تفعيل وقياس NLRP3 Inflammasome آخر عن طريق IL-1β في الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات الإنسان

الهدف العام من التجارب التالية هو رصد نشاط الجسيم الالتهابي في الخلايا التغصنية البشرية في المختبر باستخدام مقايسات قراءة بسيطة لـ IL one beta. أولاً، يتم إضافة R 8 48 إلى الخلايا لتحفيز التعبير عن pro IL one beta داخل الخلايا. ثم يتم إضافة nige لتنشيط تكوين الجسيم الالتهابي NLRP three.

يؤدي ذلك بدوره إلى تحفيز انشطار pro IL one beta إلى IL one beta الناضج قبل إفرازه. بعد ذلك، يتم جمع العينات وقياس مستويات pro IL one beta داخل الخلايا وIL one beta الناضج خارج الخلايا، وذلك من خلال قياس إفراز IL one beta من الخلايا المجهزة والمنشطة باستخدام التألق المناعي (immunofluorescence)، وبصمة ويسترن (western blot)، ومقايسة الـ eli. ويظهر الكشف أن تجهيز خلايا DCS البشرية يؤدي إلى إنتاج pro IL one beta داخل الخلايا في الخلايا المجهزة بـ R 8 48، وإفراز IL one beta من الخلايا المجهزة والمنشطة مع Nigerian juris.

يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول دور الجسيم الالتهابي NLRP3 في استجابة الخلايا الشجرية البشرية للربيطات الاصطناعية. كما يمكن تطبيقها على أنظمة أخرى مصممة لاختبار المحفزات الفسيولوجية مثل البكتيريا والفيروسات وأمراض الالتهاب الذاتي. قم بتوزيع 200 µL من الخلايا الشجرية المشتقة من الوحيدات المنعزلة حديثاً في حالتها الساكنة في طبق ذو قاع مستدير مكون من 96 بئراً.

ابدأ بالشروط القياسية الأربعة وهي: التحكم السلبي غير المحفز، والتحفيز الأولي فقط، والتنشيط فقط، والتحفيز الأولي المتبوع بالتنشيط. ثم وفقاً للتصميم التجريبي، قم بتضمين ضوابط المخفف لـ R 8 48 وnissin من أجل اختبارات صبغ السيتوكينات داخل الخلايا اللاحقة، وقم بتضمين مكررات لضوابط النوع المناعي (isotype controls) لتحفيز الجسيم الالتهابي. أضف R 8 48 بتركيز نهائي قدره 10 micromolar إلى الآبار المناسبة.

ضع الخلايا في حاضنة عند 37 °C و5% CO2 لمدة 18 ساعة. بعد ذلك، ولتنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3، أضف nige بتركيز نهائي قدره 20 µM. أعد المزارع إلى الحاضنة لمدة ست ساعات إضافية، ولحصد العينات، قم بطرد مركزي لصفيحة المزرعة عند 974 ×g لمدة ثلاث دقائق دون تحريك كتل الخلايا.

انقل كل سائل طافٍ إلى طبق منفصل ذي قاع مستدير لقياس إفراز السيتوكينات بواسطة EISA. الآن، اغسل الرواسب الخلوية ثلاث مرات باستخدام 200 µL من XPBS لإزالة أي IL-1β خارج خلوي من العينات الخلوية لإجراء تحليلات إضافية باستخدام تقنيات متنوعة؛ وللكشف عن pro-IL-1β بواسطة western blot، قم بتحليل الخلايا مباشرة في 10 µL من منظم التحلل المسخ (denaturing lysis buffer). بعد نقل نواتج التحلل إلى أنابيب eppendorf سعة 1.5 mL، قم بتسخين العينات لمدة 10 دقائق عند 100 °C من أجل الكشف الفلوري عن IL-1β بواسطة قياس التدفق الخلوي (flow cytometry).

أضف 100 µL من وسط 5%PHS إلى العينات الخلوية وميكرولتر واحد من الأجسام المضادة الموصومة فلورياً لعلامات النمط الظاهري أو الضابط متماثل النوع (isotype control)، ثم حضن العينات لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد غسل العينات ثلاث مرات بمحلول PBS، قم بتثبيت الخلايا باستخدام 100 µL من 4%PFA لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام. بعد ذلك، أضف 100 µL من محلول النفاذية (permeable buffer) لمدة 30 دقيقة، يليه 62 ng من الجسم المضاد anti IL one beta FSE أو الضابط متماثل النوع، ثم حضن العينات لمدة ساعتين عند 37 °C.

اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 200 µL من المنظم النفوذ وأعد تعليقها في كمية واحدة من XPBS. غلف العينات بورق الألمنيوم واحفظها عند درجة حرارة 4 °C. في حالة الكشف عن IL-1β عن طريق المجهر، صبغ الخلايا بـ DAPI، ثم أضف وسط التركيب وضع شريحة غطاء برفق فوق شريحة زجاجية.

اترك العينة لتجف طوال الليل قبل التقاط صور مجهرية للكشف الفلوري بواسطة قياس التدفق الخلوي. قم بجمع البيانات عينة تلو الأخرى. اضبط بوابات التشتت الأمامي والجانبي على الخلايا الحية، ثم اضبط البوابة التالية على الخلايا الموجبة لـ CD 11 C والسالبة لـ CD 14.

أخيراً، قم بتحليل تعداد خلايا MODC بناءً على صبغ pro IL one beta في مرحلة الحصول على بيانات المجهر. حدد وقت التعرض باستخدام العينة المعالجة R 8 48 ذات الصبغ الإيجابي. ثم حدد النسبة المئوية لخلايا MO dcs التي تعبر عن pro IL one beta للكشف عنها بواسطة لطخة ويسترن.

قم بتحميل الحجم الكلي للعينة على هلام بولي أكريلاميد. يتم التشغيل بجهد 140 فولت حتى تخرج جبهة الصبغ من الهلام. انقل البروتين من هلام بولي أكريلاميد إلى غشاء A-P-V-D-F immo on FL.

قم بحجب الغشاء باستخدام 5%BSA في محلول TBST لمدة ساعة واحدة. حضّن الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية مع الرج عند درجة حرارة أربع درجات مئوية طوال الليل. بعد إجراء ثلاث غسلات بمحلول TBST لمدة خمس دقائق لكل غسلة، حضّن الغشاء مع الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة، وبعد ثلاث غسلات أخرى بمحلول TBST، قم بتصوير الغشاء. عند قياس السيتوكينات المفرزة بواسطة ELI SA، قم بموازنة العينات في درجة حرارة الغرفة.

قم بتدوير العينات لترسيب تكثيف السائل الطافي، واتبع تعليمات الشركة المصنعة لقياس صبغ السيتوكينات داخل الخلايا لـ IL one beta؛ حيث يسمح وجود pro IL one beta بإجراء الفحوصات المجهرية وقراءات التدفق الخلوي للخلايا التغصنية المشتقة من الخلايا الوحيدة والموجبة لـ CD 11 C والسالبة لـ CD 14. يمكن قياس كلتا التقنيتين بالنسبة لخلية ضابطة غير محفزة أو في حالة راحة، بالإضافة إلى ضابط النمط الإيزوتيبي. يتم ضرب النسبة المئوية للخلايا المصبوغة بـ pro IL one beta في الوسيط الهندسي لهذه المجموعة للحصول على متوسط شدة الفلورة.

تعتبر شدة التألق المتوسطة (MFI) قابلة للمقارنة مع كمية pro IL one beta الموجودة في الخلايا ذات الصبغ الإيجابي. هنا، تُستخدم تقنيات اللطخة المناعية (Immuno blotting) لقياس pro IL one beta من محللات الخلايا. ويتم التعبير عن البيانات الكمية بالنسبة لضابط خلوي داخلي مثل beta tubulin كما هو متوقع.

يكشف التحليل المناعي (Immuno blotting) لبروتين pro IL one beta في الخلايا المعالجة بـ NI Nigerian عن انخفاض في مستويات pro IL one beta. ويعزز ذلك زيادة متزامنة في مستويات IL one beta في السوائل الطافية، والتي تم قياسها بواسطة E ELI a only an R 8 48، تلتها ظروف NI Nigerian. ويضمن القياس المتزامن للسيتوكينات الالتهابية الأخرى مثل T NF alpha وIL 10 وIL six أن Niger محدد في تحفيز إفراز IL one beta.

يعتمد مستوى التحفيز الأولي على الوقت والجرعة. ومن شأن إجراء تجارب إضافية، مثل قياس تركيز البروتين خارج الخلوي، أو الكشف عن التألق الكيميائي الناتج عن توليد IL-1β الناضج، أو تثبيط الجسيم الالتهابي، أن يساعد في تحديد ما إذا كان IL-1β خارج الخلوي هو الشكل المقتطع الناضج، وما إذا كان إفراز IL-1β يعتمد على نشاط الجسيم الالتهابي NLRP3.