إعادة بناء 3 الأبعاد حجم الأنسجة وتطبيقاتها لدراسة ماوس الغدد الثديية

الهدف العام من الفيديو التالي هو عرض منهجية لتسجيل الصور في علم الأنسجة ثلاثي الأبعاد، وإعادة بناء الحجم لدراسة التغيرات في البنية الكلية للخلايا الثديية. ولتحقيق ذلك، يتم استئصال الغدد الثديية من الفئران بعد ثلاثة أيام من بدء الرضاعة في الفئران من النوع البري والفئران التي تفتقر إلى البروتين الرابط لعامل النمو الشبيه بالإنسولين 7 (IGF BP seven null mice). ثم تُعالج الغدد وتُطمر في قوالب البارافين من أجل تقطيعها إلى شرائح.

بعد ذلك، يتم التقاط صور للوجه البصري لكتل الأنسجة ثم يتم تقطيع كتلة الأنسجة. تُلتقط صور للمقاطع، وباستخدام برنامج مخصص، يتم محاذاة كل مقطع مع صورة وجه الكتلة المقابلة له لإعادة بناء الحجم النسيجي للغدة الثديية. وتسلط البيانات الناتجة الضوء على الاختلافات في الحجم بين الغدد في النوع الطافر والنوع البري.

تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل المجهر البؤري ثنائي الطي ثلاثي الأبعاد، في أنها توفر معلومات على نطاق مكاني أوسع بكثير. كما يمكن استخدام هذه الطريقة لاستقصاء والتحقق من صحة التقنيات والخوارزميات الجديدة في التصوير الطبي الحجمي والعلاجات، بالإضافة إلى إنشاء تحليل ثلاثي الأبعاد عالي الدقة لأعضاء مختلفة. ويقدم هذا الحجم النسيجي المعاد بناؤه تمثيلاً موثوقاً للعينة المعالجة دون حدوث خطأ تراكمي في التسجيل.

جاءتنا الفكرة الأولى لهذه الطريقة عندما لاحظنا أن الفئران التي تفتقر إلى IGF P seven تعاني من صغر حجم البطن وغير قادرة على الحفاظ على بطون متعددة وكبيرة، لذا قررنا استقصاء بنية الغدد الثديية لديها. بمجرد تضمين النسيج في البارافين، استخدم ميكروتوم دوار لقص الكتلة حتى يتم إزالة البارافين الزائد. بعد ذلك، وباستخدام آلة تفريز عمودية، قم بحفر ثقوب بقطر one millimeter في زاويتين على الأقل من كتلة البارافين بشكل عمودي على حامل الكاسيت، ثم قم بتثبيت كتلة النسيج على الميكروتوم الدوار.

لإعداد نظام تصوير وجه القالب أمام الميكروتوم، ضع كاميرا مزودة بعدسة تليفوتو بزاوية مائلة قليلاً من سطح قالب النسيج. يجب أن تكون الكاميرا متصلة بجهاز كمبيوتر أمام الميكروتوم. ثم ضع مصدر ضوء أمام القالب بحيث تلتقط الكاميرا انعكاس الضوء عن القالب.

قم بتعديل زاوية الكاميرا حتى يصبح النسيج الموجود على سطح القالب متميزاً بوضوح عن البارافين المحيط به. التقط صورة واحدة لوجه القالب الضوئي. بعد ذلك، استخدم الميكروتوم لقطع شرائط مكونة من أربعة مقاطع، بسمك 5 microns.

انقل الشرائط إلى حمام مائي بارد، وافصل مقاطع الشريط، ثم اغرف المقطعين الثاني والرابع من الماء البارد وضعهما على شريحة. انقلهما إلى حمام مائي دافئ للتخلص من التجاعيد. يتيح اختيار المقطعين الثاني والرابع وجود فجوة بمقدار five micron بين المقاطع.

بمجرد إزالة التجاعيد، أعد تثبيت المقاطع على شرائح المجهر عن طريق الغرف. وكما سبق، لاحظ أن عمليات القطع والتثبيت وإزالة التجاعيد من المقاطع قد تسبب بعض التشوهات، مثل التمزقات والطيات والانكماش والتمدد. وتؤدي هذه الشوائب الاصطناعية إلى تعقيد عملية مطابقة مقاطع الأنسجة.

قم بصبغ المقاطع بـ h و d باستخدام صابغة أوتوماتيكية. بعد ذلك، قم بتغطية الشرائح باستخدام جهاز تغطية أوتوماتيكي، وباستخدام ماسح ضوئي رقمي لشرائح الأنسجة، قم برقمنة الشرائح بدقة الوضوح المطلوبة. بالنسبة لهذا البروتوكول، يكون التكبير 20 x ودقة الوضوح 0.47 microns.

يقدم هذا القسم من الفيديو نظرة عامة على عملية تسجيل الصور، والتي تم إنجازها باستخدام برنامج مخصص تم تطويره في مختبرنا بالاشتراك مع MATLAB c plus plus. باستخدام ITK، ابدأ بتقليل عينة صور الأنسجة لتصل إلى دقة صور وجه الكتلة. سيؤدي ذلك إلى تصغير صور الأنسجة بمعامل قدره 0.026.

بعد ذلك، ولأغراض تقسيم الصور واختيار النقاط، افتح صورتين من صور وجوه الكتل في برنامج MATLAB واستخدم أداة مؤشر البيانات لقياس قيم البكسل لثقوب التسجيل. استخدم متوسط قيمة البكسل كعتبة ثابتة لتقسيم ثقوب التسجيل. ولإزالة الأجزاء الزائدة، استخدم الدائرية ومساحة الأجسام المقسمة للإبقاء على الثقوب وإزالة الأجزاء الزائدة.

