A تجليد الفحص إنتاجية عالية MHC II لتحليل الكمي لالببتيد الحواتم
مارس 25, 2014
يمكن فحوصات البيوكيميائية مع المؤتلف الإنسان جزيئات MHC II تقديم سريع، رؤى الكمي في تحديد حاتمة المناعية، الحذف، أو التصميم. هنا، يوصف مقايسة ملزمة الببتيد-MHC II تحجيم لوحات 384 جيدا. هذا الشكل فعالة من حيث التكلفة يجب أن تكون مفيدة في مجالات deimmunization البروتين وتصميم لقاح والتنمية.
الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد ارتباط الببتيدات القصيرة ب معقد التوافق النسيجي الكبير البشري ، واثنين من البروتينات المناعية باستخدام مقايسة لوحة البئر 3 84 عالية الإنتاجية. يتم تحقيق ذلك من خلال إجراء فحوصات ملزمة لمنافسة مرحلة الحل الأولى مع الببتيدات ذات الاهتمام. في الخطوة الثانية ، يتم التقاط معقدين من الببتيد المعقد الكبير المتوازن بجسم مضاد لمعقد التوافق النسيجي الكبير تم تجميدهما على ألواح ELIZA عالية الارتباط.
بعد ذلك ، يتم تحضين المجمعات التي تم التقاطها بالأفيون المسمى ستربتافيدين ثم يتم غسل الستربتافيدين غير المرتبط ويتم تنشيط الأفيون الملتقط. في النهاية ، يمكن استخدام القياس الفلوري الذي تم حله بالوقت لتحديد مستويات معقد التوافق النسيجي الكبير اثنين من ببتيد التحكم الملتقط. يمكن أن توفر هذه الطريقة رؤى أولية حول الإمكانات المناعية للبروتينات المستهدفة.
إنه مفيد بشكل خاص للتحقق من صحة ناتج في تنبؤات السيليكو ، ابدأ الإجراء بإضافة 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة L 2 43 المخفف حديثا إلى كل بئر من 3 84. حسنا ، صفيحة ELIZA بيضاء عالية الربط أغلقت اللوحة بغشاء بوليستر واحتضانها طوال الليل عند أربع درجات مئوية. ثم ابدأ بمخزون 10 مللي مولار لكل اختبار.
يصنع الببتيد و DMSO سلسلة التخفيف التالية ومخزن فوسفات السترات باستخدام 3 84 ألواح بولي بروبيلين جيدة. لاحظ أن لوحة البولي بروبلين الكاملة 3 84 جيدا تتطلب ثلاث لوحات EIA منفصلة كما هو موضح. بعد ذلك ، قم بتخفيف محلولي مخزون معقد التوافق النسيجي الكبير المحددين إلى تركيز 101 نانو مولار في المخزن المؤقت للتفاعل باستخدام أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.
ثم قم بتخفيف ببتيد التحكم من 20 ميكرومولار إلى نسبة واحد إلى 100 في مزيج MHC اثنين من المزيج الرئيسي المحضر حديثا وأضف 21.5 ميكرولتر من مزيج معقد التوافق النسيجي الكبير مع ببتيد التحكم إلى التحكم الإيجابي. حسنا من لوحة البولي بروبيلين 3 84 بئر ، أضف مزيج معقد التوافق النسيجي الكبير الاثنين الذي يحتوي على ببتيد التحكم إلى كل من تخفيفات ببتيد الاختبار بنسبة واحد إلى واحد لإنشاء تفاعل الربط في هذا الوقت أيضا. أخيرا ، قم بإغلاق تفاعل الربط بغشاء بوليستر واحتضان اللوحة لمدة 12 إلى 24 ساعة في حاضنة يتم التحكم فيها بثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية دون اهتزاز.
في اليوم التالي ، قم بتخفيف آبار تفاعل الربط في 3 84. لوحة البئر بنسبة واحد إلى واحد مع عازلة تحييد. ثم اغسل لوحة Eliza ثلاث مرات ب 60 ميكرولتر لكل بئر من PBS 0.05٪ بين 20 النقل التالي ، 25 ميكرولترا من كل محلول تفاعل ربط محايد من لوحة البئر 3 84 في ثلاث نسخ إلى الجسم المضاد المطلي 3 84.
