذه العينة على الميتوكوندريا ويشار إليها باسم كسر الميتوكوندريا.

انقل 50 µL من هذه العينة إلى أنبوب جديد وأضف 15 µL من XLSB 4 لتحليل Western blot. لبدء هذا الإجراء، أضف إلى كل عينة حجماً واحداً من guanidinium hydrochloride بتركيز 8 M وحجمين من ethanol 100%، ثم قم بالرج باستخدام vortex والتحضين لمدة ساعتين على الأقل عند درجة حرارة -20 °C. قم بتركيز العينات باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 10,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

تخلص من الطافي. توخ الحذر لأن الراسب قد يكون غير مستقر. بعد غسل الراسب باستخدام 70% ethanol، قم بإذابة الراسب في 400 microliters من الماء الخالي من RNAs وانقل العينة إلى أنبوب einor جديد.

قم بترسيب الـ RNA مرة أخرى بإضافة 0.1 حجم من خلات الصوديوم بتركيز ثلاثة مولار ورقم هيدروجيني pH 5.2 وحجمين من الإيثانول بتركيز 100%، ثم قم بالرج باستخدام جهاز vortex والتحضين لمدة ساعتين على الأقل عند درجة حرارة -20 °C. قم بطرد العينات مركزياً عند 20,000 ×g لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.

تخلص من الطافي واغسل الراسب باستخدام 70% ethanol. اترك الراسب ليجف في الهواء ثم أعد تعليقه باستخدام ماء خالٍ من الـ RNAs، واحفظ عينات الـ RNA عند درجة حرارة -80 °C.

يمكن استخدام العينات لاحقاً في تحليلات northern أو تحليلات المصفوفات الدقيقة (microarray). ولتحضير الـ RNA لتحليل المصفوفات الدقيقة، قم أولاً بإعادة تعليق كل حبيبة MRNA تم الحصول عليها من الترسيب باستخدام Guanidine HCl والإيثانول في 650 µL من الماء الخالي من الـ RNase ونقلها إلى أنبوب ميكروسنتي بـغطاء لولبي. بعد ذلك، أضف 650 µL من الفينول الكلوروفورم الحمضي وقم بالرج بقوة باستخدام جهاز vortex، ثم قم بالطرد المركزي بالسرعة القصوى لمدة دقيقتين.

انقل 500 µL من الطور المائي العلوي إلى أنبوب جديد. تجنب سحب الطور البيني لأنه يحتوي على DNA. كما يجب الحرص على تجنب سحب الفينول، الذي يمكن أن يثبط تفاعل النسخ العكسي.

قم بإزالة الهيبارين من عينة الـ RNA عن طريق الترسيب باستخدام كلوريد الليثيوم. أضف كلوريد الليثيوم ليصل التركيز النهائي إلى 2 M واحضن العينات طوال الليل عند -20 °C. وفي اليوم التالي، قم بإذابة العينات عند 4 °C ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 20,000 ×g.

طرد مركزي بالجاذبية لمدة 20 دقيقة عند 4 °C. تخلص من السائل الطافي بعناية واغسل الراسب باستخدام إيثانول 80% عبر جهاز الطرد المركزي. تخلص من السائل الطافي مرة أخرى، ثم جفف بالهواء وأعد تعليق الراسب في 150 µL من ماء خالٍ من RNase لإزالة أي رواسب متبقية من كلوريد الليثيوم، ثم كرر العملية بإضافة 0.1 حجم من خلات الصوديوم 3 M عند pH 5.3 وثلاثة أحجام من إيثانول 100%، ثم حضن العينة عند -20 °C لمدة ساعتين على الأقل.

قم بإجراء الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C. اغسل الراسب الشفاف بعناية باستخدام 80% ethanol واتركه ليجف في الهواء. وأخيرًا، أعد تعليق الراسب في 25 µL من الماء الخالي من RNAs واحفظ العينات عند درجة حرارة -80 °C.

يتم التحقق من نجاح هذا البروتوكول في فصل جزء يحتوي على الميتوكوندريا عن مكونات السيتوسول بشكل أفضل عن طريق إجراء تحليل northern analysis وتحليل Western analysis على عينات من خطوات العزل المختلفة. في هذا المثال، كانت العينات مأخوذة من مرحلة ما قبل التجزئة أو الجزء الكلي، وجزء السيتوسول، وجزء الميتوكوندريا. تم إجراء تحليل Northern analysis لـ mRNAs التالية، COB an RNA.

