استخدام تسمية خالية أجهزة الاستشعار البصرية لكشف التحوير من قنوات البوتاسيوم التي كتبها G-بروتين المستقبلات اقترن

الهدف العام من التجربة التالية هو الكشف عن تعديل المستقبلات المقترنة بالبروتين G بواسطة قنوات البوتاسيوم، وذلك باستخدام مستشعرات حيوية بصرية تعتمد على تدرج الطول الموجي للرنين بدون وسم لتحقيق ذلك؛ حيث يتم وضع خلايا HEK 2 93 وخلايا HEK 2 93 التي تعبر بشكل مستقر عن قناة البوتاسيوم المنشطة بالصوديوم في الجرذ slack B على لوحة مستشعرات حيوية بصرية مكونة من 384 بئراً وتُترك لتحضن طوال الليل. بعد ذلك، يتم إجراء قياس أساسي للكتلة بالقرب من الغشاء البلازمي، وتُضاف منشطات المستقبلات المقترنة بالبروتين G الداخلية أو GPCRs. وكخطوة نهائية، يتم قياس التغير في الإشارة الناتج عن تنشيط GPCR وحساب تعديل قناة البوتاسيوم لهذه الاستجابة.

وفي نهاية المطاف، يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجالات العلوم العصبية وإشارات الخلايا من خلال القياس الكمي لآليات الإشارات بين المستقبلات المقترنة ببروتين G وقنوات البوتاسيوم. وتتمثل المزايا الرئيسية لاستخدام هذه التقنية مقارنة بالطرق الموجودة حالياً لدراسة التفاعلات بين القنوات والبروتينات، مثل مقايسات الترسيب والـ CO، في إمكانية إجراء المقايسة باستخدام خلايا حية. كما أنها لا تتطلب استخدام واسمات خارجية، والتي قد تؤدي إلى تغيير بنية البروتين المتفاعل.

وفي الختام، يمكنك تتبع التفاعلات في الوقت الفعلي داخل الخلايا الحية. ورغم أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية ثاقبة حول الإشارات المتبادلة بين GPCRs وقنوات البوتاسيوم، إلا أنه يمكن استخدامها أيضاً لدراسة الاستجابات الخلوية الناتجة عن التغيرات التي يحفزها الليجند في التصاق الخلايا وانتشارها، والسمية، والتكاثر، والهجرة، وأي تغيرات في مدى قرب الغشاء البلازمي من المستشعر الحيوي البصري.

تتمتع هذه التقنية أيضاً بالقدرة على الاستخدام في اكتشاف مناهج علاجية جديدة للأمراض الناتجة عن تشوهات في القنوات الأيونية أو المستقبلات، مثل العديد من اعتلالات القنوات، وذلك لإمكانية استخدامها كطريقة ذات إنتاجية عالية لاختبار تأثيرات العوامل الفارماكولوجية على بروتين القناة. تفاعلات البروتين. لقد خطرت لنا فكرة استخدام هذه الطريقة لأول مرة عندما أدركنا ضرورة تطوير مقايسة يمكنها فحص تفاعلات بروتين القناة في الخلايا الحية.

ابدأ عملية طلاء لوحة المستشعر الحيوي البصري ذات 384 بئرًا عن طريق ترطيب لوحة ثاني أكسيد التيتانيوم بإضافة 20 µL من الماء المعقم المخصص للمزارع النسيجية لكل بئر لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، استخدم ماصة ذات 16 قناة لغسل اللوحة مرة واحدة باستخدام 50 µL من المحلول الملحي المنظم بالفوسفات (PBS) لكل بئر.

بعد ذلك، أضف 20 µL من محلول عمل الفيبرونكتين المُحضّر إلى كل بئر قبل التحضين لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة لإنشاء المصفوفة خارج الخلوية أو ECM بعد التحضين. اغسل اللوحة مرة واحدة باستخدام 50 µL من PBS لكل بئر، ثم أضف 40 µL من محلول عمل الأوفالبومين المُحضّر إلى كل منها.

