تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

الهدف العام من التجارب التالية هو مراقبة نشاط الالتهابات في الخلايا المتغصنة البشرية في المختبر باستخدام فحوصات قراءة بيتا واحدة IL واحدة. أضف أولا R 8 48 إلى الخلايا للحث على تعبير بيتا واحد داخل الخلايا. ثم أضف nige لتنشيط تكوين NLRP ثلاثة التهابات.

وهذا بدوره يؤدي إلى انقسام برو IL بيتا واحد إلى IL ناضج بيتا واحد قبل الإفراز. بعد ذلك ، اجمع العينات وقم بقياس نتائج pro IL one beta داخل الخلايا و IL one beta الناضجة خارج الخلية التي تم الحصول عليها عن طريق قياس إفراز IL one beta من الخلايا المعدة والمنشطة عن طريق التألق المناعي واللطخة الغربية و eli. أظهر الكشف أن تحضير DCS البشري ينتج عنه إنتاج بيتا واحد داخل الخلايا في R 8 48 خلايا معدة وإفراز IL واحد بيتا من الخلايا المعدة والمنشطة باستخدام القانون النيجيري.

يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة لدور NLRP ثلاثة التهابات في استجابة الخلايا المتغصنة البشرية للروابط الاصطناعية. يمكن أيضا تطبيقه على أنظمة أخرى مصممة لاختبار المحفزات الفسيولوجية مثل البكتيريا والفيروسات والأمراض الالتهابية الذاتية. Aliquot 200 ميكرولتر من الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا الوحيدة المعزولة حديثا في حالة الراحة في صفيحة سفلية مستديرة 96 جيدا.

ابدأ بالشروط القياسية الأربعة للتحكم السلبي غير المحفز ، والتحضير فقط ، والتنشيط فقط ، والتحضير متبوعا بالتنشيط. ثم وفقا للتصميم التجريبي ، قم بتضمين عناصر التحكم المخففة ل R 8 48 و nissin لمقايسات تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا المصب تتضمن نسخا مكررة لضوابط النمط المتماثل لتجهيز الالتهابات. أضف R 8 48 ، أضف تركيزا نهائيا 10 ميكرومولار إلى الآبار المناسبة.

ضع الخلايا في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 18 ساعة. ثم لتنشيط NLRP ثلاثة التهابات ، أضف nige بتركيز نهائي 20 ميكرومولار. إعادة المزارع إلى الحاضنة لمدة ست ساعات إضافية لحصاد العينات الطرد المركزي للوحة الاستزراع عند 974 مرة G لمدة ثلاث دقائق دون إزعاج كريات الخلية.

انقل كل مادة طافية إلى صفيحة سفلية مستديرة منفصلة لقياس إفراز السيتوكين بواسطة EISA. الآن اغسل الكريات الخلوية ثلاث مرات باستخدام 200 ميكرولتر من XPBS واحد لإزالة أي بيتا خارج الخلية من العينات الخلوية لمزيد من التحليل من خلال مجموعة متنوعة من التقنيات للكشف عن اللطخة الغربية للبرو IL واحد بيتا ليس الخلايا مباشرة في 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل تغيير الطبيعة. بعد نقل المحللات إلى أنابيب einor سعة 1.5 مليلتر ، قم بتسخين العينات لمدة 10 دقائق عند 100 درجة مئوية للكشف عن الفلورسنت عن طريق قياس التدفق الخلوي ل IL واحد بيتا.

أضف 100 ميكرولتر من وسائط PHS بنسبة 5٪ إلى العينات الخلوية وميكرولتر واحد من الأجسام المضادة المصنفة بالفلورسنت إلى علامات النمط الظاهري أو احتضان التحكم في النمط المتماثل لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ثلاث غسلات PBS ، قم بإصلاح الخلايا ب 100 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت القابل للاختراق لمدة 30 دقيقة ، متبوعا ب 62 نانوغراما من الجسم المضاد المضاد ل IL واحد بيتا FSE أو التحكم في النمط المتماثل يحتضن عينات لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية.