بعد ذلك، اختر صورة واحدة لوجه القالب كمرجع لكل غدة ثديية. قم بمحاذاة مراكز ثقوب التسجيل في بقية صور وجوه القوالب مع مراكز ثقوب التسجيل في الصورة المرجعية. ثم باستخدام التحويلات التي تم الحصول عليها لثقوب التسجيل، قم بمحاذاة صور وجوه القوالب، ثم قم بتجزئة أو استخلاص الأنسجة يدويًا من الخلفية لصور وجوه القوالب المحاذات في المقاطع h و d.

استخدم تقنية عتبة أوتسو (OSU thresholding) لتقسيم الصور عن الخلفية وإنشاء أقنعة ثنائية لصور الأنسجة. بعد ذلك، وباستخدام المدرج التكراري للأجسام المحددة، حدد واختر الجسم الأكبر حجماً في كل قناع. استخرج نقاط الحدود بعرض بكسل واحد من كل من أقنعة الأنسجة وأقنعة وجه الكتلة.

بعد ذلك، استخدم خوارزمية واصفات فوريه (Fourier descriptors) لإيجاد التحويل الصلب الأولي بين نقاط حدود الصور النسيجية وصور وجه القالب المقابلة لها. يتضمن هذا التحويل الأولي عوامل الإزاحة والدوران والمقياس. قم بتحويل كل صورة نسيجية باستخدام التحويل الأولي الذي تم الحصول عليه من الخطوة السابقة.

لتحسين التسجيل الصلب، قم بإزالة أقسام الحواف ذات الانحناء العالي من محيط النسيج باستخدام مرشح الكرة المتدحرجة (rolling ball filter). بعد ذلك، اختر 500 نقطة عشوائياً من نقاط حدود النسيج المتبقية باستخدام توزيع منتظم. قم بتحويل نقاط حدود النسيج باستخدام التحويل الأولي الذي تم الحصول عليه من واصفات فورييه (Fourier descriptors).

استخدم نقاط حدود وجه الكتلة، وطبق خوارزمية النقاط الأقرب التكرارية (iterative closest points) لإيجاد التحويل الصلب بين نقاط حدود وجه الكتلة وعينات الأنسجة. نقاط حدود عشوائية. ثم قم بتحويل صور الأنسجة التي تم الحصول عليها من الخطوة السابقة لإنشاء صورة مرئية لحجم الأنسجة في برنامج التصور ثلاثي الأبعاد.

من قائمة المختبر (lab)، اختر الوحدات (modules)، ثم الملفات المتنوعة (miscellaneous)، وأضف وحدة "تركيب ثلاثي الأبعاد من ملفات ثنائية الأبعاد" (composed 3D from 2D files). بعد ذلك، اختر "صورة" (image) من القائمة وأضف وحدة "تحويل خصائص الصورة" (image property convert). وأخيراً، أضف وحدة "عرض ثلاثي الأبعاد" (view 3D) من وحدات "عرض التصورات ثلاثية الأبعاد" (visualization 3D viewers).

انقر نقراً مزدوجاً على "compose 3D from 2D files" لتحميل الصور، ثم انقر على "create 3D". اضبط حجم الفوكسل (voxel size) بالنقر نقراً مزدوجاً على "image property convert"، وقم بتعيين حجم الفوكسل على 0.018 0.018 0.01. استعرض الحجم بالنقر نقراً مزدوجاً على "view 3D".

أخيرًا، قم بعرض مجموعة الصور عند تكبير 5x باتباع الخطوات الموضحة في المستند المرفق. ولتوصيف أفضل للنقص في الفئران التي تفتقر لبروتين I-G-F-B-P seven، تم إجراء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد للغدد الثديية كما هو موضح هنا. وتظهر هذه الأشكال أحجام الأنسجة المعاد بناؤها للغدد الثديية في النوع البري والفئران التي تفتقر للبروتين.

لاحظ أن الغدة الطافرة على اليمين أقصر وأضيق من النوع البري على اليسار، ولكنها تملك نفس العمق تقريباً، حيث يبلغ عمق غدة النوع البري 1.06 millimeters وعمق الغدة الفارغة 1.02 millimeters. كما يُلاحظ أن غدد النوع البري على اليسار تحتوي على القليل من النسيج السدوي الذي يشير إليه صبغ الإيوسين الوردي، بينما تبدو الغدد الفارغة على اليمين مكونة بشكل أساسي من نسيج سدوي. وهنا يوضح صبغ الهيماتوكسيلين، الذي يحدد الخلايا ذات النواة، أن الغدة الفارغة تحافظ على كثافتها بينما يبدو أن غدة النوع البري تحتوي أساساً على بنيات غدية.

ولمزيد من الاستقصاء حول ذلك، تم هنا محاذاة صور ذات دقة أعلى لمنطقة العقدة الليمفاوية. وتظهر في الصور تراكيب كبيرة كان من المفترض أن تكون ممتلئة بالحليب. وفي المقابل، تظهر الغدة التي تفتقر إلى IGFBP7 بضع تراكيب متطورة جيداً.

علاوة على ذلك، تزدحم هذه البُنى بخلايا تشبه الخلايا الليفية. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء إعادة بناء ثلاثية الأبعاد لعضو ما من خلال إعادة بناء المقاطع المتسلسلة للمسح الضوئي. جيد. الآن، أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تسمية الشرائح والمسوحات بشكل متسق نظراً لوجود عدد كبير من كليهما، حيث أن التنظيم التسلسلي هو مفتاح النجاح عند اتباع هذا الإجراء.

يمكن إجراء طرق أخرى مثل الكيمياء النسيجية المناعية لعلامات خلوية ومرضية محددة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية، مثل: كيف تتغلغل الأوعية الدموية في الورم؟