ثلاثة الثقافات الأبعاد: أداة لدراسة الهندسة المعمارية عادي عنيبية مقابل التحول السرطاني للخلايا الثدي

الهدف العام من هذا الإجراء هو استخدام نظام الثقافة ثلاثي الأبعاد كوسيلة لتمييز النمط الظاهري الحميد للثدي عن النمط الظاهري الخبيث للثدي. يتم تحقيق ذلك عن طريق طلاء الخلايا الضابطة والتجريبية أولا في ثلاث نسخ على طبقة من عامل النمو المتراجعة في شريحة غرفة من ثمانية آبار. الخطوة الثانية هي إعطاء تغييرات وسائط كاملة جديدة مع 2٪ GFR Matrigel كل أربعة أيام ، مما يسمح للمستعمرات الشبيهة بالأسينين بالنمو لمدة 10 إلى 15 يوما.

بعد ذلك ، يتم الحصول على صور تباين الطور للمستعمرات مثل الآسر المزروعة في 3D بدقة خمسة ×. تتمثل الخطوة الأخيرة في معالجة الثقافات الشبيهة بالآسر للتحليل الكيميائي المناعي مع العلامات الجزيئية ذات الصلة ، متبوعة بالحصول على صور متحدة البؤر في C اثنين من المستعمرات المناعية مثل المستعمرات في القسم. في النهاية ، يتم استخدام تباين الطور والصور متحد البؤر للخلايا المزروعة في ثقافة ثلاثية الأبعاد لتحديد التغيرات المظهرية والجزيئية الخلوية وبالتالي التمييز بين خلايا الثدي الحميدة والخلايا الخبيثة.

الميزة الرئيسية لهذه التقنية على الأساليب الحالية مثل الثقافات ثنائية الأبعاد أو فحوصات الغزو أو الهجرة ، هي أنها يمكن أن تلخص بنية أنسجة الثدي الحميد وفقدانه التنظيم أثناء التحول الخبيث. وبالتالي ، يمكن استخدام هذه التقنية بشكل فعال للتمييز بين خلايا الثدي الحميدة وخلايا الثدي الخبيثة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال سرطان الثدي ، مثل خلل في مسارات الإشارات على النمط الظاهري للخلية ، وفي تحديد مسارات جديدة للورم و / أو الورم.

لبدء التجربة ، انخفض عامل النمو ذوبان الجليد أو معدل نمو GFR عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها. بعد ذلك ، قم بتسخين وسائط HME الكاملة عند 37 درجة مئوية وضع شريحة من ثماني غرف آبار على الجليد لتبرد. أضف 40 ميكرولترا من GFR Matrigel إلى وسط كل بئر من الشريحة المبردة مسبقا.

انشر الجل بالتساوي قدر الإمكان باستخدام طرف ماصة P 200، وتجنب الفقاعات والانتشار المفرط، مما قد يؤدي إلى تكوين الغضروف المفصلي. ثم قم بترسيخ هلام ماتري عن طريق احتضان الشريحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون بينما يقوم هلام ماتري بترسيخ عيون التربسين ، وخلايا HME ، ثم جمعها في أنبوب سعة 15 مليلتر وتدوير الخلايا بمقدار 150 مرة من الجاذبية لمدة أربع دقائق ، عد الخلايا وتخفيفها إلى 12 ، 500 خلية لكل مليلتر. في الوسائط الكاملة ، أضف GFR matrigel إلى تعليق الخلية بتركيز نهائي قدره 2٪ وأضف 400 ميكرولتر من المحلول إلى كل بئر من شريحة الغرفة المشفرة مسبقا.

ثم ضع الشريحة في حاضنة CO2 مخزنة. استبدل الوسائط بوسائط كاملة جديدة كل أربعة أيام لمدة 15 يوما. بالنسبة لدراسات المثبطات ، أضف مثبطات جزيئات صغيرة إلى الوسائط الكاملة في وقت الطلاء ، متبوعة بتغييرات جديدة في الوسائط مكملة بالمثبطات كل ثلاثة أيام لبدء خلايا النمو وثلاث نسخ لكل مجموعة علاج.

التقط صورا تباين الطور لهياكل aser من كل بئر بدقة خمسة x باستخدام مجهر تباين الطور المتصل بناقل حركة منزلق وجهاز كمبيوتر. التقط الصور عن طريق تحريك الشريحة من إطار إلى آخر ، وتغطية البئر بالكامل للشريحة ذات الغرفة على نطاق واسع. احسب العدد الإجمالي لهياكل aser ، وعدد أسينين المسطح الدائري الواحد ، وعدد الهياكل متعددة الآسير أو الهياكل المتنامية بشكل عشوائي التي تفتقر إلى التنظيم.