اغسل الخلايا ثلاث مرات ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت القابل للاختراق وأعد تعليقها في XPBS واحد. لف العينات بورق القصدير وخزنها على درجة حرارة أربع درجات مئوية. إذا اكتشفت IL واحد بيتا عن طريق الفحص المجهري ، قم بإزالة الخلايا اللاصقة مع dappy ، أضف جبلا وضع زلة غطاء برفق فوق شريحة زجاجية.

اسمح للجبل بالشفاء طوال الليل قبل التقاط صور الفحص المجهري للكشف عن الفلورسنت عن طريق قياس التدفق الخلوي. الحصول على البيانات عينة واحدة في كل مرة. قم بتعيين البوابات المتناثرة الأمامية والجانبية على الخلايا الحية البوابة التالية على الخلايا السالبة CD 11 C الموجبة CD 14.

أخيرا ، قم بتحليل مجموعة MODC بناء على تلطيخ بيتا واحد في الحصول على بيانات الفحص المجهري. اضبط وقت التعرض باستخدام العينة المعالجة باللون الإيجابي R 8 48. ثم حدد النسبة المئوية ل pro IL one beta التي تعبر عن سهولة MO dcs للكشف عن اللطخة الغربية.

قم بتحميل الحجم الكلي للعينة على هلام بولي أكريلاميد. قم بتشغيل 140 فولت حتى تنفد مقدمة القالب من الجل. انقل البروتين من هلام بولي أكريلاميد إلى A-P-V-D-F immo على غشاء FL.

سد الغشاء بنسبة 5٪ BSA في TBST لمدة ساعة واحدة. احتضان الجسم المضاد الأساسي أثناء الاهتزاز عند أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد ثلاث غسلات من TBST لمدة خمس دقائق ، تحتضن الجسم المضاد الثانوي في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة بعد ثلاث غسلات أخرى من TBST ، قم بتصوير الغشاء عند قياس السيتوكينات المفرزة بواسطة ELI SA ، وتوازن العينات في درجة حرارة الغرفة.

قم بتدوير العينات لتوحيد التكثيف الطافي واتبع تعليمات الشركة المصنعة لقياس IL واحد بيتا تلطيخ السيتوكين داخل الخلايا للمحترفين IL ، يسمح بيتا واحد بالفحص المجهري وقراءات الحقائق من الخلايا المتغصنة المشتقة من الخلايا المتغصنة الخالية من الخلايا الوحيدة السلبية CD 11 C الإيجابية CD 14. يمكن تحديد كلتا التقنيتين بالنسبة للتحكم في الخلايا غير الأولية أو المريحة بالإضافة إلى التحكم في النمط المتماثل. يتم ضرب النسبة المئوية لخلايا صبغة بيتا الاحترافية في المتوسط الهندسي لهذه المجموعة لتوفير متوسط كثافة الفلورسنت.

يمكن مقارنة MFI بكمية pro IL one beta الموجودة في خلايا البقع الإيجابية. هنا. تستخدم تقنيات النشاف المناعي لقياس برو IL واحد بيتا من محللات الخلية. يتم التعبير عن البيانات الكمية بالنسبة للتحكم الخلوي الداخلي مثل بيتا توبولين كما هو متوقع.

يكشف النشاف المناعي للبرو IL واحد بيتا في الخلايا المعالجة NI النيجيرية عن انخفاض في pro IL واحد بيتا. ويكمل ذلك زيادة متزامنة في IL واحد بيتا في المواد الطافية ، مقاسة بواسطة E ELI a فقط R 8 48 ، تليها ظروف NI النيجيرية. يضمن القياس المتزامن للسيتوكينات الالتهابية الأخرى مثل T NF و alpha و IL 10 و IL six أن النيجر محددة في التسبب في إفراز IL one beta.

يعتمد مستوى التحضير على الوقت والجرعة. ستساعد التجارب الإضافية مثل قياس تركيز البروتين خارج الخلية السابقة ، أو اكتشاف التلألؤ الكيميائي من جيل بيتا الناضج الأول أو منع الالتهابات في تحديد ما إذا كان IO خارج الخلية هو الشكل المشقوق الناضج وما إذا كان إفراز IO one beta هو nlrp. ثلاثة نشاط التهابي يعتمد.