حسنا ، تقوم لوحة Eliza بعد ذلك باحتضان لوحة ELIZA المغطاة بغشاء بوليستر عند أربع درجات مئوية طوال الليل بعد الحضانة. اغسل طبق ELIZA ثلاث مرات كما هو موضح للتو ، ثم أضف 25 ميكرولترا من الأفيون العقدي المخفف حديثا إلى كل منها. احتضان اللوحة المغطاة بغشاء بوليستر في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
أثناء الحضانة ، أحضر 10 مل من محلول التحسين لكل طبق إلى درجة حرارة الغرفة أيضا في الظلام بعد ساعة واحدة ، واغسل لوحة ELIZA كما هو موضح ، ثم أضف 25 ميكرولترا من محلول التحسين لكل بئر واحتضان اللوحة المغطاة بغشاء بوليستر لمدة 10 إلى 15 دقيقة في الظلام. أخيرا ، اقرأ التألق باستخدام قارئ لوحة الفلورسنت الذي تم حله بمرور الوقت مع إعدادات الأفيون. في هذه التجربة التمثيلية ، تم تحليل تسلسل الببتيد الناضج من البكتيريا المعوية Cloe P تسعة تسعة بيتا لاكتاماز بحثا عن روابط الببتيد المفترضة لأليل معقد التوافق النسيجي الكبير ثنائي.
تم تحديد DRB واحد خمسة عشر أوه مائة وسبعة عشر غير أو ببتيدات مع بقايا مرساة إلزامية P واحدة في الموضع الأول المطلوب لمعقد التوافق النسيجي الكبير الثاني عند عتبة 5٪ فقط. من المحتمل أن تكون الببتيدات ذات الدرجات أكبر من أو تساوي 2.6 هي مواد مرتبطة. وبالتالي ، عند عتبة 5٪ ، من المتوقع أن تربط أعلى 11 ببتيدا فقط معقد التوافق النسيجي الكبير اثنين DRB 1 15 0 1.
تم اختيار لجنة تمثيلية من الحلقات المتوقعة للتحليل في هذا الاختبار المعقد النسيجي الكبير اثنين ملزمة. تم تصنيع شظايا ببتيد بيتا لاكتاماز من هذه البقايا ال 15 كيميائيا بحيث تم تضمين اثنين من حواتم معقد التوافق النسيجي الكبير المفترضة داخل شظايا البروتين الاصطناعية. ثم تم تحليل قدرة هذه الببتيدات الاصطناعية على التنافس مع ببتيد التحكم في بروتين المايلين الأساسي البيوتينيل للارتباط ب MHC two DRB 1 15 0 1 كما هو موضح للتو.
يتمتوضيح منحنيات الربط التنافسية للببتيدات الاصطناعية هنا. تم حساب قيم IC 50 عن طريق تركيب بيانات تحويل السجل باستخدام وظيفة الملاءمة غير الخطية للربط التنافسي في موقع واحد للمنشور. كما هو موضح في الجدول كما هو موضح في الرسم البياني ، تم تقسيم الببتيدات بشكل طبيعي إلى ثلاث مجموعات ، مواد رابطة قوية مع IC 50 أقل من واحد ميكرومولار مواد رابطة معتدلة مع IC 50 أكبر من أو يساوي ميكرومولار واحد ، ولكن أقل من 100 ميكرومولار ومواد رابطة ضعيفة مع IC 50 أكبر من أو يساوي 100 ميكرومولار بعد تطوره.
مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجالات المناعة الجزيئية وتصميم العلاج الحيوي لاستكشاف أحداث التعرف الجزيئي الرئيسية التي تكمن وراء الاستجابات المناعية المضادة للبروتين لدى المرضى من البشر.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تصف هذه المقالة اختبارًا عالي الإنتاجية لربط الببتيد-MHC II باستخدام ألواح 384 بئرًا لتحديد الكمية لربط الببتيدات القصيرة ببروتينات MHC II البشرية. يهدف هذا الأسلوب إلى توفير رؤى سريعة في تحديد المواقع المناعية المسببة للمناعة وهو مفيد بشكل خاص في إزالة المناعة للبروتين وتطوير اللقاحات.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم المناعة
- تطوير اللقاحات
- الاختبارات الكيميائية الحيوية
الخلفية
- تلعب جزيئات MHC II البشرية دورًا حاسمًا في الاستجابة المناعية.