يتم تحضين الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C لحجب الطبق بعد ارتباط الألبومين البيضي. يُغسل الطبق ثلاث مرات باستخدام 50 µL من PBS لكل بئر. يمكن تخزين الأطباق المغطاة بـ ECM عند درجة حرارة 4 °C لمدة تصل إلى 48 ساعة.

قم بإزالة وسط النمو من كل من خلايا HEK 2 93 غير المستأصلة وخلايا HEK 2 93 التي تعبر بشكل مستقر عن slack B والتي تم استزراعها كما هو موضح في البروتوكول النصي. ثم أضف tripsin لفصل الخلايا عن الطبق. قم بجمع الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي عند 1000 ×g لمدة دقيقة واحدة.

قم بإزالة وسط التربسين وأعد تعليق الخلايا في وسط النمو. وباستخدام مقياس كرات الدم أو عداد خلايا آلي، حدد تركيز الخلايا، ولتقليل آثار التبخر أثناء الحضن، قم بتخفيف الخلايا للوصول إلى العدد المطلوب من الخلايا لكل بئر. في هذه التجارب، يتم استخدام حجم 50 µL من وسط النمو ليكون العدد 1000 خلية لكل بئر.

تم توزيع الخلايا على المستشعر الحيوي عن طريق نقل 50 µL من الخلايا المخففة إلى كل بئر، ثم تُترك الخلايا المستقرة لتحضن طوال الليل في وسط نمو عند 37 °C و5% CO2. ولتجهيز مقايسة المستشعر الحيوي البصري بنظام تدرج الطول الموجي للرنين (RWG)، يتم إزالة وسط النمو من الخلايا بعد انتهاء فترة التحضين.

اغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول هانك الملح المتوازن (Hank's balanced salt solution)، ثم أضف 25 µL من المحلول إلى كل بئر. ضع لوحة المستشعر الحيوي على الماسح الضوئي للارتباط، واترك الخلايا لتتوازن مع درجة حرارة الغرفة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين. وفي هذه الأثناء، قم بتحضير لوحة مركبات منفصلة تُضاف منها الربيطات (ligands) المطلوبة إلى لوحة المستشعر الحيوي أثناء المقايسة.

بالنسبة لهذه المقايسات، تمت إضافة 25 ميكرولتر من المحلول الذي يحتوي على المركب إلى كل بئر في لوحة المستشعر الحيوي ليصل الحجم الإجمالي إلى 50 ميكرولتر. ولإجراء مقايسة المستشعر الحيوي البصري القائم على موجة السطح الموجهة (RWG)، يتم أخذ قياس خط الأساس باستخدام نظام المسح للأبئر من A 1 إلى P 12، والتي تمثل نصف لوحة الـ 384 بئراً، مع استخدام دقة قصوى تبلغ 3.75 ميكرون لكل بكسل للمنطقة المركزية التي تبلغ 1.5 مليمتر من كل بئر باستخدام برنامج bind scan؛ وتستغرق عملية مسح خط الأساس هذه حوالي 30 دقيقة.

ثم أضف 25 µL من محاليل المركبات إلى كل بئر من الآبار A 1 إلى P 12. بعد ذلك، قم بأخذ قياس خط الأساس للآبار A 13 إلى P 24. وعقب قياس خط الأساس لهذه الآبار، أضف 25 µL من محاليل المركبات إلى كل بئر من الآبار A 13 إلى P 24.

كخطوة أخيرة، قم بأخذ قياس ما بعد إضافة المركب للآبار من A1 إلى P12، وكرر العملية للآبار من A13 إلى P24. ولتحليل بيانات المقايسة، افتح بيانات مقايسة الربط الخاصة بقياس الخط القاعدي في النوافذ، وانقر فوق زر محرر الشبكة لتمكين تحديد الخلايا. سيقوم البرنامج بحساب المقاييس ذات الصلة التي حددها المستخدم؛ لذا افتح الملحقات، والتي تتضمن أداة تحديد الخلايا (cell finder) ومعايير الخط القاعدي أو مجموعة الوظائف في أداة تحديد الخلايا بحيث يمكن تمييز الخلايا عن خلفية المستشعر الحيوي.