ومع عمليات التفرع المنبعثة ، احسب النسبة المئوية لهياكل aser المسطحة المستديرة الواحدة مقابل الهياكل الخبيثة وارسم المعلومات. كرسم بياني عمودي. احسب الأهمية من خلال اختبار T للطالب غير المزاوج ثنائي الذيل.

قم بإعداد الكواشف لتلوين التألق المناعي كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد ذلك، استخدم ماصة P 200 لشفط الوسائط المكيفة بعناية. ثم قم بإصلاح ASIN أو الهياكل باستخدام 2٪ بارا فورمالديهايد المحضر حديثا في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة بعد التثبيت ، وقم بتنفيض الخلايا بنسبة 0.5٪ tritton X 100 لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

ثم اغسل المزارع ثلاث مرات باستخدام 100 ملم جلايسين لمدة 10 إلى 15 دقيقة لكل غسلة. بعد ذلك ، قم بحظر الخلايا في المخزن المؤقت للكتلة الأولية لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضان الثقافات في 20 ميكروغراما لكل مليلتر من الماعز المضادة للفأر فاب جزءين في المخزن المؤقت للكتلة الأولية ، ويسمى أيضا حل الحجب الثاني لمدة 30 دقيقة لمنع أنواع الفأر الأمينية IgG في matrigel.

بعد الحظر ، احتضان الخلايا بالجسم المضاد الأولي في محلول الحجب الثاني طوال الليل عند أربع درجات مئوية. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام عازلة التألق المناعي أو أقوم بالتخزين المؤقت بهزاز لطيف لمدة 10 إلى 15 دقيقة لكل غسلة. ثم احتضان الخلايا بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة الفلورية في المخزن المؤقت F لمدة 45 دقيقة.

بعد ذلك ، اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها مع المخزن المؤقت للحرف F والهزاز اللطيف. قم بتركيب الشرائح باستخدام DPI الذي يحتوي على كاشف مضاد للتلاشي لتصور النوى. اترك الشرائح تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.

ثم احصل على صور متحدة البؤر في القسم الأوسط للمستعمرة من الخلايا التي تنمو أعلى matrigel وسلسلة من الأقسام البصرية على طول هيكل asner بالكامل عن طريق z تكديس الصور متحدة البؤر ل DPI الملطخة ب HME التي يتم التحكم فيها و C CN ست خلايا ضربة قاضية في اليوم الخامس تظهر أن الخلايا بالضربة القاضية تفتقر إلى التنظيم. في اليوم 15 ، تصبح خلايا التحكم متوقفة عن النمو مع ASIN أو الهياكل المتمايزة والتجويف المحدد جيدا المتباعد عن الخلايا المقلدة ، والتي تقدم نمطا ظاهريا متفرعا وأنبوبيا غازيا. يظهر تلطيخ الفلورسنت المناعي فقدان التعبير عن اللامينين الخامس ألفا ستة إنتجرين وإيكاس هيرين مما يشير إلى اضطراب الغشاء القاعدي وفقدان القطبية القاعدية وملامسة الخلايا الخلوية على التوالي.

في الخلايا الخبيثة ، تعرض خلايا التحكم طبقة سليمة حول التعبير القاعدي الآسيني للتعبير القمي ألفا ستة إنتجرين من GM one 30 و eca. هنا عند تقاطع خلية الخلية ، تم عكس النمط الظاهري الخبيث لخلايا CCN الست ضربة قاضية HME من خلال المعالجة الخارجية لستة بروتين CCN البشري المؤتلف المنقى ، وهما خطان من خلايا الثدي النقيلية للغاية ، حوالي 1 49 و M-D-A-M-B 2 31. عولجت بمثبطات كيناز خريطة P 38 ، SB 2 0 3 8 50 ، و SB 2 0 2 1 90 ، مما قلل من السلوك الخبيث.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية زراعة خلايا الثدي في ثقافة ثلاثية الأبعاد واستخدام النمو الشبيه بالسينو بشكل فعال على matrigel كقراءة للتمييز بين الأنماط الظاهرية لخلايا الثدي الحميدة والخبيثة.