- تحديد المواقع المناعية المسببة للمناعة ضروري لتصميم اللقاح.
- يمكن للاختبارات عالية الإنتاجية تسريع عملية البحث.
- هناك حاجة إلى أساليب فعالة من حيث التكلفة في مجال المناعة.
هدف الدراسة
- لتحديد الكمية لربط الببتيد ببروتينات MHC II.
- لتسهيل تحديد المواقع المناعية المسببة للمناعة.
- لدعم جهود تصميم وتطوير اللقاح.
الأساليب المستخدمة
- اختبارات تنافسية في مرحلة المحلول مع الببتيدات.
- التقاط مجمعات الببتيد-MHC II باستخدام الأجسام المضادة المضادة لـ MHC II.
- الحضانة مع ستربتافيدين مسمى بالأفيون.
- التحديد الكمي باستخدام مقياس التألق الزمني.
النتائج الرئيسية
- يوفر الاختبار بيانات كمية حول ربط الببتيد-MHC II.
- يسمح بتقييم الإمكانات المناعية للببتيدات.
- الأسلوب قابل للتوسيع وفعال من حيث التكلفة.
- يمكن أن تفيد النتائج في استراتيجيات تطوير اللقاح المستقبلية.
الاستنتاجات
- يعد الاختبار الموصوف أداة قيمة للبحث المناعي.
- يعزز الفهم للتفاعلات بين الببتيد وMHC.
- يمكن أن يؤدي هذا الأسلوب إلى تقدم في تصميم اللقاحات.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
High throughput MHC II binding assays enable rapid, quantitative evaluation of peptide immunogenicity, directly supporting early-stage deimmunization and vaccine design workflows. By scaling to a 384-well format and automating liquid handling, this method increases throughput and reproducibility while reducing reagent costs, facilitating robust target validation and portfolio triage. The approach empowers R&D teams to efficiently interrogate epitope candidates and prioritize leads with greater predictive confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables quantitative interrogation of peptide-MHC II interactions for immunogenicity risk assessment.
- Supports functional validation of in silico epitope predictions, reducing mechanistic ambiguity.
- Facilitates rapid triage of candidate peptides for deimmunization or vaccine development pipelines.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, reproducible binding data across multiple peptides and MHC II alleles in parallel.
- Prepares validated biological systems for downstream immunogenicity screening and optimization.
- Enables scalable, high-throughput evaluation of peptide libraries with quantitative IC50 outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns peptide selection with translational immunogenicity risk by quantifying binding thresholds relevant to human MHC II alleles.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by providing robust, quantitative binding data.
- De-risks candidate advancement by stratifying peptides into strong, moderate, and weak binders based on IC50 values.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging in silico prediction, experimental validation, and translational risk assessment for immunogenicity.
- Discovery Biology: Provides quantitative binding data to test immunogenicity hypotheses and clarify epitope risk.
- Screening: Offers reproducible, high-throughput assay readiness for peptide library evaluation.
- Analytics: Generates IC50 values and binding curves to enable direct comparison of peptide candidates.
- Translational Research: Aligns peptide selection with human-relevant MHC II allele binding profiles.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized platform for ongoing immunogenicity assessment across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in epitope selection and reduces late-stage immunogenicity risk.
- Operational Value: Improves assay throughput, reproducibility, and cost efficiency via automation and miniaturization.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions and portfolio prioritization based on quantitative immunogenicity metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement and de-prioritization of high-risk candidates early in development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunology, peptide chemistry, and quantitative assay development.
- Needs access to liquid handling robotics, 384-well ELISA infrastructure, and time-resolved fluorescence plate readers.
- Demands rigorous cross-team standardization of assay protocols and data analysis workflows.
- May require adaptation for different MHC II alleles or peptide chemistries depending on program needs.
- Throughput and scalability are limited by available instrumentation and reagent supply.
![مكتبة الببتيد المتداخلة لتعيين سؤال وجواب-1 [ابيتوبس] في بروتين](/_next/image?url=https%3A%2F%2Fcloudfront.jove.com%2FCDNSource%2Fteasers%2F56401.jpg%3Fv%3D2026-08-11T08%253A27%253A19.297Z&w=384&q=75)