قم بتصدير ملف خريطة الخلايا، الذي يحتوي على بيانات محدد الخلايا لقياس الخط الأساسي. كرر هذه الخطوات لبيانات ما بعد إضافة المركب. بعد ذلك، افتح الخط الأساسي أو الملحَق البرمجي وقم باستيراد خريطة الخلايا من قياس الخط الأساسي.

سيقوم البرنامج بحساب الإزاحة في قيمة طول الموجة للقمة أو PWV بين بيانات الخلفية والبيانات بعد إضافة المركب. اختر "delta cell mean" لاستخراج متوسط الإزاحة في PWV للخلايا. يمكن بعد ذلك تصدير البيانات إلى برنامج Microsoft Excel لإجراء مزيد من التحليل.

تم توزيع خلايا HEK 2 93 التي تم نقل جين Slack b إليها بشكل مستقر، وخلايا HEK 2 93 ضابطة غير منقولة، بكثافة 1000 خلية لكل بئر على ألواح مستشعر RWG الحيوية ذات الـ 384 بئراً والمطلية بـ ECM، ثم تم إنشاء خرائط تدرج كثافة الكتلة قبل إضافة المركب وبعد 30 دقيقة من إضافته باستخدام bind scan.

تمثل مناطق البرمجيات الموضحة باللون الأحمر البكسلات التي تم تحديدها على أنها تنتمي إلى الخلايا، بينما تميز الخطوط الصفراء الخلايا عن خلفية الطبقة الرمادية. تم استخدام برنامج bind view لتحديد الإزاحة في PWV عند إضافة ناهض GPCR عن طريق طرح PWV بعد إضافة المركب من PWV الأساسي. ويظهر ذلك من خلال تدرج لوني حيث يمثل اللون الأحمر إزاحة إيجابية في قيمة طول الموجة الذروية، ويمثل اللون الأزرق عدم وجود تغيير.

تم تطبيق مستقبل M1 المسكاريني الداخلي ضد الكارباكول على كل من خلايا HEK 2 93 الضابطة غير المنقحة وخلايا HEK 2 93 التي تعبر بشكل مستقر عن slack B، وأدى ذلك إلى زيادة إيجابية في قيمة طول الموجة الذروية مقارنة بالخلايا الضابطة. وأظهرت الخلايا المنقولة بـ slack B زيادة أكبر في قيمة طول الموجة الذروية. كما أظهر S-F-L-L-R NH two, tri fluoro acetate salt وببتيد خماسي منشط لمستقبل الثرومبين الطرفي، والذي يظهر نشاطاً مؤثراً ضد مستقبل GPCR البروتياز المنشط واحد الداخلي، استجابات متفاوتة في الخلايا غير المنقحة والخلايا المنقولة بـ slack B.

تظهر هذه النتائج أن وجود قناة Slack B يزيد بشكل ملحوظ من الإزاحة في PWV التي تحدث عند تنشيط G PCR الداخلي في خلايا he K، كما تثبت جدوى استخدام هذا المقايسة لدراسة تفاعلات بروتينات القنوات. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير وإجراء مقايسة مستشعر حيوي بصري خالية من الوسوم. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن تنفيذها على مدار يومين إذا تم تحضير الخلايا والكواشف بعناية أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء.

من المهم تذكر أن معايير المقايسة، مثل عدد الخلايا المقرر استزراعها، ووقت تحضين الربيطات، وما إلى ذلك، يجب تحسينها لتناسب خطوط الخلايا المختلفة. وبمجرد تنفيذ هذا الإجراء، يمكنك استخدام طرق أخرى مثل لغة R والذكاء الاصطناعي لمحاولة تحديد البروتينات المحددة المطلوبة للتغيير الملحوظ في الإشارة. ولا تنسَ أن العمل مع المزارع الخلوية البشرية يمكن أن يكون خطيراً للغاية، لذا يجب دائماً اتخاذ الاحتياطات اللازمة، مثل العمل داخل غطاء السلامة البيولوجية أثناء تنفيذ هذا الإجراء.