يتم نسخ ذلك داخل الميتوكوندريا، CO1 وهو mRNA يشفر بروتيناً يتم استيراده إلى الميتوكوندريا. وACT1 وهو mRNA يشفر بروتين الأكتين السيتوبلازمي، وSEC61 وهو mRNA يشفر بروتيناً مقيماً في الشبكة الإندوبلازمية. يوضح اللوح السفلي صبغاً بصبغة ميثيلين الأزرق لغشاء Northern حيث تم الكشف عن نطاقين بارزين من RNAs هما 25 s و18 s.

بما أن جين COB يتم نسخه داخل الميتوكوندريا، فيجب أن تكون إشارته محصورة في الميتوكوندريا فقط، كما لوحظ في هذه الدراسة. إن ظهور COB في الجزء السيتوسولي يشير إلى حدوث تحلل للميتوكوندريا أثناء عملية التحضير.

يُشفر ACO one بروتيناً يتم استيراده إلى الميتوكوندريا، وبالتالي يظهر غالباً في جزء الميتوكوندريا. بينما يُشفر ACT one بروتيناً سيتوسولياً، لذا يظهر غالباً في الجزء السيتوسولي. ويشير وجود SEC 61 في جزء الميتوكوندريا إلى وجود مكونات الشبكة الإندوبلازمية في هذا الجزء.

تظهر إشارات الـ RNAs في كلا الكسرين، مما يشير إلى وجود الريبوسومات. تم إجراء تحليل Western للبروتينات التالية: POR 1 A (بروتين الغشاء الخارجي للميتوكوندريا)، و hx (بروتين K 1 A السيتوبلازمي)، و CUE 1 (بروتين الشبكة الإندوبلازمية)، و RPL 39 (بروتين ريبوسومي). وكما هو متوقع، تم اكتشاف إشارة POR 1 فقط في الكسر الميتوكوندري.

إذا تم اكتشاف إشارة POR1 في الجزء السيتوزولي، فإن ذلك سيشير إلى تفكك المكونات الميتوكوندرية أثناء التحضير. كما هو متوقع، تم اكتشاف hx K1 فقط في الجزء السيتوزولي. وتشير إشارة CUE1 القوية في الجزء الميتوكوندري إلى أن كميات كبيرة من المواد المرتبطة بالشبكة الإندوبلازمية قد تم عزلها بشكل مشترك في الجزء الميتوكوندري.

قد يكون هذا نتيجة للتلامسات الفيزيائية المعروفة بين الشبكة الإندوبلازمية والميتوكوندريا. تظهر إشارة RPL 39 في كلا الكسرين، مما يؤكد مجدداً وجود الريبوسومات في كليهما، حيث أن استبعاد خطوة الاسترداد من الإجراء يؤدي إلى اختفاء الريبوسومات من كسر M، وهو ما سيؤثر على ارتباط mRNA بالميتوكوندريا. وبالإضافة إلى التحقق من جودة الفصل بين المكونات الميتوكوندرية والسيتوسولية، من المهم التأكد من أن الـ RNA أو البروتينات في العينات سليمة وعدم وجود فقدان شديد للـ RNA أو البروتينات أثناء تحضير العينات.

يجب أن تظهر جزيئات RNA والبروتينات السليمة كحزم متميزة في التحليلات كما هو موضح هنا. بالنسبة لـ c CCP، فإن ظهور حزم أقصر إضافية أو لطخات لـ mRNA واحد، والذي يشفر بروتيناً يتم استيراده إلى الميتوكوندريا، سيشير إلى حدوث تحلل. ستؤدي الخسائر الشديدة إلى فرق ملحوظ بين الكمية الإجمالية والكمية النسبية للإشارة، وهو ما لم يتم ملاحظته عند النظر في النتائج مجتمعة.

تؤكد هذه النتائج صحة هذا البروتوكول باعتباره طريقة فعالة لعزل mRNAs، والريبوسومات، والبروتينات في إجراء واحد. وبناءً على هذا الإجراء، يمكن تنفيذ طرق تحليل شاملة للجينوم مثل RNA-Seq أو التحليل البروتومي لتحديد السمات الرئيسية والفريدة لوظائف العضيات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن تكون لديك معرفة جيدة بكيفية عزل RNA المرتبط بالميتوكوندريا.