A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس كمية ارتباط الببتيدات القصيرة مع البروتينات المناعية البشرية MHC two باستخدام مقايسة ذات إنتاجية عالية في أطباق تحتوي على 384 بئراً. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إجراء مقايسات ارتباط تنافسية في الطور السائل باستخدام الببتيدات المستهدفة. وفي الخطوة الثانية، يتم التقاط معقدات الببتيد وMHC two المتوازنة باستخدام جسم مضاد anti MHC two مثبت على أطباق ELISA عالية الارتباط.

بعد ذلك، يتم تحضين المعقدات المُلتقطة مع الستربتافيدين المسمى بـ opium، ثم يُغسل الستربتافيدين غير المرتبط، ويتم تنشيط opium المُلتقط. وفي النهاية، يمكن استخدام قياس الفلورية المعتمد على الزمن لتقدير مستويات MHC two من الببتيد الضابط المُلتقط. ويمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى أولية حول القدرة المناعية للبروتينات المستهدفة.

تعتبر هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص للتحقق من صحة مخرجات أدوات التنبؤ الحاسوبية (in silico). ابدأ الإجراء بإضافة 25 µL من محلول الأجسام المضادة L 2 43 المخفف حديثاً إلى كل بئر من آبار لوحة ELISA بيضاء عالية الارتباط ذات 384 بئراً، ثم أغلق اللوحة بفيلم من البوليستر واتركها للحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C. بعد ذلك، ابدأ باستخدام محلول مخزون بتركيز 10 mM من كل مادة اختبار.

قم بإعداد سلسلة التخفيفات التالية للببتيد و DMSO ومحلول منظم سترات الفوسفات باستخدام 3 أطباق بولي بروبيلين تحتوي على 84 بئراً. لاحظ أن طبق بولي بروبيلين كاملاً يحتوي على 84 بئراً يتطلب ثلاثة أطباق EIA منفصلة كما هو موضح. بعد ذلك، قم بتخفيف المحاليل الأصلية المختارة من MHC two إلى تركيز 101 nano molar في محلول منظم للتفاعل باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter.

بعد ذلك، يتم تخفيف الببتيد الضابط من 20 micromolar بنسبة 1 إلى 100 في المزيج الرئيسي MHC two المُحضّر حديثاً، ثم يُضاف 21.5 microliters من المزيج الرئيسي MHC two مع الببتيد الضابط إلى بئر الضابط الموجب في لوح البولي بروبيلين ذو 384 بئراً. أضف المزيج الرئيسي MHC two المحتوي على الببتيد الضابط إلى كل تخفيف من الببتيدات المختبرة بنسبة 1 إلى 1 لإنشاء تفاعل الارتباط في هذا الوقت أيضاً. أخيراً، يتم إغلاق تفاعل الارتباط بغشاء بوليستر وتحضين اللوح لمدة تتراوح من 12 إلى 24 ساعة في حاضنة غير مضبوطة لثاني أكسيد الكربون عند 37 degrees Celsius دون هز.

في اليوم التالي، يتم تخفيف آبار تفاعل الارتباط في طبق 384 بئر بنسبة واحد إلى واحد باستخدام محلول منظم التعادل. بعد ذلك، تُغسل صفيحة Eliza ثلاث مرات باستخدام 60 µL لكل بئر من PBS 0.05%، ثم يُنقل 25 µL من كل محلول تفاعل ارتباط مُعادل من طبق 384 بئر، في ثلاث مكررات، إلى طبق 384 بئر المغلف بالأجسام المضادة.

قم بتغطية طبق ELISA ثم حضنه مغطىً بفيلم بوليستر عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل. بعد الحضن، اغسل طبق ELISA ثلاث مرات كما تم توضيحه للتو، ثم أضف 25 µL من streptavidin المخفف حديثاً إلى كل بئر. حضن الطبق مغطىً بفيلم بوليستر في الظلام عند درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.

أثناء فترة التحضين، يتم ترك 10 milliliters من محلول التعزيز لكل لوحة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة في الظلام أيضاً. بعد مرور ساعة واحدة، اغسل لوحة ELIZA كما هو موضح، ثم أضف 25 microliters من محلول التعزيز إلى كل بئر وحضن اللوحة مغطاة بفيلم البوليستر لمدة تتراوح من 10 إلى 15 minutes في الظلام. وأخيراً، اقرأ الفلورة باستخدام قارئ ألواح فلوري ذي دقة زمنية وفق إعدادات opium. في هذه التجربة النموذجية، تم تحليل تسلسل ببتيدي ناضج لإنزيم enterobacter Cloe P nine nine beta-lactamase للبحث عن روابط ببتيدية مفترضة بـ MHC two allele.

تم تحديد ببتيدات DRB 1*15:01 117 غير مرتبطة بوجود بقايا مرساة P1 إلزامية في الموضع 1، وهي ضرورية للارتباط بـ MHC class II عند عتبة 5% فقط. ومن المرجح أن تكون الببتيدات التي تبلغ درجاتها 2.6 أو أكثر هي ببتيدات مرتبطة. وبناءً على ذلك، عند عتبة 5% فقط، يُتوقع أن ترتبط أفضل 11 ببتيد بـ MHC class II DRB 1*15:01.

تم اختيار مجموعة ممثلة من الإبيثوبات المتوقعة لتحليلها في مقايسة الارتباط بـ MHC two هذه. تم تخليق شظايا ببتيدية من بيتا-لاكتاماز مكونة من هذه الـ 15 حمضاً أمينياً كيميائياً بحيث تكون إبيثوبات MHC two التساعية المفترضة مدمجة ضمن شظايا البروتين الاصطناعية. بعد ذلك، تم تحليل قدرة هذه الببتيدات الاصطناعية على التنافس مع ببتيد MBP B كنترول المبيوتن على الارتباط بـ MHC two DRB 1 15 0 1 كما تم توضيحه للتو.

تظهر هنا منحنيات الارتباط التنافسي للببتيدات الاصطناعية. تم حساب قيم IC 50 عن طريق مطابقة البيانات المحولة لوغاريتمياً باستخدام دالة الملاءمة غير الخطية للارتباط التنافسي بموقع واحد في برنامج prism. وكما هو موضح في الجدول وفي الرسم البياني، انقسمت الببتيدات طبيعياً إلى ثلاث مجموعات: ارتباطات قوية بقيمة IC 50 أقل من 1 µM، وارتباطات متوسطة بقيمة IC 50 أكبر من أو تساوي 1 µM ولكنها أقل من 100 µM، وارتباطات ضعيفة بقيمة IC 50 أكبر من أو تساوي 100 µM بعد تطويرها.

لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات المناعة الجزيئية وتصميم العلاجات البيولوجية لاستكشاف أحداث التعرف الجزيئي الرئيسية التي تكمن وراء الاستجابات المناعية المضادة للبروتينات لدى المرضى من البشر بشكل أكثر شمولاً.